響應(yīng)面耦合遺傳算法優(yōu)化超聲-酶輔助提取金銀花綠原酸工藝及其抗氧化活性研究

谷 紅，尹本林，袁建全，裴云逸

（1.玉溪農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，云南 玉溪653100；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，云南 昆明650205）

金銀花（Lonicera japonicaThunb.）又稱為金花、雙花和銀花，為忍冬科忍冬屬。金銀花提取物中含有黃酮類、三萜類、有機(jī)酸類、環(huán)烯醚萜類、糖類和醇類等活性成分[1]。其中綠原酸和黃酮類化合物是金銀花中最重要的活性成分。大量研究結(jié)果表明：金銀花綠原酸具有較好的抗氧化活性，同時(shí)具有較強(qiáng)的藥理活性，對(duì)消化系統(tǒng)、血液系統(tǒng)及生殖系統(tǒng)等方面的疾病具有顯著的治療效果[2-3]。金銀花中活性成分的提取是金銀花產(chǎn)業(yè)中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，也是制約金銀花發(fā)展的瓶頸，因此尋找綠色高效的提取技術(shù)是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。

超聲提取是一種新型的物理提取技術(shù)，超聲所產(chǎn)生的“空化效應(yīng)”、“機(jī)械效應(yīng)”和“熱效應(yīng)”加速了植物細(xì)胞壁的破裂，降低活性成分的傳遞阻力，從而顯著提高活性成分得率[4-5]。植物細(xì)胞壁主要成分為纖維素和果膠，通過利用纖維素酶和果膠酶來水解植物細(xì)胞壁，可以顯著降低活性成分由內(nèi)向外的傳質(zhì)阻力，促進(jìn)活性成分的提取分離[6]。因此，利用超聲-酶輔助提取金銀花綠原酸是一種新穎的提取技術(shù)，目前在金銀花綠原酸提取中還未見報(bào)道。此外，影響金銀花綠原酸提取率的因素有溶劑性質(zhì)、萃取溫度、萃取時(shí)間、固液比和超聲功率等。因此，優(yōu)化金銀花綠原酸的提取條件是提高金銀花綠原酸提取率的關(guān)鍵。響應(yīng)面法（Response surface methodology,RSM）是一種數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)方法，常被應(yīng)用于提取工藝優(yōu)化，但RSM對(duì)試驗(yàn)點(diǎn)的選擇有很高的要求，試驗(yàn)點(diǎn)選取不當(dāng)，很難得到理想的優(yōu)化結(jié)果[7]。遺傳算法（Genetic algorithms,GA）具有全局尋優(yōu)的特點(diǎn)，能取得較好的預(yù)測(cè)和優(yōu)化效果。將RSM與GA相結(jié)合，既能避免RSM的缺陷，又能充分發(fā)揮GA在全局優(yōu)化中的優(yōu)勢(shì)。因此，本試驗(yàn)采用該組合方法來對(duì)金銀花綠原酸的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)探究該提取條件下獲得的金銀花綠原酸提取物的抗氧化活性。本文通過超聲-酶輔助提取法對(duì)金銀花綠原酸進(jìn)行提取，進(jìn)而探究超聲功率、提取時(shí)間、提取溫度、果膠酶添加量和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)金銀花綠原酸提取率的影響，并通過RSM耦合GA來優(yōu)化其提取工藝，最后探究金銀花綠原酸提取物的體外抗氧化活性。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

金銀花，采于河南封丘；綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品（≥98%），張家界久瑞生物科技有限公司；果膠酶（6.0×105U/g），合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；DPPH，酷爾化學(xué)科技（北京）有限公司；過硫酸鉀和乙酸鈉，上海金錦樂實(shí)業(yè)有限公司；水楊酸和雙氧水，上海澄紹生物科技有限公司；乙醇（分析純），常州市啟迪化工有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

HJ911-8P超聲波提取儀，上海達(dá)洛科學(xué)儀器有限公司；LGJ-20G冷凍干燥機(jī)，四環(huán)福瑞科儀科技發(fā)展（北京）有限公司；RX-Z005旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，建湖瑞祥玻璃制品有限公司；UV759紫外可見分光光度計(jì)，青島聚創(chuàng)環(huán)保集團(tuán)有限公司；JIDI-20D臺(tái)式高速離心機(jī)，廣州吉迪儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理

