高血糖及血糖波動對糖尿病小鼠甲狀腺激素的影響及機制

吳菲，葉鵬，杜宏

（1.南陽市中心醫(yī)院內(nèi)分泌科，河南 南陽 473000；2.南陽市中心醫(yī)院乳腺外科，河南 南陽 473000；3.東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院內(nèi)分泌科，江蘇 南京 210000）

隨著對糖尿?。―M）研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)糖尿病患者體內(nèi)的甲狀腺激素（TH）的分泌也存在異常情況，其中以游離三碘甲狀腺原氨酸（FT3）水平下降最為常見[1]。研究[2,3]認(rèn)為甲狀腺激素水平低下，尤其是FT3 下降與糖尿病腎?。―KD）的不良預(yù)后密切相關(guān)。因此，DM患者的甲狀腺激素異常越來越受到人們的關(guān)注。

高血糖是糖尿病患者的主要臨床特征。HbA1c的代謝周期長于甲狀腺激素的代謝周期，因此可較好地反映一段時間內(nèi)血糖對甲狀腺激素水平的影響。既往研究指出，持續(xù)高血糖即血糖控制不佳的T2DM患者T3水平下降,待血糖控制良好后，T3逐漸上升[4]。盡管HbA1c與DM 并發(fā)癥具有密切的關(guān)系,但它只能解釋部分糖尿病并發(fā)癥風(fēng)險變化,以HbAlc 作為血糖控制唯一指標(biāo)并不能有效減少糖尿病患者并發(fā)癥發(fā)生的風(fēng)險[5]。目前已有越來越多的研究[6]表明血糖波動可能為獨立于HbAlc的糖尿病慢性并發(fā)癥的危險因素。血糖波動性又稱血糖變異性，是指血糖水平在其波峰和低谷之間變化的不穩(wěn)定狀態(tài)[7]。岳欣等[8]在臨床中發(fā)現(xiàn)初診T2DM患者存在T3、FT3水平下降，rT3水平上升，且與血糖波動情況有關(guān)。說明DM患者的甲狀腺激素異常不僅與高血糖有關(guān)，與血糖波動也有著密不可分的關(guān)系。

因此，文章旨在通過動物實驗分析持續(xù)高血糖及血糖波動與甲狀腺激素的關(guān)系及其機制，從而來填補有關(guān)這一方面研究的空缺。

2 材料與方法

2.1 材料 清潔級6～8 周齡C57 雄性小鼠34 只，體重20～24g，由常州卡文斯實驗動物有限公司提供，采用SPF 級屏障系統(tǒng)小鼠實驗飼養(yǎng)室飼養(yǎng)，許可證號為SCXK（蘇）2016-0010。小鼠飼養(yǎng)籠中給予充足的水和飼料，自由進食。小鼠常規(guī)飼料由東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院動物實驗中心提供，普通胰島素注射液由美國禮來公司提供。鏈脲佐菌素（STZ）購于美 國sigma公司。FT3、FT4、TSH 試劑盒及小鼠HbA1c、ID1 ELISA 試劑盒均購于廈門慧嘉生物有限公司。0.1mol/l 檸檬酸鈉緩沖液配制：將2.10g 檸檬酸加入雙蒸水100ml 配成檸檬酸母液，稱為A液；將2.94g 檸檬酸二鈉加入雙蒸水100ml 配成檸檬酸鈉母液，稱為B 液；將A 液和B 液按1:1的比例混合，然后稀釋為100ml。STZ 溶液配制：將STZ溶于0.1mol/l的檸檬酸鈉緩沖液中，新鮮配制成濃度為10mg/ml的溶液。避光配制，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.2 方法

