瘢痕組織MECP2、HDAC6的表達(dá)及其臨床意義

丁治云，梁作輝，方會(huì)娟，龍亭

（1.河南中醫(yī)藥大學(xué)人民醫(yī)院/鄭州人民醫(yī)院皮膚科，河南 鄭州 450003；2.玉溪市人民醫(yī)院皮膚科，云南 玉溪 653100；3.河南中醫(yī)藥大學(xué)人民醫(yī)院/鄭州人民醫(yī)院病理科，河南 鄭州 450003）

成纖維細(xì)胞大量增殖以及膠原過度沉積是增生性瘢痕與瘢痕疙瘩的共同病理基礎(chǔ)。已有研究發(fā)現(xiàn)，瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞普遍存在DNA 甲基化以及組蛋白乙?；?上述病理變化與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控密切相關(guān)[1]。甲基化結(jié)合蛋白2（methylation binding protein 2，MECP2）、組蛋白去乙酰化酶6（histone deacetylase 6，HDAC6）分別屬于MECP 家族與HDAC 家族成員，兩者均在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起著關(guān)鍵作用[2]。在大部分情況下，HDAC6 作為重要的協(xié)同因子，促使MECP2與某高甲基化啟動(dòng)子相結(jié)合，共同抑制基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)[3]。新近研究發(fā)現(xiàn)，MECP2、HDAC6 廣泛存在纖維化的肺組織的成纖維細(xì)胞中，通過下調(diào)HDAC6的表達(dá)水平，能夠顯著減少皮膚成纖維細(xì)胞含量[4]。上述研究均提示MECP2、HDAC6 是纖維化形成過程的重要環(huán)節(jié)。本研究比較了瘢痕組織及正常皮膚中MECP2、HDAC6表達(dá)水平，以期進(jìn)一步探明其在瘢痕形成過程中的作用，為瘢痕的治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 從2018年3 月-2020年3 月收治的90例瘢痕患者獲取瘢痕組織標(biāo)本。瘢痕患者納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴符合《現(xiàn)代瘢痕學(xué)》第2 版[5]標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí);⑵年齡≥18 歲;Ⅳ瘢痕部位為胸部、肩部及上肢；⑷瘢痕生長(zhǎng)時(shí)間≥3 個(gè)月；⑸均未接受過相關(guān)治療；⑹均自愿參加研究。其中男58例,女32例，年齡18～67 歲，平均（31.93±13.54）歲。根據(jù)瘢痕標(biāo)本組織學(xué)形態(tài)分為正常瘢痕組(29例)、增生性瘢痕組（25例）、瘢痕疙瘩組（36例）。另從28例上瞼松弛患者獲取手術(shù)切除組織作為正常皮膚標(biāo)本，其中男19例，女9例，年齡26～64 歲，平均（35.95±11.21）歲。瘢痕標(biāo)本組織學(xué)形態(tài)鑒別標(biāo)準(zhǔn)：參照《現(xiàn)代瘢痕學(xué)》（第2 版）[5]。正常瘢痕：瘢痕形態(tài)扁平，外觀略微粗糙，可伴有輕微色素加深或減退，無不適癥狀；增生性瘢痕：瘢痕明顯高于皮膚，質(zhì)地堅(jiān)硬，外觀形狀不規(guī)則，呈現(xiàn)暗紅色或紫紅色，并引起瘙癢；瘢痕疙瘩：瘢痕高于皮膚，質(zhì)地堅(jiān)硬，厚度高低不平，呈現(xiàn)粉紅色或紫紅色，并出現(xiàn)疼痛、灼熱、瘙癢感等癥狀。

1.2 方法 ⑴采用蛋白質(zhì)印跡法（WB 法）檢測(cè)MECP2、HDAC6在各標(biāo)本中的表達(dá)水平，具體方法：將標(biāo)本研磨后裂解提取組織總蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度以及上樣量，電泳處理后經(jīng)一抗、二抗孵育，洗膜后置入顯影儀曝光拍照，采用美國(guó)Media Cybernetics公司Image pro plus6.0f 進(jìn)行圖像分析。⑵采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRTPCR）檢測(cè)各標(biāo)本MECP2、HDAC6 mRNA的表達(dá)。具體方法：提取總RNA，分光光度計(jì)檢測(cè)RNA 濃度，按照Protocol 加樣，反應(yīng)完成后置于冰上冷卻后進(jìn)行cDNA 擴(kuò)增，采用分光光度計(jì)測(cè)定cDNA 濃度，最后利用每個(gè)樣品所得CT 值計(jì)算△CT及2（-△CT）值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料多組間比較采用F 檢驗(yàn)，事后兩兩比較采用LSD 檢驗(yàn)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各標(biāo)本MECP2、HDAC6蛋白表達(dá)情況 各標(biāo)本MECP2、HDAC6蛋白表達(dá)水平存在明顯差異（P＜0.05），見表1。

表1 各標(biāo)本MECP2、HDAC6蛋白水平比較

2.2 各樣本MECP2 mRNA、HDAC6 mRNA的表達(dá)各樣本MECP2 mRNA、HDAC6 mRNA表達(dá)量存在明顯差異（P＜0.05），見表2。

表2 各樣本MECP2 mRNA、HDAC6 mRNA的表達(dá)