金銀花經(jīng)除雜，冷凍干燥處理，并利用植物粉碎機(jī)將其粉粹，過40目篩，制得金銀花粉末，密封避光保存于4℃冰箱中備用。

1.2.2 超聲-酶輔助提取綠原酸

稱取5.0 g金銀花粉末置于具塞三角瓶中，按照1∶30（g/mL）的料液比加入不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，用玻璃棒攪拌使其充分混合，然后加入不同添加量的果膠酶，將其置于超聲波提取儀中，通過儀器控制面板，設(shè)置超聲時(shí)間和超聲溫度，待提取結(jié)束后，將提取物置于離心機(jī)中以7 000 r/min離心15 min，真空抽濾獲得濾液，殘?jiān)貜?fù)上述操作，合并濾液。將部分濾液用蒸餾水定容至100 mL容量瓶中，用于測(cè)定不同提取條件下綠原酸的提取率。此外，取另一部分濾液置于40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，真空冷凍干燥，制得綠原酸提取物。

1.2.3 綠原酸提取率測(cè)定

1.2.3.1 金銀花中綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

準(zhǔn)確稱取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品0.005 g，加入少量體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇溶液，使標(biāo)準(zhǔn)品充分溶解，隨后將其定容于100 mL容量瓶中。然后從中分別取出1、2、3、4、5、6 mL溶液，置25 mL容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇定容至刻度，在波長(zhǎng)327 nm處測(cè)各樣品吸光度。以吸光度作為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度作為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性擬合，其標(biāo)準(zhǔn)方程為：y=0.031 87x-0.012 72（R2=0.999 3）。

1.2.3.2 金銀花中綠原酸含量計(jì)算

依據(jù)“1.2.2”步驟對(duì)金銀花中綠原酸進(jìn)行提取，將提取液定容至250 mL容量瓶中，從中移取2 mL溶液定容至50 mL容量瓶中。在波長(zhǎng)327 nm處，測(cè)定其吸光度，將吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)方程中，計(jì)算得出樣品中綠原酸濃度，然后將其樣品中綠原酸濃度代入方程（1）中，即可計(jì)算得出綠原酸提取率（Y）。

式中：C為樣品溶液濃度，mg/mL；V為溶液體積，mL；

n為稀釋倍數(shù)；m為金銀花粉末的質(zhì)量，g。

1.2.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇超聲-酶輔助提取法提取金銀花綠原酸，操作步驟同“1.2.2”。稱取5 g金銀花粉末，分別從超聲功率、提取時(shí)間、提取溫度、果膠酶添加量和乙醇體積分?jǐn)?shù)5個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，討論試驗(yàn)因素對(duì)樣品綠原酸提取率的影響。超聲功率分別為100、150、200*、250、300 W；提取時(shí)間分別為10、20、30*、40、50 min；提取溫度分別為30、35、40*、45、50℃；果膠酶添加量分別為0.10%、0.15%、0.20%*、0.25%和0.30%；乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為40%、50%、60%*、70%和80%。每組試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。其中：“*”表示當(dāng)考察其他因素對(duì)綠原酸提取率影響時(shí)，用“*”標(biāo)記的因素保持恒定水平。

1.2.5 響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本研究選擇試驗(yàn)自變量分別為超聲功率（X1）、提取溫度（X2）、果膠酶添加量（X3）和乙醇體積分?jǐn)?shù)（X4），同時(shí)選取綠原酸提取率（Y）為響應(yīng)值。利用Design Expert 8.0軟件設(shè)計(jì)Box-Behnken組合試驗(yàn)，本研究的試驗(yàn)因素與水平如表1所示。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of experimental design

采用響應(yīng)面分析法得到的二次回歸模型，如式（2）所示：

式中：b0為截距回歸系數(shù)；bi為線性回歸系數(shù)；bii為二次項(xiàng)的回歸系數(shù)；bij為交互項(xiàng)的回歸系數(shù)；Xi、Xj為自變量。