2.2.1 動物分組與建模 所有小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)兩周后隨機分為模型組22 只，對照組（C 組）12 只。糖尿病小鼠模型：模型組小鼠禁食不禁水12h 后（晚上9 點禁食，早上9 點注射STZ），尾靜脈測空腹血糖，稱體重，然后按50mg/kg/d 腹腔注射STZ，再繼續(xù)禁食2 小時，連續(xù)注射五天。對照組給予同等量的檸檬酸鈉緩沖液腹腔注射。一周后模型組小鼠隨機血糖均超過16.7mmol/l，DM 模型造模成功。血糖波動小鼠模型：將模型組小鼠分為持續(xù)高血糖組（D 組）10 只及血糖波動組（DF 組）12 只，血糖波動組小鼠每日09：00 腹腔注射葡萄糖注射液2g/kg，注射葡萄糖0.5h 后，血糖達(dá)到峰值，此時注射胰島素0.5u-1u，血糖在1.5h 內(nèi)降至最低值，14：00時血糖恢復(fù)到注射葡萄糖前其血糖水平，一天內(nèi)形成一次高峰與低谷。造模期間隨機監(jiān)測小鼠的血糖，血糖較低或偏高時立即給予適量的葡萄糖或胰島素。D 組和C 組則給予腹腔注射等體積的生理鹽水。在造模六周后尾靜脈采血測全天（8:00、8:30、10:00、14:00、14:30、16:00、20:00）血 糖，分 別計算三組小鼠血糖水平標(biāo)準(zhǔn)差（SD）及平均血糖波動幅度（MAGE）。

2.2.2 生化指標(biāo)檢測 六周末監(jiān)測全天血糖后禁食12h,于次日處死小鼠，處死前尾靜脈檢測空腹血糖及稱量體重，內(nèi)眥取血后離心得血清，使用小鼠FT3、FT4、TSH 試劑盒檢測甲狀腺激素水平，小鼠HbA1c 試劑盒檢測其糖化血紅蛋白，麻醉后取肝臟組織，勻漿后取上清，小鼠ID1 試劑盒檢測肝臟組織的ID1 活性。

2.2.3 統(tǒng)計分析 采用SPSS23.0 軟件統(tǒng)計分析。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間較采用單因素Anova 檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 三組小鼠的一般特征 D 組與DF 組小鼠精神狀態(tài)差，反應(yīng)遲鈍，活動減少，失去光澤，脫發(fā)和煩渴，多尿和多食的癥狀均較明顯。三組間小鼠體重差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

3.2 三組小鼠血糖水平和血糖波動參數(shù)的比較六周造模期間，每周末監(jiān)測三組小鼠全天血糖，并分別計算平均值，可以看出，DF 組小鼠的血糖在8:30 時升至最高水平，在10:00 降至最低水平，14:00血糖恢復(fù)至初始水平，血糖在1 天內(nèi)形成了明顯的高峰和低谷。與DF 組相比，D和C 組小鼠的血糖變化趨勢則相對平穩(wěn)，見圖1。

圖1 三組小鼠血糖波動情況

同時，與C 組相比，D 組小鼠的HbA1c水平明顯升高，而DF 組的HbA1c與C 組相比無顯著性差異。DF 組和D 組小鼠血糖標(biāo)準(zhǔn)差（SD）和平均血糖波動幅度（MAGE）均明顯高于C 組，DF 組與D組相比，SD和MAGE水平也明顯升高，見表1。

表1 三組小鼠一般特征的比較

3.3 三組小鼠甲狀腺激素水平的比較 D和DF 組小鼠與C 組相比，F(xiàn)T3水平均明顯降低，各組間FT4和TSH水平無顯著差異；D 組與DF 組相比，各項甲狀腺激素指標(biāo)均無明顯變化，見表2。

表2 三組小鼠甲狀腺激素水平的比較

3.4 三組小鼠肝臟ID1水平的比較 DF 組和D 組小鼠ID1 均低于C 組（P＜0.01）；D 組、DF 組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表3。

