Nrf2/HO-1/NQO1在干眼癥患者結(jié)膜上皮細胞及淚液中的表達及意義

羅志強，張紅升，熊瑩

（河南醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校附屬醫(yī)院，河南 新鄭 451191）

干眼癥是一種較常見的眼病[1]，臨床癥狀主要表現(xiàn)為眼部干澀、有異物感、眼疲勞、視覺模糊、畏光、視覺質(zhì)量下降等，發(fā)病率較高，且多發(fā)于中老年婦女。目前干眼癥的臨床檢查一般靠患者主訴和查閱病史[2]，缺乏具有特異性的檢查方法。核轉(zhuǎn)錄因子E2 相關(guān)因子2[3]（Nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2）是一種轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控氧化應(yīng)激反應(yīng)，保護細胞；血紅素加氧酶1（Heme oxygenase 1,HO-1）[4]、醌氧化還原酶1[5]（Quinone oxidoreductase 1,NQO1）是內(nèi)源性抗氧化物，同時抗氧化物的表達水平受到抗氧化反應(yīng)元件（Antioxidant response element,ARE）調(diào)控，而ARE 可與Nrf2 形成Nrf2/ARE 信號通路，在機體的抗氧化反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，進而有望為抗氧化藥物的特殊靶點。故本研究通過分析Nrf2/HO-1/NQO1在干眼癥患者結(jié)膜上皮細胞及淚液中的表達及意義，旨在為干眼癥的臨床治療藥物提供較新的思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年7 月-2020年7 月于本院眼科收治的110例干眼癥患者為研究組，另征集30例眼科體檢正常的健康志愿者為對照組，其中研究組男49例98 眼、女61例122 眼，平均年齡40.34±9.70 歲，病程19.34±3.70 月；對照組男11例22 眼、女19例38 眼,平均年齡42.56±10.45歲,病程18.40±4.25 月，兩組性別、眼別、年齡、病程等組間一般資料比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）,研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準。

納入標準：⑴符合臨床上干眼癥的診斷標準[6]；⑵接受干眼癥檢查[7,8]，淚液分泌試驗：測定結(jié)膜刺激后反射淚液、基礎(chǔ)淚液的總和，＜5mm/5min 為強陽性，＜10mm/5min 為陽性；淚膜破裂時間：＜10s為異常；角膜熒光素染色：角膜上皮、結(jié)膜著色點8個以上為陽性，4～8 個為可疑。三項檢查兩項陽性可診斷為干眼癥；⑶所有患者及志愿者對研究了解知情，自愿加入，并簽署知情同意書。排除標準：⑴有眼部手術(shù)、角膜移植史；⑵近期內(nèi)患眼部活動性炎癥；⑶合并其他重癥疾病、代謝性疾??；⑷患有精神類疾??；⑸拒絕接受研究，無法配合檢查。

1.2 方法 所有確診患者均接受聚乙烯醇滴眼液（湖北遠大天天明制藥公司，國藥準字H20046681）治療，每次1 滴，4 次/d，2 周一個療程。

結(jié)膜上皮細胞采集、檢測：經(jīng)兩組研究對象知情同意后，使用刀片刮取兩組上瞼結(jié)膜，采集完畢后即刻放入凍存管，低速離心，低溫凍存，淚液收集、檢測：分別于治療前后兩組研究對象的下瞼部1/3 處放置試紙，試紙與眼瞼部貼緊，患者緩慢閉眼，5min 睜眼后將試紙取出，放于離心管內(nèi)，-70℃保存。淚液分泌試驗：使用鑷子將淚液檢測紙取出，叮囑患者向上方注視，置于下瞼結(jié)膜囊1/3 交界處，另一端垂掛于下瞼部，患者閉眼，5min 后取出濾紙，2min 后記錄濾紙濕長；淚膜破裂時間：患者休息半小時后，將結(jié)膜囊熒光素試紙染色后，叮囑患者瞬目數(shù)次，使用鈷藍光觀察患者睜眼到角膜表明出現(xiàn)第一個破裂點的時間，連續(xù)測量3 次，取平均值；角膜熒光素染色：將角膜分為4 個象限,無著色記0 分，少量著色記1 分，多量著色記2 分,片狀著色記3 分，每個象限0-3 分，共0-12 分。