2.3 增生性瘢痕MECP2、HDAC6蛋白表達(dá)隨時(shí)間（月）的變化情況增生性瘢痕0～3m、4～6m MECP2、HDAC6表達(dá)水平高于7～12m（P＜0.05），見表3、圖1。

表3 增生性瘢痕MECP2、HDAC6蛋白表達(dá)隨時(shí)間的變化情況

圖1 增生性瘢痕MECP2、HDAC6蛋白表達(dá)隨時(shí)間的變化情況

3 討論

瘢痕是皮膚創(chuàng)口自我修復(fù)形成的產(chǎn)物，在皮膚組織修復(fù)過程中各個(gè)階段發(fā)生異常均可出現(xiàn)病理性瘢痕，主要表現(xiàn)為增生性瘢痕與瘢痕疙瘩。目前瘢痕的臨床治療仍是較大難題，缺乏適用于不同類型瘢痕的統(tǒng)一治療方案，且治療效果欠理想。因此，如何預(yù)防瘢痕的形成，盡可能避免出現(xiàn)病理性瘢痕，具有重要意義。

MECP 是一類能夠與甲基化-CpG 二核苷酸發(fā)生反應(yīng)的蛋白家族。已有研究發(fā)現(xiàn),在纖維化病變的肝臟、肺、心臟等器官的成纖維細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)MEC P2表達(dá)水平明顯增加[6,7]。在組織發(fā)生纖維化過程中，MECP2 主要作為一種重要的轉(zhuǎn)錄抑制因子,通過對(duì)與纖維化形成相關(guān)的各種負(fù)性調(diào)控因子，包括PPAR-γ、TSC1/TSC2 等進(jìn)行負(fù)性調(diào)控，從而促進(jìn)了組織的纖維化病理變化[8,9]。有研究采用SiRNA-MECP2 下調(diào)MECP2的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各種與纖維化病變相關(guān)的細(xì)胞因子的水平同樣明顯降低，組織的纖維化進(jìn)程明顯延緩[10]。HDAC與組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶（HAT）兩者共同對(duì)組蛋白乙?；潭冗M(jìn)行調(diào)節(jié)，從而影響靶基因的表達(dá)[11]。已有研究報(bào)道，在纖維化的肺組織中HDAC6的表達(dá)水平升高,應(yīng)用HDAC 抑制劑后能夠顯著降低組織的纖維化[12]。這提示MECP2與HDAC6蛋白表達(dá)升高在組織纖維化中起著正向促進(jìn)作用,下調(diào)此兩者的表達(dá)水平有助于抑制組織纖維化,這為阻斷瘢痕纖維化進(jìn)程提供了重要的思路。

本研究結(jié)果顯示，正常皮膚標(biāo)本MECP2與HDAC6蛋白以及mRNA的表達(dá)水平均明顯低于瘢痕標(biāo)本，且隨著瘢痕嚴(yán)重程度的增加，MECP2與HDAC6蛋白以及mRNA表達(dá)逐漸升高，即瘢痕疙瘩水平＞增生性瘢痕水平＞正常瘢痕水平＞正常皮膚水平,具有顯著性差異（P＜0.05）。按瘢痕形成時(shí)間(月)程度來看,增生性瘢痕0～3m、4～6m 時(shí)MEC P2、HDAC6表達(dá)水平高于7～12m（P＜0.05）。進(jìn)一步觀察增生性瘢痕MECP2與HDAC6表達(dá)隨時(shí)間變化情況，結(jié)果顯示，增生性瘢痕處于不同生長(zhǎng)時(shí)期時(shí)MECP2與HDAC6蛋白的表達(dá)也有差異，當(dāng)增生性瘢痕處于早期 (0～3M)和增生期 (3～6M)時(shí)MECP2與HDAC6蛋白的表達(dá)量最高且未見明顯差異,但當(dāng)增生性瘢痕處于穩(wěn)定期(6～12M)和消退期(12M)時(shí)MECP2與HDAC6蛋白的表達(dá)量明顯減少，這進(jìn)一步證實(shí)MECP2與HDAC6蛋白在瘢痕形成與加重過程中的重要作用。分析其原因可能是由于在瘢痕形成過程中，MECP2表達(dá)量明顯升高，對(duì)某些啟動(dòng)子高甲基化基因產(chǎn)生抑制作用，從而促進(jìn)皮膚纖維化的進(jìn)展[13]。研究證明，MECP2不僅可作為評(píng)價(jià)組織甲基化程度的指標(biāo)，也可作為瘢痕纖維程度的重要評(píng)估指標(biāo)[14]。同樣，HDAC6在不同嚴(yán)重程度瘢痕中表達(dá)水平的差異不僅可作為評(píng)估組蛋白乙?；潭鹊闹笜?biāo)，也可反映瘢痕纖維化嚴(yán)重程度[13]。說明組蛋白去乙?；揎椩谌梭w病理性瘢痕形成過程中扮演著重要的角色,HDAC6蛋白在瘢痕疙瘩中的高表達(dá)也說明組蛋白去乙?；瘏⑴c的表觀遺傳學(xué)調(diào)控是瘢痕防治的重要切入點(diǎn)。

綜上所述，MECP2與HDAC6蛋白在不同組織形態(tài)的瘢痕中的表達(dá)增加，提示在瘢痕形成過程中DNA 甲基化及組蛋白乙?；^程發(fā)揮著重要的促纖維化作用，但此二者的具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。