miRNA-223-3p在冠心病合并心肌纖維化中的變化及臨床意義

王東華

（鶴壁煤業(yè)（集團(tuán)）有限公司總醫(yī)院心內(nèi)科，河南 鶴壁 458000）

冠心病是一種發(fā)病率和死亡率均較高的疾病，嚴(yán)重威脅人類健康，目前公認(rèn)動脈粥樣硬化的病理過程是導(dǎo)致冠心病發(fā)生、演化以及進(jìn)一步惡化的主要原因[1]。冠心病疾病進(jìn)展過程中，心臟成纖維細(xì)胞被激活合成過多的Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白，細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）過度沉積于心肌組織中，心肌纖維化的發(fā)生導(dǎo)致心肌僵硬、心律失常、心功能降低，是心臟重構(gòu)的重要病理學(xué)基礎(chǔ)，其最終結(jié)局是心功能衰竭[2,3]。抑制ECM 過度沉積是預(yù)防心肌纖維化的重要措施,臨床也需要尋找新的生物標(biāo)志物為心肌纖維化提供準(zhǔn)確、敏感的預(yù)警,為冠心病的治療和預(yù)后判斷提供依據(jù)[4]。微小核糖核酸（mi RNA）是一類序列高度保守的內(nèi)源性單鏈非編碼小分子RNA，既往研究發(fā)現(xiàn)miRNA 參與冠心病發(fā)生、發(fā)展病理過程的調(diào)節(jié)，對心肌纖維化有一定的調(diào)控作用[5]。本研究選擇對冠心病患者的血清miR NA-223-3p 進(jìn)行檢測，旨在探討其與心肌纖維化的關(guān)聯(lián)，報告如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2017年1 月-2019年12 月我院收治的冠心病患者102例，其中男61例，女41例，年齡42～76 歲，平均57.45±11.39 歲。診斷標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)冠脈造影證實存在1 支或1 支以上的冠狀動脈血管直徑狹窄≧50%。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并先天性心臟病、心臟瓣膜病、心律失?；蚵宰枞苑渭膊≌撸缓喜?yán)重肝腎功能不全者；合并急慢性感染性疾病者；合并血液系統(tǒng)疾病、周圍血管性疾病者；合并惡性腫瘤或全身免疫系統(tǒng)疾病者。根據(jù)心臟磁共振成像的診斷結(jié)果進(jìn)行分組，冠心病合并心肌纖維化者53例為觀察組，未合并心肌纖維化者49例為對照組。本研究經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 基線資料收集 記錄性別、年齡、體重指數(shù)、飲酒史、吸煙史、糖尿病史、高血壓病史、冠心病家族史等情況。入院次日清晨采集患者空腹外周靜脈血6ml，離心并分離血清，分三份備用。一份用于各項生化指標(biāo)的檢測，一份用于血清miRNA-223-3p 檢測，另外一份用于纖維化指標(biāo)檢測。采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測C 反應(yīng)蛋白（CRP）水平，試劑盒由上?？道噬锟萍加邢薰咎峁?；采用邁瑞B(yǎng)S-180 全自動生化分析儀檢測總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDLC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平；采用血糖儀檢查空腹血糖水平。

1.2.2 血清miRNA-223-3p 檢測 血清RNA 快速提取試劑盒購買自杭州昊鑫生物科技股份有限公司，提取步驟如下：⑴向250μl 血清中加入750μl Lysis buffer 裂解試劑,室溫孵育15min；⑵加入200μl 氯仿，劇烈振蕩15s，室溫孵育2min；⑶4°C 12000rpm 條件下離心10min，可見樣品分三層，RNA 存在于上層無色水相；⑷小心吸取上清液，轉(zhuǎn)移至新的EP 管中，加入1.5 倍體積的常溫狀態(tài)下的無水乙醇，混勻，轉(zhuǎn)移至帶吸附柱的2ml 離心管中，4°C 12000rpm 條件下離心30s，棄液；⑸加入700μl Wash Solution 1，離心，棄液，再加入500μl Wash Solution 2，離心，棄液，重復(fù)一遍；⑹將吸附柱放回空離心管中，4°C 12000rpm 條件下離心2min，將吸附柱放到一個新的無RNase 離心管中，加入預(yù)熱的無RNase水40μl，室溫靜置1min，4°C 12000rpm 條件下離心1min，得到總RNA。使用一步法miRNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（新?；颍┻M(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。實時熒光定量PCR：根據(jù)SYBR Premix Ex Taq TM II（Taka Ra，日本）制備20μl RT-qPCR 反應(yīng)體系，并使用ABI7500 熒光定量PCR 儀器（Applied Biosystems，USA）進(jìn)行擴(kuò)增。計算目的基因miRNA-223-3p的表達(dá)水平。

