miR-224通過NK細(xì)胞調(diào)控皮膚淋巴瘤的作用及其機(jī)制研究

劉珂，秦玲，王娜，張艷芝，鄧會(huì)陽，馮金彪

（河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院 河南科技大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院血液科，中國(guó) 洛陽 471003）

原發(fā)性皮膚淋巴瘤（cutaneous lymphomas,CLs）是一類異質(zhì)性的淋巴增生性惡性腫瘤，皮膚是淋巴瘤最常累及的器官[1]。65%的CL 屬于成熟的T 淋巴細(xì)胞（皮膚T細(xì)胞淋巴瘤，CTCL），25%來源于成熟的B細(xì)胞（皮膚B細(xì)胞淋巴瘤，CBCL），其余部分為NK/T 皮膚淋巴瘤。當(dāng)淋巴管擴(kuò)散局限于皮膚而不涉及淋巴結(jié)、骨髓或臟器時(shí)，淋巴瘤主要被歸類為皮膚性淋巴瘤[2,3]。據(jù)估計(jì)，每年CTCL的發(fā)病率為0.7～0.8/10 萬，而CBCL的發(fā)病率約為0.3/10 萬。流行病學(xué)顯示，特定CL 亞型的患病率存在廣泛的多樣性。T細(xì)胞皮膚淋巴瘤主要來源于皮膚歸巢性CD4+CD45RO+T細(xì)胞，具有浸潤(rùn)皮膚的潛能。CLs的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其主要特征為惡性程度高，侵襲性強(qiáng)，預(yù)后較差等[4,5]。目前關(guān)于該類疾病的臨床診斷較為困難，尤其在早期階段，而臨床治療方式多為全身性化放療,對(duì)提高患者總體緩解率和生產(chǎn)率十分有限。因此，基于皮膚淋巴瘤的分子靶向研究還具有廣闊的空間和不可忽視的臨床意義。

microRNAs（miRNA）是一類小非編碼RNA，可在轉(zhuǎn)錄后水平行負(fù)調(diào)控靶基因，發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用，如調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖、細(xì)胞凋亡以及造血等功能[6]。由于miRNA 分子量較小，鏈較短，可在石蠟包埋組織中保存完好。因此檢測(cè)特異性的miRNA表達(dá)豐度，對(duì)疾病的診斷、治療以及預(yù)后具有巨大的潛能[7,8]。目前miRNA的功能及機(jī)制研究集中在B 淋巴細(xì)胞瘤，而對(duì)T 或NK細(xì)胞瘤中的研究較少[9]。NK細(xì)胞占淋巴細(xì)胞總數(shù)的10～15%左右，NK細(xì)胞異?；罨瘏⑴cCLs的發(fā)生發(fā)展，占非霍奇金淋巴瘤（NHLs）的10.5%。相關(guān)研究表明miRNAs在調(diào)控NK 淋巴瘤細(xì)胞增殖、凋亡和化療敏感性中至關(guān)重要。

miR-224 是近年來研究較多，在大多數(shù)腫瘤中普遍失調(diào)的miRNA 之一，影響重要的細(xì)胞生物功能，具有臨床診療和預(yù)后評(píng)估的臨床價(jià)值[10]。大量的研究提示異常表達(dá)的miR-224 參與調(diào)節(jié)多種腫瘤的病理進(jìn)程，如肝細(xì)胞癌，胰腺導(dǎo)管癌，卵巢癌，乳腺癌，腎癌，結(jié)腸癌，結(jié)腸癌和前列腺癌等[11,12]。miR-224與腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，過表達(dá)的miR-224通過調(diào)控下游增殖、侵襲和遷移及抗凋亡相關(guān)的靶基因，包括CDC42、CDH1、PAK2、BCL-2和MAPK1[13]。而在NK/T細(xì)胞淋巴瘤中，miRNA-224對(duì)細(xì)胞生物學(xué)行為的影響仍不清楚，因此明確miRNA-224的表達(dá)及生物調(diào)節(jié)功能對(duì)患者評(píng)估和靶向治療提供科學(xué)依據(jù)。

