胎膜早破患者胎盤組織中ICAM-1與VCAM-1表達水平及臨床意義

朱驪，楊俊娟

（鄭州市婦幼保健院婦產科，河南 鄭州 450000）

胎膜早 破（premature rupture membranes，PROM）定義為分娩前胎膜的破裂，PROM 可以在妊娠37 周或之后或妊娠37 周之前發(fā)生（PPROM或胎膜早破）[1]。在正常情況下，足月妊娠中有8～10%的婦女會經歷PROM，PROM 其發(fā)病率全球范圍為2～10%，中國為9.4～10.4%[2]。PROM 可伴有許多嚴重的致命并發(fā)癥，如驚厥，昏迷，腦出血，胎盤早剝，和彌散性血管內凝血[3]。因此，PROM 是孕婦和圍生兒死亡的主要原因之一。目前，胎盤缺血和氧化應激理論，血管內皮損傷理論，絨毛膜羊膜炎（chorioamnionitis，CAM）理論，免疫理論被認為是PROM的發(fā)病機理[4]。有報道稱，內皮功能障礙可誘導PROM 伴CAM，并可作為未來發(fā)生PROM 伴CAM 事件風險的指標[5]。內皮功能障礙的表型特征包括細胞黏附分子的上調，包括細胞間黏附分子-1（ICAM-1）和血管細胞黏附分子-1（VCAM-1）[6]。已發(fā)現(xiàn)功能性內皮的這些表型改變與屏障功能有關，該屏障功能導致白細胞外滲和繼發(fā)于一氧化氮（NO）等血管擴張劑處理減少的血管平滑肌張力增高[7]。PROM 伴CAM的發(fā)生是通過表達粘附分子誘導的，該粘附分子將炎性單核細胞募集到血管壁中。細胞間單核細胞對內皮的粘附表達增加是導致PROM 伴CAM的跡象之一[8]。由于PROM伴CAM 中內皮功能障礙與炎癥之間的這種聯(lián)系，內皮細胞上發(fā)生的炎癥過程阻斷可能是預防PROM 伴CAM的有益途徑。本研究擬探討PROM患者胎盤組織中ICAM-1與VCAM-1表達水平及臨床意義，為PROM及絨毛膜羊膜炎的診斷及治療提供依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取鄭州市婦幼保健院2017年1月-2019年12 月收治的130例胎膜早破產婦為研究對象（病例組）,根據胎盤病理結果分為伴有絨毛膜羊膜炎組（CAM 組，64例）和無絨毛膜羊膜炎組（非CAM 組，66例）；納入標準：⑴符合胎膜早破及是否合并絨毛膜羊膜炎標準[9]；⑵自然單胎妊娠；⑶剖宮產：胎位異常、骨盆狹窄剖宮產指征。排除標準：⑴孕婦無全身性疾??；⑵胎兒宮內發(fā)育遲緩；⑶妊娠期高血壓、糖尿病等病史。同時選取本院同期健康剖宮產單胎自然妊娠產婦130例為正常對照組。本研究得到了鄭州市婦幼保健院一些倫理委員會的批準，并獲得了患者的知情同意。

1.2 VCAM-1、ICAM-1 mRNA水平測定 Quanti-Tect SYBR Green RT-PCR 試劑盒（Qiagen GmbH）在ABI 7500 快速實時PCR 系統(tǒng)（Applied Biosystems;Thermo Fisher Scientific，Inc）進行實時qPCR分析VCAM-1、ICAM-1 mRNA水平,根據制造商的協(xié)議。PCR 條件如下；94℃下進行1min 變性，在59℃下進行1min 退火，并在72℃下進行1min 延伸32 個循環(huán)，然后在72℃下進行10min。VCAM-1、ICAM-1、GAPDH 由上海生工科技合成，序列如下：VCAM-1 正向引 物：5'-CTCGATCGATCGATGCGCGATCGATCGATCGT-3'，反向引物：5'-CGTGACGATCGATCGATCGATCGAC-3'；ICAM-1 正向引物：5'-CGTAACGTAGCTAGCGATCGATCGATCG-3'，反向引物：5'-CGAGCGAT CGATCGATGGTCGATCGATC-3';GAPDH 正向引 物：5'-CGTAGC TCGATCGCTGCGATCGATCGCTAG-3'，反向引物：5' -CGAGCGTCGATCGATCGAT CGCTAGCT -3'。VCAM-1、ICAM-1 標準化為內部對照GAPDH的含量（-ΔΔCq）。每個樣品進行三次重復分析，并計算平均表達水平。