1.2.3 血清纖維化指標(biāo)檢測 采用雙抗體酶聯(lián)免疫吸附法測定Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）水平，試劑盒由上海酶聯(lián)生物科技有限公司提供。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。計數(shù)數(shù)據(jù)以（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；符合正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)以（）表示，兩組間比較采取獨立樣本t 檢驗；用受試者工作曲線（ROC）和曲線下面積（AUC）評估血清miRNA-223-3p對心肌纖維化的診斷價值；危險因素分析采取多因素Logistic 回歸模型；相關(guān)性分析采取Pearson 相關(guān)分析。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組冠心病患者基線資料比較 兩組患者性別、年齡、體重指數(shù)、飲酒史、吸煙史、糖尿病史、高血壓病史、冠心病家族史、TG、TC、HDL-C、LDL-C、空腹血糖比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），觀察組患者CRP水平高于對照組（P<0.05）。見表1。

表1 兩組冠心病患者基線資料比較[n（%），]

表1 兩組冠心病患者基線資料比較[n（%），]

2.2 冠心病患者血清miRNA-223-3p對心肌纖維化的診斷價值 觀察組、對照組患者血清miRNA-223-3p表達(dá)水平分別為6.04±1.10、3.69±0.81，觀察組水平明顯高于對照組（t=12.376，P<0.05）。ROC曲線分析結(jié)果顯示，血清miRNA-223-3p 診斷心肌纖維化的AUC 值為0.961（95%CI：0.903～0.989，P<0.05），臨界值取4.61 時診斷價值最高，敏感度為92.45%，特異度為87.76%，約登指數(shù)為0.8021。見圖1。

圖1 血清miRNA-223-3p 診斷心肌纖維化的ROC 曲線

2.3 冠心病患者發(fā)生心肌纖維化的危險因素分析以冠心病患者是否發(fā)生心肌纖維化為因變量（賦值：心肌纖維化=1，無心肌纖維化=0），將血清CRP、miRNA-223-3p 作為自變量進(jìn)行多因素Logistic 回歸分析，結(jié)果顯示，CRP﹥7.53mg/L、miRNA-223-3p﹥4.61 是冠心病患者發(fā)生心肌纖維化的獨立危險因素（P<0.05）。見表2。

表2 冠心病患者發(fā)生心肌纖維化的危險因素分析

2.4 兩組患者血清纖維化指標(biāo)比較 觀察組患者血清Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、MMP-9水平高于對照組（P<0.05）。見表3。

表3 兩組患者血清纖維化指標(biāo)比較（）

表3 兩組患者血清纖維化指標(biāo)比較（）

2.5 相關(guān)性分析 Pearson 相關(guān)分析結(jié)果顯示，102例冠心病患者血清miRNA-223-3p水平與血清Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、MMP-9水平均呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)（r=0.567、0.492、0.687，P<0.05）。

3 討論

心肌纖維化過程是心臟重構(gòu)的重要病理學(xué)基礎(chǔ)，而心臟重構(gòu)是導(dǎo)致心力衰竭發(fā)生的基本機(jī)制，因此心肌纖維化的早期診斷和有效防治尤為重要[6]。除心臟影像學(xué)檢查外，血清生物標(biāo)志物檢測是臨床上判斷心肌纖維化的有效手段。