本研究中，我們以miR-224 可能是參與調(diào)控NK 淋巴瘤細(xì)胞增殖和凋亡的關(guān)鍵分子為切入點(diǎn)，分析miR-224在促進(jìn)NK/T細(xì)胞皮膚淋巴瘤發(fā)生發(fā)展的潛能是否具有相關(guān)性。通過組織qRT-PCR和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方法證實(shí)miR-224表達(dá)與皮膚淋巴瘤增殖及抗凋亡的關(guān)系；基于文獻(xiàn)調(diào)研，進(jìn)一步對(duì)篩選的靶基因進(jìn)行驗(yàn)證，采用細(xì)胞體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)合生長(zhǎng)曲線及凋亡流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù)方法，確認(rèn)MERK 信號(hào)通路是miR-224 下游調(diào)控的靶基因，是miR-224 參與調(diào)控淋巴細(xì)胞瘤增殖及抗凋亡的關(guān)鍵通路，明確miR-224 明確在皮膚淋巴瘤進(jìn)展過程中的作用，旨在為皮膚淋巴瘤的診斷、預(yù)測(cè)和治療靶點(diǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 RPMI-1640 培養(yǎng)基及胎牛血清購自美國(guó)Hyclone 公司。胰蛋白酶-EDTA 消化液購自Solarbio 公司。青霉素及鏈霉素購自美國(guó)Invitrogen 公司。BCA蛋白濃度試劑盒和Trizol 試劑購自美國(guó)Thermo scientific 公司;所有引物、miR-224 mimic和inhibitor及其陰性對(duì)照均由上海吉瑪制藥技術(shù)公司提供。CCK-8 試劑盒購自東仁化學(xué)科技有限公司。Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測(cè)試劑盒購自R&D Systems 公司。MERK、p-MERK和GAPDH 抗體購自Abcan 公司。增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑盒（sc-2048）和PVDF 膜購自Sigma-Aldrich 公司。

1.2 細(xì)胞系及臨床樣本 人正常NK細(xì)胞株ZYH168和人NK/T細(xì)胞株淋巴瘤細(xì)胞SNK6 購自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。SNK6及ZY-H168細(xì)胞使用RPMI-1640 完全培養(yǎng)基于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)。收集本院皮膚科收治的38例NK T細(xì)胞皮膚淋巴瘤患者的淋巴瘤及其癌旁組織。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 取處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的SNK6，在RPMI-1640 完全培養(yǎng)基于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)。設(shè)計(jì)miRNA-224 mimic和inhibitor 進(jìn)行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，具體操作如下：轉(zhuǎn)染前一天，將細(xì)胞分別接種到6 孔板中，接種密度每孔5×105個(gè)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到60%～70%時(shí)，參考Lipo2000 說明書步驟，準(zhǔn)備A、B 液，A 液：125μl Opti-MEM+5μl Lipo2000；B 液：125μl Opti-MEM+500 pmol miRNA-224 mimics/inhibitors 或其陰性對(duì)照，將A 液和B 液混勻，室溫靜止15min 后轉(zhuǎn)入6 孔板中，6h 后根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)換成完全培養(yǎng)基。48h 后收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果。

2.2 細(xì)胞總RNA 提取及qRT-PCR 實(shí)驗(yàn) 將所有待測(cè)組織細(xì)胞樣本收集至無酶EP 管中，加入適量TRizol 試劑（Invitrogen 公司）裂解,室溫放置5min，加入200μl 氯仿,上下震蕩15s 后,室溫放置5min。12000rpm，4℃離心5min。將上層水相轉(zhuǎn)移另一新EP 管，加入等量的氯仿混合后12000rpm 離心5 min。轉(zhuǎn)移上層液體并加入等量預(yù)冷的異丙醇，-20℃放置30min 后離心，95%乙醇進(jìn)行RNA 沉淀后，再使用75%乙醇清洗，加入適量DEPC水，充分溶解后-80℃?zhèn)溆谩?/p>

用紫外分光光度計(jì)測(cè)定總的RNA 濃度，取A260/280 值在1.8～2.0 之間的樣本。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，取1μg的總RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。配制qRT-PCR 反應(yīng)體系為20μl，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30s，95℃預(yù)變性5s，60℃預(yù)變性30 s，共40 個(gè)循環(huán)。以U6 作為對(duì)照。引物序列如下，miR-224 上游引物:5'-GAGCCCAAGTCACTAGT GGT-3'；miR-224 下游引物:5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'；U6 上游引物:5'-CTCGCTTCGGCAGC ACA-3',U6 下游引物:5'-CGCTTCAGAATTTGCG TGTCAT-3'。各個(gè)樣品做3 個(gè)復(fù)孔，對(duì)所提總RNA樣本行miRNA-224 擴(kuò)增，以U6 為內(nèi)參，統(tǒng)計(jì)分析miRNA-224的相對(duì)表達(dá)量。