1.3 VCAM-1、ICAM-1蛋白水平測定 進行鏈霉抗生物素蛋白-生物素-過氧化物酶方法用于免疫組織化學染色。將胎盤組織在室溫下于4%多聚甲醛溶液中固定24h，然后包埋在石蠟中，并準備了連續(xù)切片（厚度為4 μM）。將切片在二甲苯I，II和IIII 溶液中分別進行5min 去石蠟處理，并用梯度的乙醇溶液（分別為100%、95%、75%和50%，分別進行5min）再水化，并使用3 阻斷內源性過氧化物酶的活性。%的過氧化氫15min。使用高壓鍋（100°C）用檸檬酸鈉緩沖液（pH 6.0）進行熱介導的抗原修復對切片進行30min的預處理。通過與10%正常山羊血清（目錄號ab7481,Abcam）溫育15min,可以阻斷非特異性免疫球蛋白的結合。用磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）洗滌后,將玻片與抗VCAM-1（1：200；目錄號ab 124773；Abcam）或ICAM-1（1：200；目錄號ab15580；Abcam）的一抗孵育。在室溫下放置60min，然后在室溫下放置生物素偶聯(lián)的二抗（1：1,000；目錄號ab6720，Abcam），持續(xù)30min。在光學顯微鏡（放大倍數：40）下觀察載玻片。對VCAM-1、ICAM 染色的強度評分如下：0，陰性染色；1，弱陽性；2，中度積極；3，強烈肯定。染色百分比評分如下：0，0%免疫反應性細胞；0，0%免疫反應性細胞；1，免疫反應細胞≤5%；2，5～50%的免疫反應性細胞；3，51-80%的免疫反應細胞；4，>80%的免疫反應性細胞。IHC 分數乘以染色強度百分比。0～4的分數表示“陰性”表達，6～12的分數表示“陽性”表達。

1.4 統(tǒng)計分析 采用SPSS23.0對數據進行錄入、統(tǒng)計學分析。計量資料以均數±標準差()表示，兩組比較采用t 檢驗，多組比較采用單因素方差分析，事后多重比較采用SNK-q 檢驗，采用ROC 曲線評估診斷價值，檢驗水準α 為0.05。

2 結果

2.1 兩組一般情況比較與正常對照組比較，病例組妊娠周數明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而兩組在年齡、BMI、TG、HDL-C、LDL-C 等一般資料比較上差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表1。

表1 兩組一般情況比較

2.2 正常胎盤組織、非CAM 胎盤組織、CAM 胎盤組織中VCAM-1、ICAM-1mRNA水平比較與正常胎盤組織比較,非CAM 胎盤組織、CAM 胎盤組織中VCAM-1、ICAM-1mRNA表達水平明顯升高（P<0.05）；與非CAM 胎盤組織比較、CAM 胎盤組織中VCAM-1、ICAM-1mRNA表達水平明顯升高（P<0.05）。見表2。

表2 正常胎盤組織、非CAM 胎盤組織、CAM胎盤組織中VCAM-1、ICAM-1mRNA 比較

2.3 正常胎盤組織、非CAM 胎盤組織、CAM 胎盤組織中VCAM-1、ICAM-1蛋白比較與正常胎盤組織比較，非CAM 胎盤組織、CAM 胎盤組織中VCAM-1、ICAM-1蛋白表達水平明顯升高（P<0.05）;與非CAM 胎盤組織比較、CAM 胎盤組織中VCAM-1、ICAM-1蛋白表達明顯升高(P<0.05)。見表3。

表3 正常胎盤組織、非CAM 胎盤組織、CAM胎盤組織中VCAM-1、ICAM-1蛋白比較

2.4 正常胎盤組織、非CAM 胎盤組織、CAM 胎盤組織中VCAM-1、ICAM-1蛋白陽性表達率比較與正常胎盤組織比較，非CAM 胎盤組織、CAM 胎盤組織中VCAM-1、ICAM-1蛋白表達陽性率明顯升高（P<0.05）；與非CAM 胎盤組織比較、CAM 胎盤組織中VCAM-1、ICAM-1蛋白表達陽性率明顯升高（P<0.05）。見表4、圖1。

圖1 VCAM-1、ICAM-1在正常胎盤組織、胎膜早破胎盤組織中表達

表4 正常胎盤組織、非CAM 胎盤組織、CAM 胎盤組織中VCAM-1、ICAM-1蛋白陽性表達率比較

2.5 VCAM-1、ICAM-1 mRNA 評估胎膜早破ROC曲線受試者工作特征曲線提示，VCAM-1+ICAM-1 mRNA、VCAM-1 mRNA、ICAM-1 mRNA 評估胎膜早破的ROC 曲線下面積 (AUC) 分別為0.893（95%CI：0.853-0.933）,0.814（95%CI：0.769-0.842）,0.799（95%CI：0.761-0.843）；VCAM-1 mRNA、ICAM-1 mRNA 兩者AUC 相近（P>0.05）,皆小于VCAM-1+ICAM-1 mRNA（P<0.05）；VCAM-1+ICAM-1 診斷胎膜早破伴CAM的靈敏度、特異度相近（P>0.05），皆小于VCAM-1+ICAM-1 mRNA（P<0.05）,見表5、圖2。

表5 VCAM-1、ICAM-1 mRNA 評估胎膜早破ROC 曲線

圖2 VCAM-1、ICAM-1 mRNA 評估胎膜早破ROC 曲線

3 討論

PROM 伴CAM的原因仍然不確定，先前妊娠的PROM 史，生殖道感染，產前出血、吸煙、內皮功能障礙與PROM 伴CAM的發(fā)生密切相關。一項臨床研究發(fā)現(xiàn)，在37.1%的樣本中觀察到PROM 伴CAM 史，此外這37.1%的樣本中約有82%內皮功能障礙患者，這表明PROM 伴CAM的病史、內皮功能障礙是PROM 發(fā)生的危險因素[10]。