表3 三組小鼠肝臟ID1水平的比較

4 討論

目前關(guān)于糖尿病小鼠造模有多種方法,在此研究中,我們通過給小鼠腹腔注射STZ 成功地導(dǎo)致了糖尿病狀態(tài)[9]，即模型組出現(xiàn)了明顯的多飲、多食、多尿癥狀，活動減弱，一般狀態(tài)較差。就血糖控制而言，D 組的HbA1c 最高，而DF 組與C 組沒有顯示出統(tǒng)計學(xué)差異,這是因為在制作血糖波動模型的過程中給DF 組小鼠注射了胰島素，因此，DF 組小鼠的糖化血紅蛋白水平控制在正常范圍內(nèi),但血糖波動水平明顯高于C 組。體內(nèi)血糖值在高峰與低谷之間波動的不穩(wěn)定狀態(tài)即為血糖波動,血糖波動幅度的增大可加重糖代謝的障礙[10]。目前評估血糖波動的指標(biāo)很多，包括MAGE、平均血糖（MBG）、SD 等，其中常用的指標(biāo)是SD、MAGE，均是評估血糖穩(wěn)定性的簡易參數(shù)。本研究通過監(jiān)測小鼠的全天血糖并使用Service[11]提出的方法計算得出MA GE、SD，發(fā)現(xiàn)三組小鼠的血糖波動幅度均有統(tǒng)計學(xué)差異,其中以DF 組小鼠的血糖波動最為明顯，說明通過錯時給予葡萄糖及胰島素的方法可以成功地建立血糖波動小鼠模型。

流行病學(xué)資料顯示，DM患者甲狀腺功能異常的發(fā)生率是非DM患者的2～3 倍[12],并且大多數(shù)D M患者的甲狀腺激素水平主要表現(xiàn)為FT3水平降低[13]。與既往研究結(jié)果一致，本實驗發(fā)現(xiàn)糖尿病小鼠具有明顯的低FT3 血癥，提示糖尿病狀態(tài)可導(dǎo)致小鼠甲狀腺激素異常，但對其機制目前說法不一。糖尿病已經(jīng)被認(rèn)為是一種炎癥性疾病，隨著患者體內(nèi)的白介素-1 (IL-1)、IL-6 等細(xì)胞因子的增多，影響了T3 等合成、轉(zhuǎn)運、釋放過程[14]。另外，也有人提出碘泵功能的障礙也可以導(dǎo)致甲狀腺功能紊亂。由此可見，糖尿病中甲狀腺激素的異?？赡苁嵌喾N因素綜合的結(jié)果。本文從動物實驗證實了糖尿病的甲狀腺激素異常的機制與肝臟脫碘酶的活性受到了抑制有關(guān)，并將其歸因于糖尿病的糖代謝紊亂[15]。根據(jù)其催化機制，反應(yīng)和抑制動力學(xué)及底物特異性不同，脫碘酶可以分為三種類型，即脫碘酶1,2,3型(ID1,ID2和ID3)[16]。其中，脫碘酶1（ID1）控制FT4 向FT3的轉(zhuǎn)化，從而提供血漿中大部分循環(huán)的FT3[17]。ID1 存在于許多組織中，包括肝臟，腎臟和甲狀腺，研究報道，肝臟中ID1 活性比其他組織大約高3 倍[18]。本研究發(fā)現(xiàn)D 組小鼠的肝臟ID1 活性較C 組明顯降低，而大部分T3 是來源于外周組織如肝臟的ID1對T4的脫碘轉(zhuǎn)化而來的[19]，因此進一步證實了高血糖[20]導(dǎo)致肝臟ID1 活性的下降是血清中FT3 下降的重要途徑之一。

同時，本研究還探究了血糖波動對小鼠甲狀腺激素及ID1 活性的影響，DF 組小鼠的FT3、ID1活性也較C 組有所下降，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，說明了血糖波動也可以抑制ID1 活性，從而抑制FT4 向FT3的轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致FT3 降低。此外，DF 組的HbA1c與C 組相比并沒有統(tǒng)計學(xué)差異，說明兩組之間只有血糖波動的差異，因此我們可以認(rèn)為即使控制了糖尿病小鼠的糖化血紅蛋白水平，血糖水平的波動仍然可以導(dǎo)致ID1 活性的降低和FT3水平的降低。

總之，本研究結(jié)果揭示，糖尿病小鼠的高血糖可通過抑制肝臟脫碘酶的活性使FT3水平降低，同時，即使控制了糖化血紅蛋白水平，血糖水平的波動仍然可以導(dǎo)致FT3水平的下降。