外周血PCT、CD64、Pro-ADM及sTREM-1與兒童社區(qū)獲得性肺炎病原體革蘭染色類別及耐藥水平的相關(guān)性

孫宏躍，吳建華，陶占領(lǐng)

（1.鄭州市婦幼保健院檢驗(yàn)科，河南 鄭州 450000；2.鄭州市第一人民醫(yī)院兒科一病區(qū)，河南 鄭州 450000；3.鄭州安圖生物工程股份有限公司，河南 鄭州 450000）

兒童社區(qū)獲得性肺炎（CAP）是全球范圍內(nèi)造成5 歲以下兒童死亡的主要原因之一[1]。CAP的及時診斷和疾病嚴(yán)重程度的評估，以及對病原菌的及時鑒別，對于選擇合適的治療方案以及獲得良好的預(yù)后結(jié)局，尤為關(guān)鍵。大量流行病學(xué)研究數(shù)據(jù)顯示目前兒童CAP 主要病原微生物為細(xì)菌，約占50%以上，分為革蘭氏陰性（包括大腸埃希菌和鮑曼不動桿菌等）和革蘭氏陽性細(xì)菌（包括金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌等）[2]。目前依賴細(xì)菌培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)明確病原菌和耐藥情況，但這往往需要較長時間，不利于兒童患者的治療。有研究證實(shí)革蘭氏陽性和陰性細(xì)菌患者體內(nèi)某些炎癥因子如降鈣素原（PCT）等的表達(dá)存在顯著差異[3]。但在兒童CAP 中是否存在類似現(xiàn)象，以及新型炎癥標(biāo)志物CD64、Pro-ADM及sTREM-1 等是否同樣存在差異，這些指標(biāo)對于不同耐藥程度的患者是否具有區(qū)分能力，目前未見相關(guān)報道。據(jù)此，本研究將探討病原菌種類及耐藥水平與炎癥標(biāo)志物PCT、CD64、Pro-ADM及sTREM-1的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對象 隨機(jī)選取2017年3 月-2019年4月間于鄭州市婦幼保健院兒科就診的125例CAP患兒，所有患者年齡均低于5 歲。CAP 診斷符合中華醫(yī)學(xué)會制定的“兒童CAP 管理指南（2013年修訂）”[4]。其中男71例，女54例，平均3.58±1.21 歲。所有納入患兒均排除哮喘、過敏性肺炎和過敏性支氣管炎等肺部疾??；排除其他系統(tǒng)感染性疾病患者；利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測MP-IgM和CPIgM 以及熒光定量PCR 法測定核酸以排除支原體和衣原體感染患者；排除入院前使用過抗生素或近期使用過免疫球蛋白的患兒；排除合并自身免疫性疾病的患兒。同時選取30例健康體檢兒童，其中男19例，女11例，平均3.61±1.13 歲。研究上報醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患兒家屬均簽訂知情同意書。

1.2 痰液標(biāo)本采集及處理 采集所有患兒治療前清晨時痰標(biāo)本2 份至于無菌痰培養(yǎng)管中，立即送至檢驗(yàn)科微生物室行痰涂片和藥敏培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。痰涂片應(yīng)挑取膿性部分作革蘭氏染色，利用鏡檢篩選合格標(biāo)本，即：鱗狀上皮細(xì)胞<10 個/低倍視野，多核WBC>25 個/低倍視野，或鱗狀上皮細(xì)胞：多核WBC<1:2.5。采用全自動微生物分析儀（美國BD 公司）鑒定細(xì)菌和藥敏實(shí)驗(yàn)。按照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會制定的藥敏判定原則對藥敏結(jié)果判讀，多重耐藥為單一病原菌對3 種或3 種以上抗生素同時產(chǎn)生耐藥。據(jù)此將病原菌分為多重耐藥組和非多重耐藥組。