PROM 伴CAM 已被證明是一種炎性疾病，氧化應激在其啟動和發(fā)展中起著至關重要的作用。據報道，包括O2、H2O2和血管炎癥在內的ROS 生成增加是內皮功能障礙的關鍵因素。PROM 伴CAM 損傷上調了細胞粘附分子的表達[11]。一項細胞實驗表明，暴露于H2O2的人胎盤血管內皮細胞(PVEC)原代細胞顯示O2-增加，這導致PVEC細胞ICAM-1和VCAM-1 上調[12]。內皮細胞的激活是PROM 伴CAM的早期階段,并且誘導了幾種細胞內信號傳導途徑，導致某些蛋白質（例如CAMs）的上調[13]。研究表明，在PROM 伴CAM的早期，循環(huán)單核細胞（MNC）與EC 結合并遷移到內皮下空間，從而促進EC的激活。在此期間，ICAM-1的表達上調，導致EC 激活和PROM 伴CAM的發(fā)展。白細胞和內皮細胞粘附分子的表達對于白細胞通過炎癥反應的遷移極為重要。PROM 伴CAM 早期發(fā)展過程中炎癥反應的重要性通過粘附分子的未調控表達來表明。隨著使用免疫生化技術的研究的深入，已發(fā)現(xiàn)多種因素與PROM 伴CAM的發(fā)生和發(fā)展有關，例如炎癥、細胞凋亡、氧化應激、巨噬細胞和淋巴細胞。ICAM-1在血管內皮上表達，并與配體結合以促進單核細胞和內皮細胞之間的牢固粘附[14]。ICAM-1 影響炎癥和免疫反應，并且已經與腫瘤細胞和健康細胞的遷移有關[15]。先前的研究得出假設：ICAM-1 也可能通過保護免受免疫應答觸發(fā)的細胞毒性而在PROM 伴CAM 內膜細胞的存活中發(fā)揮作用。此外，ICAM-1 介導淋巴細胞與內皮細胞的粘附，據信可促進淋巴細胞沿內皮細胞向炎癥部位的遷移[16]。作者推測，PROM 伴CAM 內膜細胞缺乏調節(jié)可溶性ICAM-1 釋放所需的機制，從而導致ICAM-1的釋放增加，通過阻斷淋巴細胞功能相關抗原1（sICAM-1）被認為是ICAM-1的拮抗方法，從而降低了識別能力以及對免疫細胞殺傷的敏感性[17]。

VCAM-1 是整聯(lián)蛋白粘附蛋白家族的成員，并且其表達在活化的內皮中被上調,在VCAM-1中它促進白細胞通過內皮向發(fā)炎的,受感染的組織的運輸。有趣的是，VCAM-1 似乎在免疫攻擊的腫瘤逃逸中也起著作用[18]。在腫瘤細胞中表達的VC AM-1 可能促進T細胞從腫瘤中遷移出來，從而導致腫瘤中T細胞的數量減少。具體而言，VCAM-1的結合似乎可以驅動粘著斑的分解，通過粘著斑激酶的激活來驅動整聯(lián)蛋白依賴性細胞遷移，并刺激由淋巴細胞功能相關抗原1 介導的T細胞遷移，類似的機制也可能在PROM 中起作用[19]。此外，ICAM-1在PROM 中高表達，這與PROM 誘導的炎癥因子如IL-1β，IL-6和TNF-α的表達增加密切相關。另外，VCAM-1在血管內皮細胞中表達，介導淋巴細胞,單核細胞和內皮細胞之間的粘附并參與許多重要的病理生理過程,并且可能是血管功能障礙或血管疾病進展的重要指標[20]。本研究中，與正常胎盤組織比較，非CAM 胎盤組織、CAM 胎盤組織中VCAM-1、ICAM-1 mRNA表達水平、蛋白表達水平、蛋白表達陽性率明顯升高；與非CAM胎盤組織比較、CAM 胎盤組織中VCAM-1、ICAM-1 mRNA和蛋白表達水平、蛋白陽性表達率明顯升高，這與上述討論一致，同時也說明胎膜早破患者胎盤組織中ICAM-1與VCAM-1表達水平升高，ICAM-1與VCAM-1可能與PROM 伴CAM 病理進展密切相關。ROC 分析表明，VCAM-1+ICAM-1 mRNA聯(lián)合診斷胎膜早破的臨床價值較高，有望用于預測胎膜早破的生物標志物。本研究未通過動物、細胞實驗對ICAM-1、VCAM-1與PROM的關系進行深入研究，這將在后續(xù)研究中進行。

綜上所述，胎膜早破患者胎盤組織中ICAM-1與VCAM-1mRNA與蛋白表達水平升高，伴絨毛膜羊膜炎胎膜早破患者胎盤組織中VCAM-1、ICAM-1mRNA與蛋白更高，二者有望作為預測胎膜早破/絨毛膜羊膜炎的敏感生物標志物。