1.2.6 遺傳算法設(shè)計(jì)

GA是一種基于自然遺傳和選擇機(jī)制的隨機(jī)非線性優(yōu)化算法。采用RSM模型作為遺傳算法的適應(yīng)度函數(shù)，對(duì)綠原酸提取率的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。選擇高斯變異函數(shù)為每個(gè)向量條目添加一個(gè)隨機(jī)數(shù)，在原始得分的基礎(chǔ)上，采用秩-量函數(shù)對(duì)個(gè)體進(jìn)行擬合。優(yōu)化過程中選擇隨機(jī)均勻函數(shù)和分散交叉函數(shù)，采用Matlab R2018b版遺傳算法工具箱進(jìn)行優(yōu)化研究。目標(biāo)函數(shù)如式（3）所示。

式中：f（x）是從RSM模型得到的目標(biāo)函數(shù)；x是輸入向量；y是綠原酸提取率，%；XiL和XiU分別是Xi的下邊界和上邊界。

1.2.7 抗氧化活性的測(cè)定

1.2.7.1 ABTS+自由基清除能力的測(cè)定

參照Liang等[9]的方法并略作改動(dòng)。分別將金銀花綠原酸提取物配制成質(zhì)量濃度為1、3、5、7、9、11 mg/mL的樣品溶液。將7.0 mmol/L ABTS與終濃度為2.45 mmol/L過硫酸鉀充分混合，在25℃條件下，避光靜置12 h。利用pH為4.5的乙酸鈉溶液稀釋至波長(zhǎng)734 m處的吸光度為0.7±0.02。取3 mL上述溶液與20 mL樣品溶液混合，靜置6 min，在波長(zhǎng)734 nm處測(cè)定每個(gè)樣品的吸光度，以VC為對(duì)照，依據(jù)式（4）計(jì)算ABTS+自由基的清除率。

式中：Ac為對(duì)照品的吸光度；As為樣品的吸光度。

1.2.7.2 羥基自由基清除能力的測(cè)定

參照Wu等[10]的方法并略作改動(dòng)。分別將金銀花綠原酸提取物配制成質(zhì)量濃度為1、3、5、7、9、11 mg/mL的樣品溶液。分別取1 mL上述不同濃度的樣品溶液于20 mL具塞玻璃瓶中，依次加入1 mL 7.0 mmol/L FeSO4溶液和1 mL 6.0 mmol/L H2O2溶液，混合均勻，靜置10 min，然后加入1 mL 6.0 mmol/L水楊酸溶液，充分混合，靜置30 min后，在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定每個(gè)樣品的吸光度。以乙醇溶液代替待測(cè)液作空白，測(cè)定吸光度，以VC為對(duì)照，依據(jù)式（5）計(jì)算羥基自由基清除率。

式中：A0為無水楊酸時(shí)樣品液的吸光度；A1為對(duì)照品的吸光度；A為空白對(duì)照的吸光度。

1.2.8數(shù)據(jù)處理

本研究所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，試驗(yàn)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；采用Statistics 8.0軟件和Origin 9.0軟件分別對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析和作圖；利用Design Expertver 8.0軟件和Matlab R 2018b軟件分別對(duì)組合試驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)和提取工藝優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲功率對(duì)綠原酸提取率的影響

由圖1可知，當(dāng)超聲功率在100～200 W范圍內(nèi)，隨超聲功率的增加，綠原酸提取率呈顯著升高趨勢(shì)（P＜0.05）。其原因是隨超聲功率增加，超聲“空化效應(yīng)”增強(qiáng)，傳質(zhì)阻力降低，擴(kuò)散系數(shù)增加，有利于綠原酸溶出[11]。當(dāng)超聲功率超過200 W，繼續(xù)增加超聲功率，綠原酸提取率呈顯著降低的趨勢(shì)（P＜0.05）。其原因是較大的超聲功率可能會(huì)破壞綠原酸結(jié)構(gòu)，同時(shí)也會(huì)提高雜質(zhì)在萃取溶劑中的溶解度，故造成綠原酸提取率降低[12]。綜合考慮，本試驗(yàn)選擇超聲功率為100、150、200 W進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

