冠心病寒凝血瘀證動物模型的建立及評價

李馳坤，靳宏光，成光宇，歐喜燕，丁云錄，李曉兵

（長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，長春 130021）

冠心?。╟oronary heart disease，CHD）近些年來發(fā)病概率逐年升高，已成為嚴重危害人類生命健康安全的疾病。隨著人們生活水平逐漸提升，人們飲食結(jié)構(gòu)的變化，生活品質(zhì)的提高，高鹽高脂、缺乏運動的飲食與生活習慣使人們的血糖、血脂等指標嚴重超標，對心血管的損害越來越大，患病年齡也呈年輕化趨勢。中醫(yī)并無“冠心病”病名，依據(jù)患者的臨床癥狀和特征改變，眾多醫(yī)家認為冠心病中的穩(wěn)定型冠心病歸于“胸痹心痛”范圍，根據(jù)中醫(yī)理論，屬于以氣、血、陰、陽虛衰，以至于“君主之官”失于溫養(yǎng)為本，以寒凝、氣滯、血瘀、痰濁等痹阻心陽、阻滯心脈為標的本虛標實的證候，主要證候要素可以分為氣虛血瘀、氣滯血瘀、氣陰兩虛、痰瘀互結(jié)等[1-2]。冠心病的主要單一證素包括寒凝證、血瘀證兩種[3]，其中，寒凝血瘀證該復合因素，是冠心病心絞痛的證候分布組成中的主要部分[4]。

由于人的特殊性，我們無法直接在人體上進行藥物實驗。因此，在病證的模擬建型中，實驗動物就成為首要選擇[5]。楊雙杰[6]應(yīng)用高脂飼料和冠脈結(jié)扎結(jié)合的方式，喂養(yǎng)和處置自發(fā)性高血壓大鼠，成功制備出高血壓合并高血脂符合心梗的動物模型。王麗云[7]等采用豚鼠構(gòu)建寒飲伏肺的慢性咳嗽模型，先應(yīng)用環(huán)磷酰胺對豚鼠進行免疫抑制，再應(yīng)用卵蛋白和氫氧化鋁誘發(fā)致敏，接著在寒冷條件下進行冷食喂養(yǎng)。經(jīng)檢測豚鼠的咳嗽頻繁，氣道阻力明顯升高，肺組織病理學檢測符合寒飲伏肺證表現(xiàn)，確認該模型制備成功。李海洋等[8]發(fā)現(xiàn)，發(fā)病的GK 大鼠明顯存在糖尿病的臨床癥狀，另外糖尿病大血管病變的出現(xiàn)和高脂飲食關(guān)系密切，因此，采用了自發(fā)形成糖尿病和高脂飲食誘導結(jié)合的方法，制備出具有“氣陰兩虛”特點的大鼠模型。由此可展開大規(guī)模的基礎(chǔ)研究，探究疾病的產(chǎn)生及發(fā)展機制，以及制訂有效防治辦法，還可對防治措施進行檢驗，不斷重復，不時優(yōu)化，最終取得最佳治療方案。由此可見，動物可以代替人們作為實驗對象。且在人為的特定條件下進行重復試驗[9]。但對于目前動物模型的創(chuàng)建仍與臨床上的病證有著一定的差距，因此，本項目嚴格依據(jù)中醫(yī)對于胸痹心痛證寒凝血瘀證病因病機認識，在以往的研究基礎(chǔ)上，采取高脂飲食喂養(yǎng)、垂體后葉素制造缺血和寒冷因素刺激聯(lián)合的方法進行模型構(gòu)建，最終建立盡可能合乎臨床的寒凝血瘀證的大鼠模型。通過高脂飲食飼養(yǎng)大鼠，是構(gòu)建動脈粥樣硬化模型重要的方法之一[10]。在結(jié)合中醫(yī)典籍的指導下進行造模，這樣得出的模型也更加契合中醫(yī)學中寒凝血瘀證病因病機的特點，更充分地反映該疾病的本質(zhì)，并能夠從模型動物的體征、電生理學、血液生化學和病理學等多層次對模型進行綜合評價。

1 材料

1.1 動物 根據(jù)不同的模型的建立，選擇相適應(yīng)的動物來建立模型對實驗的成功至關(guān)重要[11]。選用正常的雄性SD 大鼠SPF 級40 只，體質(zhì)量（230 g±20）g，大鼠由長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責任公司提供，許可證號：SCXK（吉）2018-0007。