2.3 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 使用CCK-8 試劑盒檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。具體步驟如下：將SNK6細(xì)胞接種于96孔板，調(diào)整細(xì)胞密度2000 個(gè)/孔，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。分別轉(zhuǎn)染miRNA-224 mimic和inhibitor及其陰性對(duì)照，37℃恒溫箱培養(yǎng)24h，48h和72h。加入10μl的CCK-8 繼續(xù)培養(yǎng)2h 后，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)在450nm 下的吸光度，統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)。

2.4 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SNK6細(xì)胞，按2105 個(gè)細(xì)胞接種到6 孔板中，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。將培養(yǎng)過夜后，換成無血清培養(yǎng)液饑餓后進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，參照上述步驟。孵育48h 后，然后用不含EDTA的胰酶收集細(xì)胞，再用PBS 充分洗滌細(xì)胞兩次。使用Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。分別在各組細(xì)胞中加入500μl的Annexin V，制成細(xì)胞懸液，然后加入5μl Annexin V-FITC 混勻，再加入5μl的Propidium Iodide 充分混合均勻,避光條件下于室溫孵育10 min 后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況。

2.5 Western blot 實(shí)驗(yàn) 將SNK6 接種于六孔培養(yǎng)板內(nèi)，待細(xì)胞融合度達(dá)到80～90%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，處理同上。轉(zhuǎn)染48h 后，撤去血清，恒溫箱培養(yǎng)2h 后提取細(xì)胞總蛋白。根據(jù)BCA蛋白定量試劑盒的操作說明書，采用標(biāo)準(zhǔn)蛋白BSA 做標(biāo)曲，每組待測(cè)樣品檢測(cè)三次，通過紫外分光光度計(jì)檢測(cè)562 nm 處的吸光值，根據(jù)標(biāo)曲計(jì)算各組樣品的蛋白濃度，調(diào)整后進(jìn)行Western blot 檢測(cè)MERK、p-MERK和GAPDH 內(nèi)參蛋白，使用發(fā)光底物顯影，凝膠成像系統(tǒng)觀察、拍照，使用Image J 軟件對(duì)各個(gè)目的條帶進(jìn)行灰度分析，統(tǒng)計(jì)目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，每組至少設(shè)3 個(gè)平行樣，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，從而保證數(shù)據(jù)的可信性。采用GraphPad Prism8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差（mean ± SD）的形式加以展示。組間顯著性差異通過單因素方差分析進(jìn)行檢驗(yàn)。兩組間比較采用配對(duì)t 檢驗(yàn)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 miR-224在皮膚淋巴瘤及NK 淋巴瘤細(xì)胞中高表達(dá)對(duì)皮膚淋巴瘤組織及細(xì)胞株進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)，結(jié)果顯示：癌旁組織相比與皮膚淋巴瘤部位miR-224 比較，差異有顯著性意義（P＜0.05）；與正常NK細(xì)胞株ZY-H168 相比，NK 淋巴瘤細(xì)胞株SNK6 中miR-224 高表達(dá)（相對(duì)表達(dá)倍數(shù)比為1：1.859，P＜0.05)。見圖1。

圖1 qRT-PCR 檢測(cè)miRNA-224在皮膚淋巴瘤及NK 淋巴瘤細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量。*P<0.05。

3.2 miR-224對(duì)NK 淋巴瘤細(xì)胞增殖的影響在NKTL細(xì)胞株SNK6 中，miR-224 mimic及inhibitor轉(zhuǎn)染48h 后，通過實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)所有相關(guān)實(shí)驗(yàn)樣本中miR-224 變化。結(jié)果顯示，相對(duì)于陰性對(duì)照組，miR-224 mimic 轉(zhuǎn)染后miR-224水平升高，而在miR-224 inhibitor 轉(zhuǎn)染組，miR-224 呈現(xiàn)低表達(dá)。提示miR-224 mimic和inhibitor 均成功轉(zhuǎn)染，可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見圖2。

圖2 qRT-PCR 檢測(cè)miRNA-224 mimic和inhibitor 轉(zhuǎn)染后相對(duì)表達(dá)量。**P<0.01。

為了闡明miR-224表達(dá)在皮膚淋巴瘤中的生物學(xué)機(jī)制，我們研究miR-224 上調(diào)或下調(diào)后會(huì)影響NK 淋巴瘤細(xì)胞的增殖和抗凋亡能力。miR-224 mimic、inhibitor及相關(guān)陰性對(duì)照物轉(zhuǎn)染SNK6細(xì)胞后，采用CCK-8 法分別檢測(cè)各組在24、48及72h的生長(zhǎng)曲線。結(jié)果顯示：與陰性對(duì)照相比，在SNK6細(xì)胞中，miR-224 mimic 增強(qiáng)了細(xì)胞增殖，而miR-224 inhibitor 則抑制了細(xì)胞增殖。這些結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)染48及72h，miR-224 正調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)增殖，與陰性對(duì)照組比較，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而miR-224 inhibitor 組在轉(zhuǎn)染48和72h 后，細(xì)胞增殖能力減弱，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖3。