圖1 超聲功率對(duì)綠原酸提取率的影響Fig.1 Effects of ultrasonic powers on extraction rates of chlorogenic acid

2.2 提取時(shí)間對(duì)綠原酸提取率的影響

由圖2可知，當(dāng)提取時(shí)間在10～30 min范圍內(nèi)，隨提取時(shí)間延長(zhǎng)，綠原酸提取率顯著升高（P＜0.05）。這歸因于在提取初期，金銀花顆粒細(xì)胞內(nèi)外綠原酸濃度存在較大差異，促進(jìn)綠原酸由內(nèi)向外擴(kuò)散，從而提高綠原酸提取率[11]。當(dāng)提取時(shí)間超過30 min時(shí)，隨提取時(shí)間延長(zhǎng)，綠原酸提取率無顯著變化。這是因?yàn)楫?dāng)提取時(shí)間超過30 min時(shí)，絕大多數(shù)綠原酸被提取出來，因此，延長(zhǎng)萃取時(shí)間對(duì)綠原酸提取率無顯著變化。綜合考慮，本試驗(yàn)選擇提取時(shí)間為30 min。

圖2 提取時(shí)間對(duì)綠原酸提取率的影響Fig.2 Effects of extraction time on extraction rates of chlorogenic acid

2.3 提取溫度對(duì)綠原酸提取率的影響

由圖3可知，隨著提取溫度的升高，綠原酸提取率呈現(xiàn)先顯著升高后顯著下降的趨勢(shì)（P＜0.05）。當(dāng)提取溫度為35℃時(shí)，綠原酸提取率取最大，為11.63%±0.24%。其原因是隨著提取溫度的升高，一方面增加果膠酶催化活性，有助于破壞植物細(xì)胞壁，降低綠原酸傳質(zhì)阻力；另一方面溫度升高提高了綠原酸的溶解度和擴(kuò)散系數(shù)，從而有利于綠原酸的提取[13]。但當(dāng)提取溫度過高時(shí)，高溫一方面降低或滅活果膠酶活性；此外高溫破壞綠原酸結(jié)構(gòu)，從而降低綠原酸提取率[14]。綜合考慮，本試驗(yàn)選擇提取溫度為30、35、40℃進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

圖3 提取溫度對(duì)綠原酸提取率的影響Fig.3 Effects of extraction temperatures on extraction rates of chlorogenic acid

2.4 果膠酶添加量對(duì)綠原酸提取率的影響

由圖4可知，當(dāng)果膠酶添加量在0.10%～0.20%時(shí)，隨果膠酶添加量的增加，綠原酸提取率呈現(xiàn)顯著升高的趨勢(shì)（P＜0.05）。其原因是隨果膠酶添加量的增加，單位時(shí)間內(nèi)果膠酶催化能力增強(qiáng)，使得金銀花細(xì)胞壁發(fā)生不同程度的降解，綠原酸傳質(zhì)阻力顯著降低，有利于綠原酸的提取[15]。但當(dāng)果膠酶添加量超過0.20%時(shí)，隨果膠酶添加量的增加，綠原酸提取率顯著降低（P＜0.05）。其原因是果膠酶添加量過高，金銀花細(xì)胞壁破壁越徹底，此時(shí)溶劑會(huì)溶解過多的雜質(zhì)，使得綠原酸溶解度降低，不利于綠原酸提取[16]。綜合考慮，選擇果膠酶添加量0.15%、0.20%、0.25%進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

圖4 果膠酶添加量對(duì)綠原酸提取率的影響Fig.4 Effects of pectinase additions on extraction rates of chlorogenic acid