1.3 血液標(biāo)本采集及處理 抽取患兒治療前清晨空腹靜脈血8ml。其中2ml 至于EDTA 抗凝管中用于CD64 指數(shù)檢測，具體方法如下：取50μl 全血于流式管底部,加入抗人CD64和CD45 抗體各10μl,充分混勻，避光孵育15min，加入500μl 溶血劑，避光10min，1200rmp 5min 離心去上清,加入鞘液1ml后1200rmp 5min 離心去上清,加入500μl 鞘液后上貝克曼FC500 流式細(xì)胞儀檢測。圈取中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，分析CD64表達(dá)強(qiáng)度。另3ml 于干燥管，4000rpm 10min 分離血清后用于檢測血清PCT 檢測，采用羅氏501 電化學(xué)發(fā)光儀及配套試劑檢測。余下3ml 于干燥管，4000rpm 10min 分離血清，-80℃保存，用于酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)測定血清Pro-ADM及sTREM-1的濃度，試劑盒均購自購自南京森貝伽生物科技有限公司，酶標(biāo)儀為科華360，所有步驟嚴(yán)格按照實(shí)際說明書執(zhí)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 利用Graphad prism 6.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，所有數(shù)據(jù)以（）表示。兩樣本均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析；兩組間相關(guān)性利用Spearman 相關(guān)分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 125例CAP患兒痰培養(yǎng)和藥敏結(jié)果 125例CAP患兒經(jīng)過痰培養(yǎng)，75例培養(yǎng)出單一病原菌并行藥敏實(shí)驗(yàn)，細(xì)菌檢出率為60.00%；其余50例為未培養(yǎng)出任何細(xì)菌，疑為病毒或支原體感染。感染患兒的檢出細(xì)菌中,革蘭氏陰性菌有43例（57.33%），革蘭氏陽性菌有32例（42.67%）。21 株大腸埃希菌（28.00%）、12 株鮑曼不動桿菌（16.00%）以及10 株肺炎克雷伯菌（13.33%）構(gòu)成了革蘭陰性菌譜；17 株金黃色葡萄球菌（22.67%）和15 株肺炎鏈球菌（20.00%）構(gòu)成了革蘭氏陽性菌譜。革蘭氏陰性菌主要對氨芐西林、頭孢曲松和頭孢他啶耐藥；革蘭式陽性菌主要對青霉素、紅霉素以及克林霉素等耐藥率較高。75 株菌共檢出31 株多重耐藥菌，占41.33%，納入多重耐藥菌組；其余44 株菌自動入組至非多重耐藥菌組。

2.2 CAP患兒和健康對照組 間PCT、CD64、Pro-ADM及sTREM-1的差異分析 CAP患兒治療前血清PCT、CD64、Pro-ADM及sTREM-1水平均顯著高于健康對照人群，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。

表1 CAP患兒和健康對照組間PCT、CD64、Pro-ADM及sTREM-1的比較

2.3 感染革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌CAP患兒PCT、CD64、Pro-ADM及sTREM-1的差異分析 依據(jù)感染的革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌將CAP患兒分為兩組，比較結(jié)果發(fā)現(xiàn)革蘭氏陽性菌組PCT、Pro-ADM和sTREM-1 均顯著低于革蘭氏陰性菌組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。而CD64 指數(shù)雖在數(shù)值上低于革蘭氏陰性組,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

表2 革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌間PCT、CD64、Pro-ADM及sTREM-1的比較

2.4 多重耐藥組和非多重耐藥組患兒PCT、CD64、Pro-ADM及sTREM-1的差異分析 依據(jù)藥敏結(jié)果將感染菌分為多重耐藥和非多重耐藥,結(jié)果發(fā)現(xiàn)多重耐藥組PCT和CD64 均顯著高于非多重耐藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）,但Pro-ADM和sTRE M-1在兩組間并無顯著差異（P>0.05）。見表3。