圖3 miRNA-224 mimic、inhibitor對(duì)SNK6細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的影響

3.3 miRNA-224對(duì)NK 淋巴瘤細(xì)胞凋亡的影響通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，將miR-224 mimic 轉(zhuǎn)入SNK6細(xì)胞48 小時(shí)后，miR-224 模擬物轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞凋亡率(9.29±1.71）%，較陰性mimic對(duì)照組（18.27±2.01）%低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。提示miR-224 過表達(dá)可抑制SNK6細(xì)胞的凋亡。見表1。

表1 miR-224 模擬物和抑制劑對(duì)SNK6細(xì)胞凋亡的影響

miR-224 inhibitor 轉(zhuǎn)染SNK6細(xì)胞后的48 小時(shí)，miR-224 抑制物 組細(xì)胞的凋亡 率（9.29±1.71）%，較陰性inhibitor對(duì)照組（18.27±2.01）%低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。提示抑制miR-224的表達(dá)可促進(jìn)SNK6細(xì)胞的凋亡。

3.3 miR-224 調(diào)控NK 淋巴瘤細(xì)胞的機(jī)制研究 近年來有關(guān)miR-224在腫瘤中的研究較多,對(duì)腫瘤發(fā)生的調(diào)節(jié)機(jī)制及作用靶點(diǎn)的探究中,有研究表明miR-224的靶基因主要是主要涉及參與腫瘤增殖、遷移、侵襲及凋亡，如CDC42、CDH1、PAK2、BCL-2及API-5 凋亡蛋白抑制因子5 等。有研究表明，MERK1 作為miR-224 下游靶基因參與增強(qiáng)多種腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力并且能夠抵抗凋亡。因此我們進(jìn)一步分析了外源性miR-224 是否影響NK 淋巴瘤細(xì)胞中MERK 信號(hào)通路。我們對(duì)轉(zhuǎn)染了miR-224 模擬物和抑制物的SNK6細(xì)胞中的MERK1 含量及活性進(jìn)行分析。見圖4，Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，在miR-224模擬組中總MERK1的蛋白水平無顯著變化，而p-MERK1 顯著上調(diào)。此外，miR-224 抑制劑組下調(diào)p-MERK1蛋白表達(dá)，與抑制物對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這表明miR-224 可能通過誘導(dǎo)MERK 信號(hào)通路促進(jìn)皮膚淋巴瘤的發(fā)生發(fā)展。

圖4 Western blot 檢測(cè)miR-224 mimic及inhibitor處理SNK6 后，細(xì)胞內(nèi)p-MERK、MERK、的表達(dá)情況。

我們進(jìn)一步對(duì)各蛋白條帶用軟件進(jìn)行灰度相對(duì)分析，結(jié)果可見圖5。與對(duì)照組相比，miR-224 mimic 作用2 小時(shí)后可顯著上調(diào)胞內(nèi)p-MERK-1蛋白的表達(dá)水平（1.829±0.383 vs.1.000±0.261）,具有顯著性差異（**P<0.01）。與對(duì)照組相比，miR-224 inhibitor 作用2 小時(shí)后可顯著上調(diào)胞內(nèi)p-MERK-1蛋白的表達(dá)水平（0.526±0.210 vs.1.000±0.324），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

圖5 Western blot 灰度半定量分析miR-224 mimic及inhibitor對(duì)SNK6細(xì)胞的p-MERK1/t-MERK1與內(nèi)參蛋白的灰度值比。**P<0.01。