2.5 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)綠原酸提取率的影響

由圖5可知，當(dāng)乙醇提取分?jǐn)?shù)在40%～60%范圍內(nèi)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，綠原酸提取率呈顯著升高趨勢(shì)（P＜0.05）。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)增加到60%時(shí)，此時(shí)綠原酸提取率取得最大值，為11.37%±0.13%。這歸因于乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，乙醇極性與綠原酸極性相似，故此時(shí)綠原酸溶解度最大，進(jìn)而使提取率取得最大值[11]。但繼續(xù)增加乙醇體積分?jǐn)?shù)，綠原酸提取率呈顯著降低的趨勢(shì)（P＜0.05）。其原因是高濃度乙醇會(huì)溶解醇溶性雜質(zhì)和色素等，從而降低了綠原酸的溶解度，造成提取率降低[17]。綜上考慮，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、60%、70%進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)綠原酸提取率的影響Fig.5 Effects of ethanol volume fractions on extraction rates of chlorogenic acid

2.6 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.6.1 模型建立與顯著性檢驗(yàn)

響應(yīng)面試驗(yàn)方案和結(jié)果如表2所示。對(duì)自變量與響應(yīng)值進(jìn)行多元回歸擬合分析，得到試驗(yàn)因素與響應(yīng)值的回歸模型，該模型如式（6）所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and results

對(duì)模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3所示。

由表3可知，本試驗(yàn)所得回歸模型的R2=0.999 8，F(xiàn)=6 005.45，P＜0.000 1，表明所建的回歸方程極顯著。失擬項(xiàng)P=0.088 1＞0.05，說明回歸模型失擬項(xiàng)不顯著。綜上分析可知，回歸模型擬合充分，模型可靠，進(jìn)一步表明利用該模型可以預(yù)測(cè)不同提取條件下金銀花綠原酸提取率。

利用F值大小可以判斷各因素對(duì)響應(yīng)值的影響程度，F(xiàn)值越大，因素對(duì)響應(yīng)值的影響越顯著。由表3知，F(xiàn)（X1）=3 527.60、F（X2）=4 316.69、F（X3）=1 575.31和F（X4）=2 818.09，即各因素對(duì)金銀花綠原酸提取率的影響順序?yàn)樘崛囟龋╔2）＞超聲功率（X1）＞乙醇體積分?jǐn)?shù)（X4）＞果膠酶添加量（X3），且這4個(gè)因素對(duì)金銀花綠原酸提取率的影響均達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）。

表3 金銀花綠原酸工藝優(yōu)化回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model of chlorogenic acid process optimization of honeysuckle

圖6 反映了各試驗(yàn)因素交互作用對(duì)金銀花綠原酸提取率的影響。由表3方差分析結(jié)果可知，X1X2、X1X3、X1X4、X2X3、X2X4和X3X4的交互作用均對(duì)金銀花綠原酸提取率有極顯著影響（P＜0.01）。由圖6A、6C、6E、6G、6I和6K可知，金銀花綠原酸提取率存在極值點(diǎn)。圖6B、6D、6F、6H、6J和6L均呈現(xiàn)橢圓型，表明X1X2、X1X3、X1X4、X2X3、X2X4和X3X4的交互作用均顯著影響金銀花綠原酸提取率。綜上可知，對(duì)金銀花綠原酸提取率影響因素順序?yàn)樘崛囟龋╔2）＞超聲功率（X1）＞乙醇體積分?jǐn)?shù)（X4）＞果膠酶添加量（X3），該結(jié)果與方差分析的結(jié)果一致。

圖6 各因素交互作用對(duì)綠原酸提取率影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.6 Response surface plots and contour maps showing interaction effects between every two parameters on the extraction rab of chlorogenic acid

2.6.2 綠原酸提取工藝參數(shù)優(yōu)化

采用Matlab R 2018b軟件對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，其結(jié)果如7所示。由圖7可知，當(dāng)運(yùn)算迭代86次，綠原酸提取率取得最大值，此時(shí)試驗(yàn)因素（超聲功率、提取溫度、果膠酶添加量和乙醇體積分?jǐn)?shù)）編碼分別為0.147、-0.124、0.06、0.117，對(duì)應(yīng)的因素水平分別為157.35 W、34.38℃、0.203%和61.17%，此時(shí)綠原酸提取率的理論值為13.07%。