miRNA與心血管疾病的關(guān)系密切，在心肌梗死、動脈粥樣硬化、心律失常等疾病的病理機(jī)制和發(fā)展演變過程中扮演了重要角色[7]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，多種miRNA通過不同信號通路參與了心肌纖維化的調(diào)控[8]。miRNA-223 位于X 染色體的q12基因組內(nèi)，在生物進(jìn)化過程中具有高度的保守性，在調(diào)控細(xì)胞增值分化、抑制炎癥反應(yīng)過程中扮演著重要角色[9]。miRNA-223 是冠心病的保護(hù)因素，通過多種靶基因保護(hù)機(jī)體維持正常的生理過程，在疾病進(jìn)展過程中出現(xiàn)代償性增高[10]。本研究選擇對102例冠心病患者的血清miRNA-223-3p水平進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，合并心肌纖維化者血清miRNA-223-3p水平明顯高于無心肌纖維化者。經(jīng)ROC 曲線分析發(fā)現(xiàn)血清miRNA-223-3p 診斷心肌纖維化的AUC 值為0.961，臨界值取4.61 時診斷價值最高，敏感度為92.45%，特異度為87.76%，提示miRNA-223-3p 可作為心肌纖維化的血清學(xué)生物標(biāo)志物。進(jìn)一步進(jìn)行多因素Logistic 回歸分析，結(jié)果顯示，miRNA-223-3p﹥4.61 是冠心病患者發(fā)生心肌纖維化的獨立危險因素。上述結(jié)果表明，miRNA-223-3p與心肌纖維化存在顯著的相關(guān)性，臨床上可通過該項指標(biāo)的檢測判斷冠心病是否發(fā)生心肌纖維化。

本研究還對冠心病患者的血清CRP水平進(jìn)行檢測，評估其炎癥水平，發(fā)現(xiàn)合并心肌纖維化患者炎癥水平明顯高于無心肌纖維化者，且CRP﹥7.53mg/L 是冠心病患者發(fā)生心肌纖維化的獨立危險因素。上述結(jié)果提示冠心病患者的炎癥反應(yīng)也會影響到心肌纖維化的發(fā)生，而miRNA-223-3p對炎癥反應(yīng)有抑制作用，因此冠心病患者炎癥水平越高其在血清中代償性增高，發(fā)生心肌纖維化的可能性越大。部分研究發(fā)現(xiàn)[11,12]，miRNA-223與冠心病的危險因素（血脂異常、吸煙、糖尿病）存在一定的關(guān)聯(lián)性，但本研究結(jié)果顯示，兩組患者在吸煙史、糖尿病史、血脂水平等方面比較，差異不顯著，分析原因可能與病例選擇偏倚有關(guān)，今后可擴(kuò)大病例入選范圍和樣本量進(jìn)一步展開研究。

Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原是較為常見的血清纖維化指標(biāo)，Ⅰ型膠原增生可導(dǎo)致心肌僵硬度增加，Ⅲ型膠原伸展回彈性較大，過度增生導(dǎo)致膠原纖維強(qiáng)度降低，心肌組織往往不能承受較大的血液動力學(xué)壓力，因此易發(fā)生梗死區(qū)的變薄和延伸，需早期干預(yù)Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原的過度增生[13,14]。MMP-9 作為一種鋅依賴的金屬蛋白內(nèi)切酶家族中的一員，參與降解多種ECM 成分，調(diào)節(jié)MMP-9的表達(dá)可對抗心肌纖維化的發(fā)生[15]。因此本研究選擇上述血清纖維化指標(biāo)進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)合并心肌纖維化者血清Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、MMP-9水平明顯更高，而Pearson 相關(guān)分析結(jié)果顯示，102例冠心病患者血清miRNA-223-3p水平與各項血清纖維化指標(biāo)均呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)。此結(jié)果再次驗證了miRNA-223-3p與心肌纖維化的相關(guān)性，冠心病患者心肌纖維化程度越嚴(yán)重則其在血清中表達(dá)越高，可作為反映心肌纖維化程度的指標(biāo)在臨床應(yīng)用。

綜上所述，冠心病患者血清miRNA-223-3p水平對心肌纖維化有較高的診斷價值，可反映心肌纖維化程度，該指標(biāo)聯(lián)合血清Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、MMP-9水平變化可作為心肌纖維化的生物標(biāo)志物用于評估病情嚴(yán)重程度，但miRNA-223-3p參與調(diào)控心肌纖維化的機(jī)制尚需進(jìn)一步的研究。