4 討論

miR-224在體外具有促進(jìn)腫瘤增殖、侵襲遷移的作用，并與化療反應(yīng)相關(guān)。先前的報(bào)道顯示，miR-224在絕大多數(shù)腫瘤中表達(dá)增高，可以促進(jìn)細(xì)胞演進(jìn)、增殖、分化，是腫瘤細(xì)胞增殖的正調(diào)節(jié)因子[13]。在本研究中，我們的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明，miR-224 可促進(jìn)NK 淋巴瘤細(xì)胞的增殖、抑制凋亡，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)可通過促進(jìn)MERK 活性來增強(qiáng)細(xì)胞增殖和抗凋亡能力。miR-224 可作為NKTL皮膚淋巴瘤的腫瘤促進(jìn)因子，因此皮膚淋巴瘤的診斷可以通過miR-224 進(jìn)行預(yù)測(cè)。NFkB通路被認(rèn)為是多種腫瘤重要的耐藥機(jī)制，有絲分裂原活化蛋白激酶MAPKs 是一系列的絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶，它們?cè)诩?xì)胞增殖、分化、遷移、凋亡和炎癥反應(yīng)等多種細(xì)胞過程中發(fā)揮關(guān)鍵功能。MAPK 級(jí)聯(lián)的激活需要四個(gè)序列元件，包括小GTPases（Ras和Rac 原癌基因）、MAPK 激酶激酶（Raf 或MEKK）、MAPK 激酶（MEK）和MAPKs。在哺乳動(dòng)物中，MAPKs 家族主要包括c-Jun NH2 末端激酶JNK、p38 MAPK和胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶ERK，每種MAPK具有不同的細(xì)胞定位、亞型和功能。在皮膚淋巴瘤發(fā)生發(fā)展中，MAPKs通路能夠被許多不同的細(xì)胞外刺激激活，如細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、神經(jīng)體液介質(zhì)和機(jī)械應(yīng)激[14]。異常活化的MERK 信號(hào)通路的抑制是皮膚淋巴瘤臨床診療的重要靶點(diǎn)。

相關(guān)研究表明，MAPKs 信號(hào)通路在NK 淋巴細(xì)胞異常活化中起重要作用。有報(bào)道稱MAPK通路受到miR-224的直接調(diào)控，其作用是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲，提高腫瘤細(xì)胞抗凋亡能力。這與我們的研究一致，miR-224在皮膚淋巴瘤組織中呈現(xiàn)低水平，且預(yù)后不良；進(jìn)一步的體外實(shí)驗(yàn)表明，相較于人正常NK細(xì)胞系，miR-224在淋巴瘤細(xì)胞株SNK6 中呈現(xiàn)高水平。上調(diào)miR-224在SNK6細(xì)胞中的含量可促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，而下調(diào)miR-224 將抑制SNK6的增殖。miR-224表達(dá)上調(diào)可激活MERKs 信號(hào)通路，這可能是決定皮膚淋巴瘤生物學(xué)行為的關(guān)鍵事件[15]。目前，關(guān)于miR-224在皮膚淋巴瘤中的作用研究有限，在miR-224 介導(dǎo)MERKs 信號(hào)對(duì)皮膚淋巴瘤的影響尚不清楚。

皮膚NK/T細(xì)胞淋巴瘤可分為原發(fā)性和繼發(fā)性,具有高度的侵襲性,通常預(yù)后較差。據(jù)報(bào)道,MERK-1的磷酸化是miRNAs 一種重要的轉(zhuǎn)錄因子與腫瘤形成有關(guān)。然而p-MERK-1 介導(dǎo)的皮膚淋巴瘤發(fā)生仍然知之甚少。在目前的研究中,miRNAs 是根據(jù)先前報(bào)道的NKTL 生物學(xué)相關(guān)性篩選的。在一項(xiàng)比較YT細(xì)胞和正常NK細(xì)胞的研究中,miR-9和miR-189 被選為NKTL 中預(yù)期高表達(dá)和低表達(dá)的代表性miRNAs[16]。miR-146a和miR-155與外周血細(xì)胞中的LMP1/NF-kB 關(guān)系密切。此外，miR-106a 參與T細(xì)胞淋巴瘤和白血病的研究。這些發(fā)現(xiàn)表明，在NK/T細(xì)胞皮膚淋巴瘤中，某些miRNAs 可作為有效的抑癌或促癌因素[17,18]。在本文的研究中，我們發(fā)現(xiàn)AB23A 能夠顯著下調(diào)活化成纖維細(xì)胞內(nèi)的MAPK和ERK 磷酸化，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)核轉(zhuǎn)錄因子CREB的DNA 結(jié)合活性受到抑制，提示AB23A通過調(diào)控MER/ERK1/2/CREB 活化的信號(hào)通路減弱纖維化程度。

綜上所述，miR-224在NK/T細(xì)胞皮膚淋巴瘤及NK 淋巴瘤細(xì)胞株SNK6 中高表達(dá)。體外研究顯示，miR-224 高表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡。深入研究miR-224 促進(jìn)NK 淋巴瘤細(xì)胞增殖活化及抗凋亡的作用機(jī)制，結(jié)果提示miR-224 介導(dǎo)的MAPK 活性得到有效增加。miR-224 能夠調(diào)控磷酸化MAPK的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)NK 淋巴瘤細(xì)胞的增殖和抗凋亡活性，為抵抗NK/T細(xì)胞皮膚淋巴瘤治療提供新的手段和思路。