Nrf2/HO-1/NQO1蛋白表達：將上述組織加入細胞裂解液，使用蛋白提取試劑盒對蛋白進行提取，并使用蛋白檢測試劑盒檢測蛋白純度。取30g蛋白,凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜,封閉經(jīng)TBST 清洗后，分別將Nrf2 兔單克隆IgG 抗體、HO-1兔單克隆IgG 抗體、NQO1 兔單克隆IgG 抗體（Abcam 公司提供）按稀釋比例1/600、1/800、1/1200 加入,4℃孵育徹夜，TBST 清洗后加入二抗，孵育2h 后清洗3 次，采用ECL 暗室顯影，利用分析軟件quantity one對蛋白印跡進行分析，獲得Nrf2/HO-1/NQO1 相對蛋白表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析，計量資料用（）表示，組間比較用t 檢驗，多組間比較采用（one way-ANOVA）單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q 檢驗；計數(shù)資料用百分率（%）表示，組間比較用χ2檢驗，采用pearson 法分析Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達水平與干眼癥患者眼表功能之間的相關(guān)性，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組結(jié)膜上皮細胞Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達比較 結(jié)果顯示，研究組治療前、治療后2 周和對照組結(jié)膜上皮細胞的Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；其中研究組治療前結(jié)膜上皮細胞的Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達水平低于治療后2 周和對照組（P＜0.05），研究組治療后2 周與對照組結(jié)膜上皮細胞的Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 兩組結(jié)膜上皮細胞Nrf2/HO-1/NQO1蛋白表達水平比較()

表1 兩組結(jié)膜上皮細胞Nrf2/HO-1/NQO1蛋白表達水平比較()

2.2 兩組淚液Nrf2/HO-1/NQO1蛋白表達比較 結(jié)果顯示，研究組治療前、治療后2 周和對照組淚液的Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達水平比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；其中研究組治療前淚液的Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達水平低于治療后2 周和對照組（P＜0.05），研究組治療后2 周與對照組淚液的Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 兩組淚液Nrf2/HO-1/NQO1 相對蛋白表達水平比較（）

表2 兩組淚液Nrf2/HO-1/NQO1 相對蛋白表達水平比較（）

2.3 患者治療前后眼表功能比較 結(jié)果顯示，治療后患者的淚液分泌試驗水平、淚膜破裂時間均高于治療前,角膜熒光素染色數(shù)低于治療前（P＜0.05）,見表3。

表3 患者治療前后眼表功能比較（）

表3 患者治療前后眼表功能比較（）

2.4 Nrf2/HO-1/NQO1表達水平與眼表功能相關(guān)性分析 結(jié)果顯示，Nrf2表達水平與淚液分泌試驗水平、淚膜破裂時間呈正相關(guān)（r=0.390,P=0.031；r=0.347,P=0.037）；HO-1表達水平與淚液分泌試驗水平、淚膜破裂時間呈正相關(guān)（r=0.386,P=0.035；r=0.318,P=0.042）；Nrf2、HO-1表達水平與角膜熒光素染色數(shù)無明顯相關(guān)性（P＞0.05）；NQO1表達水平與淚液分泌試驗水平、淚膜破裂時間、角膜熒光素染色數(shù)均無明顯相關(guān)性（P＞0.05），見圖1。