圖7 遺傳算法優(yōu)化結(jié)果Fig.7 The results optimized by genetic algorithm

2.6.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

采用響應(yīng)面耦合遺傳算法優(yōu)化綠原酸提取工藝參數(shù)為：超聲功率157.35 W、提取溫度34.38℃、果膠酶添加量0.203%和乙醇體積分?jǐn)?shù)61.17%，在此條件下，綠原酸提取率的理論值為13.07%?？紤]實(shí)際情況，將上述參數(shù)進(jìn)行修正：超聲功率157 W、提取溫度34℃、果膠酶添加量0.20%和乙醇體積分?jǐn)?shù)61%，在此條件下，綠原酸提取率為12.85%±0.37%，試驗(yàn)值和理論值的相對(duì)誤差為1.68%。表明響應(yīng)面耦合遺傳算法可以較好地模擬和預(yù)測(cè)不同提取條件下的綠原酸提取率。

2.7 抗氧化活性研究

2.7.1 ABTS+自由基清除能力的結(jié)果分析

ABTS經(jīng)過氧化劑氧化后生成性質(zhì)穩(wěn)定的藍(lán)綠色ABTS+自由基，當(dāng)有抗氧化劑加入時(shí)，ABTS+自由基與抗氧化劑發(fā)生反應(yīng)，使得藍(lán)綠色褪色或消失[18]。因此，通過測(cè)定反應(yīng)液吸光度的變化，可以反應(yīng)樣品的抗氧化能力的強(qiáng)弱。由圖8可知，隨金銀花綠原酸提物和VC質(zhì)量濃度的增加，ABTS+自由基清除率顯著增加（P＜0.05），且呈濃度依賴性。對(duì)上述數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析可知，金銀花綠原酸提物和VC對(duì)ABTS+自由基清除率的IC50分別為（6.18±0.07）mg/mL和（8.79±0.05）mg/mL。IC50值越小，說明物質(zhì)的抗氧化活性越強(qiáng)，對(duì)比金銀花綠原酸提物和VC的IC50值可知，金銀花綠原酸提物抗氧化活性顯著高于VC（P＜0.05）。

圖8 金銀花提取物和VC對(duì)ABTS+自由基清除能力的影響Fig.8 Effects of honeysuckle extract and VC on ABTS+radical scavenging ability

2.7.2 羥基自由基清除能力的結(jié)果分析

羥基自由基屬于活性較強(qiáng)的自由基，幾乎可以與細(xì)胞內(nèi)的所有有機(jī)物發(fā)生反應(yīng)，造成DNA和細(xì)胞膜損傷等變化[19]。因此，羥基自由基的清除能力是抗氧化活性評(píng)價(jià)中最重要的指標(biāo)之一。由圖9可知，隨著金銀花綠原酸提取物和VC質(zhì)量濃度的增加，其對(duì)羥基自由基清除率呈顯著上升趨勢(shì)（P＜0.05），且呈濃度依賴性。對(duì)上述數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析可知，金銀花綠原酸提取物和VC對(duì)羥基自由基清除率的IC50值分別為（4.75±0.06）mg/mL和（6.82±0.04）mg/mL。對(duì)比金銀花綠原酸提取物和VC對(duì)羥基自由基清除率的IC50值可知，金銀花綠原酸提物抗氧化能力優(yōu)于VC。結(jié)果進(jìn)一步表明金銀花綠原酸提取物是較好的天然抗氧化劑。

圖9 金銀花提取物和VC對(duì)羥基自由基清除能力的影響Fig.9 Effects of honeysuckle extract and VC on hydroxyl radical scavenging ability

3 結(jié)論

本研究通過響應(yīng)面耦合遺傳算法優(yōu)化超聲-酶輔助提取金銀花綠原酸工藝，得到最優(yōu)工藝參數(shù)為：超聲功率157 W，提取時(shí)間30 min，提取溫度34℃，果膠酶添加量0.20%，乙醇體積分?jǐn)?shù)61%，在此條件下所得綠原酸提取率為12.85%±0.37%。金銀花綠原酸提物對(duì)ABTS+自由基和羥基自由基清除率的IC50值分別為（6.18±0.07）mg/mL和（4.75±0.06）mg/mL。研究結(jié)果為金銀花綠原酸提取提供了綠色可行的方法，同時(shí)為天然抗氧化劑的開發(fā)提供一定的參考借鑒。