表3 多重耐藥組和非多重耐藥組間PCT、CD64、Pro-ADM及sTREM-1的比較

3 討論

兒童CAP 已經(jīng)成為5 歲以下兒童的主要死亡原因，在該人群中較為常見，目前已經(jīng)位居全球兒童常見疾病譜前列[5]。流行病學(xué)調(diào)查顯示在西方國家5 歲以下兒童CAP 發(fā)病率約為3.4%左右，而在中國每年約有35 萬左右5 歲以下兒童因CAP 死亡[6]。鑒于其極大的危害性，如何提高患兒病原學(xué)的及早診斷以獲得高效的治療方案，已經(jīng)成為該領(lǐng)域的重點(diǎn)研究方向。依據(jù)病原微生物類別，兒童CAP 主要有細(xì)菌、病毒以及支原體和衣原體等[7]。其中細(xì)菌感染占據(jù)主要地位，如本研究發(fā)現(xiàn)125例中經(jīng)過痰培養(yǎng)分離鑒定出75例細(xì)菌感染，占比高達(dá)60%。這與師紅玲[8]和夏厚才[9]等眾多不同地區(qū)的調(diào)查結(jié)果一致，表明我國兒童CAP患兒病原體中依然以細(xì)菌性感染為主。此外，細(xì)菌譜中革蘭陰性菌檢出率顯著高于革蘭陽性菌，主要為大腸埃希菌、鮑曼不動桿菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌[10,11]。革蘭陰性和陽性菌檢出率與國內(nèi)大部分研究報道一致，但主要的菌譜卻有所不同，如閩南地區(qū)以肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌和卡他莫拉菌為主，這可能是因?yàn)榈赜虿町愐约凹竟?jié)流行差異造成的[12,13]。分析耐藥結(jié)果顯示，多重耐藥菌檢出率高達(dá)41.33%，這與河南地區(qū)的另一研究結(jié)果一致，提示同一地域兒童CAP多重耐藥率相似[8]。

血清學(xué)研究發(fā)現(xiàn)CAP患兒治療前血清PCT、CD64、Pro-ADM及sTREM-1 等的水平均高于健康兒童，提示除了經(jīng)典的PCT 指標(biāo)外，CD64、Pro-ADM及sTREM-1 等或可成為兒童CAP的新型感染評價指標(biāo)。這與吳佳輝等[13]發(fā)現(xiàn)的CD64和sTR EM-1在細(xì)菌組和支原體組CAP患兒中異常增高，以及王彥鋒等[14]在嬰幼兒細(xì)菌性肺炎患者中發(fā)現(xiàn)的PCT和Pro-ADM 顯著上調(diào)等結(jié)果相一致。但這些研究都沒有進(jìn)一步分析這些指標(biāo)是否在不同革蘭染色以及不同耐藥程度細(xì)菌間的差異。而本研究的分析結(jié)果顯示革蘭氏陰性菌組具有較高水平的PCT、Pro-ADM和sTREM-1，而CD64 指數(shù)則并無差異。郝玉清等[15]在血流感染的成年患者中也發(fā)現(xiàn)革蘭陰性細(xì)菌感染的患者具有較高水平的PCT和sTREM-1。此外CD64 指數(shù)在革蘭陰性和陽性菌間的差異研究并不一致，存在差異或并無差異，有待于進(jìn)一步研究。但目前并沒有研究評估Pro-ADM對于革蘭氏陰性菌和陽性菌的區(qū)分能力,而本研究也初步證實(shí)Pro-ADM的這種潛力。另，多重耐藥組具有較高的PCT和CD64水平，這與羅迪等[16]評價的PCT與耐藥性的研究以及一致,但關(guān)于CD64與耐藥性的關(guān)系研究先前亦未見報道。以上結(jié)果同時也表明這些炎癥指標(biāo)雖都可以提示兒童CAP細(xì)菌感染，但在預(yù)測不同革蘭染色以及耐藥情況則功能有所不同。而這一結(jié)果將有助于臨床在細(xì)菌培養(yǎng)前提前判斷革蘭陰陽性以及耐藥程度，以便提前合理且針對性的使用抗生素，改善患者預(yù)后。

總之，本研究初步證實(shí)高水平PCT、Pro-ADM和sTREM-1與兒童CAP 革蘭氏陰性菌感染相關(guān)；而多重耐藥菌感染患者則具有較高水平的PCT和CD64 這些炎癥指標(biāo)均與與兒童CAP細(xì)菌感染密切相關(guān),可作為預(yù)測疾病發(fā)生發(fā)展的生物標(biāo)志物，但同時應(yīng)當(dāng)在第一時間行痰培養(yǎng),明確病原菌,精準(zhǔn)選用抗菌藥物,提高早期治療效果，改善患兒預(yù)后。