圖1 Nrf2/HO-1/NQO1表達水平與眼表功能相關(guān)性分析

圖2 由上至下，依次為Nrf2、HO-1和NQO1的Western blot 結(jié)果

圖3 從左至右，依次為患者結(jié)膜上皮細胞Nrf2、HO-1和NQO1的表達情況

3 討論

干眼癥的傳統(tǒng)定義是指因淚液質(zhì)量異常引發(fā)淚膜不穩(wěn)定、眼表損害,導(dǎo)致眼部不適的一類疾病，然而近年來由于干眼癥病因較多[9,10],如年齡、炎癥、角膜接觸鏡的配戴以及自身免疫疾病等因素，導(dǎo)致其發(fā)病機制較為復(fù)雜。研究表明[11]，機體長期暴露于氧化應(yīng)激環(huán)境可產(chǎn)生大量自由基,從而對細胞脂質(zhì)、結(jié)構(gòu)等造成損害，機體的抗氧化功能隨之降低，干眼癥、青光眼、白內(nèi)障等成為多發(fā)病。Nrf2 是抗氧化應(yīng)激反應(yīng)通路的重要蛋白,也是轉(zhuǎn)錄因子家族中最具活力的因子,多表達在肝、腎和解毒器官，同時也在皮膚等經(jīng)常處于暴露環(huán)境的組織有所表達。HO 是血紅素分解代謝過程的催化酶，具有啟動和限速作用，HO-1 是其中的誘導(dǎo)型,能將血紅素分解為一氧化碳和膽綠素,有研究證實一氧化碳在抗細胞凋亡、血小板聚集中起到重要作用[12]。另外HO-1 還可通過血紅素的分解產(chǎn)物發(fā)揮抗炎、抗氧化等功能。而當機體產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)的時候[13],Nrf2 可通過與ARE蛋白作用,促進HO-1、NQO1等抗氧化蛋白表達，對組織器官起保護作用。本研究分析干眼癥患者Nrf2、HO-1、NQO1的表達，有助于推進干眼癥患者免疫調(diào)節(jié)機制的相關(guān)研究，對臨床上干眼癥的治療有重要意義。

郭沖[14]在Nrf2/ARE 信號通路的相關(guān)研究中表明，可通過激活Nrf2/ARE 信號通路促進下游Ⅱ相解毒酶及抗氧化酶的表達，進而較好地減輕氧化應(yīng)激損傷。本次研究結(jié)果顯示，研究組治療前結(jié)膜上皮細胞、淚液的Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達水平低于治療后2 周和對照組，研究組治療后2 周與對照組的Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示干眼癥患者結(jié)膜上皮細胞、淚液的Nrf2、HO-1、NQO1蛋白異常表達，推測可能是干眼癥患者的Nrf2/ARE 信號通路出現(xiàn)異常，從而導(dǎo)致其調(diào)控的抗氧化蛋白表達異常，因而抗氧化應(yīng)激作用受到抑制，患者的抗氧化功能降低，機體氧化應(yīng)激損傷增加而產(chǎn)生干眼癥。

另外，本研究對患者治療前后的眼表功能進行檢查，發(fā)現(xiàn)治療后患者的淚液分泌試驗水平、淚膜破裂時間均高于治療前，角膜熒光素染色數(shù)低于治療前，提示經(jīng)治療后患者的眼表功能得到較好改善。同時，在Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達水平與眼表功能的相關(guān)性研究中，發(fā)現(xiàn)Nrf2、HO-1表達水平與淚液分泌試驗、淚膜破裂時間呈正相關(guān)，與角膜熒光素染色無明顯相關(guān)性，而NQO1與淚液分泌試驗水平、淚膜破裂時間、角膜熒光素染色數(shù)均無明顯相關(guān)性，提示Nrf2、HO-1蛋白表達水平與眼表功能具有較好的相關(guān)性，至于NQO1與眼表功能無相關(guān)性，造成這一結(jié)果，可能是NQO1作為自然存在的蛋白，Nrf2通路未被激活時也有一定的表達，因而可通過除Nrf2 抗氧化應(yīng)激反應(yīng)通路以外其他通路進行轉(zhuǎn)錄，曹會敏、倪靜[15]等人研究支氣管上皮細胞Nrf2、NQO1的表達中，亦得出類似結(jié)論。

綜上所述，干眼癥患者結(jié)膜上皮細胞、淚液的Nrf2、HO-1、NQO1蛋白均表達異常，其中Nrf2、HO-1表達水平與眼表功能均有良好的相關(guān)性，臨床上可為干眼癥的發(fā)病機制與藥物治療貢獻較新的思路。