1.2 試劑與儀器 垂體后葉素注射液（6 U/2 mL，上海第一生化藥業(yè)有限公司，批號 160301）、1%戊巴比妥鈉（國藥集團化學試劑有限公司，批號T20111110），TXB2酶免試劑盒（美國 R&D Systems Inc，批號 20191002B），6-Keto-PGF1α酶免試劑盒（美國 R&D Systems Inc，批號 20191002B）。Powerlab/8sp生理信號收集系統(tǒng)（澳大利亞埃德公司），MC-142L歐姆龍電子體溫計（歐姆龍大連有限公司），BIO680酶標儀（美國伯樂公司），Biofuge Stratos 臺式高速低溫離心機（德國賀利氏公司）。

2 方法

2.1 動物分組 通過隨機數(shù)字表法將SD 大鼠分為對照組和模型組（寒凝血瘀證組），各20 只。

2.2 造模方法 將模型組大鼠分別獨立裝入小籠內(nèi)，置于帶有玻璃蓋的低溫冰柜內(nèi)，溫度為-15℃，持續(xù)放置1 h，之后再返回至20℃室溫，如此反復6 周時間，于第5 周第5 天給予垂體后葉素20 U/kg 腹腔注射，每日1 次，連續(xù)3 d。常規(guī)對照組在同樣的室溫條件下正常喂養(yǎng)。

2.3 觀察指標與測定方法 待上述實驗完成后，再予2 組大鼠的腹腔內(nèi)推注1%戊巴比妥鈉0.05 mL/kg，等大鼠徹底麻醉了以后，再檢測如下指標。

2.3.1 肛溫 將電子體溫計緩慢地插進到大鼠肛門約2 cm 處，等到數(shù)值穩(wěn)定以后，再讀取數(shù)據(jù)。

2.3.2 心電圖 記錄模型組造模后30 min 內(nèi)標Ⅱ?qū)?lián)心電圖，以J 點（QRS 波群的終點與ST 段交接處）位移來評價是否有心肌缺血產(chǎn)生，同時以PR 段為基線對J點的位移進行記錄，以J 點抬高或降低≥0.1 mV 視為發(fā)生心肌缺血[12]，同時記錄大鼠心率。

2.3.3 血TXB2、6-Keto-PGF1α測量 利用酶聯(lián)免疫法測定二者的含量，均按試劑盒指示檢測。

2.4 統(tǒng)計學方法 運用SPSS 17.0 軟件分析數(shù)據(jù)，以均數(shù)±標準差（）表示，使用t檢驗進行組間比較，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 2 組大鼠肛溫情況比較 見表1。

表1 2 組大鼠肛溫情況比較（，n =20） ℃

表1 2 組大鼠肛溫情況比較（，n =20） ℃

注：與造模前比較，# P ＜0.05；與對照組比較，△P ＜0.05

3.2 2 組大鼠心電圖情況比較 見表2。

表2 2 組大鼠心電圖情況比較（，n =20）

表2 2 組大鼠心電圖情況比較（，n =20）

注：與對照組比較，# P ＜0.05

3.3 2 組大鼠TXB2、6-Keto-PGF1α情況比較 見表3。

表3 2 組大鼠TXB2、6-Keto-PGF1α 情況比較（，n =20） pg/mL

表3 2 組大鼠TXB2、6-Keto-PGF1α 情況比較（，n =20） pg/mL

注：與對照組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01

4 討論

冠心病癥狀為氣短、胸悶、胸痛、心慌，其發(fā)病大多由寒邪侵襲、飲食失節(jié)、情志失調(diào)和勞累過度引起[13]。冠心病是現(xiàn)代社會多發(fā)疾病，其致殘率和致死率逐年升高，已造成了沉重的社會經(jīng)濟負擔[14]。近年來，在治療冠心病方面，中醫(yī)藥充分發(fā)揮特長，以辨證論治為根本，從多路徑、多環(huán)節(jié)、多靶點進行系統(tǒng)治療，獲得了較好的臨床療效。因此，對其進行更深層次的探索尤為必要，不僅從臨床方面，還要進行基礎(chǔ)研究，從而獲得最優(yōu)方案，提高療效，縮短病程，減少社會經(jīng)濟支出。動物模型的建立是冠心病基礎(chǔ)研究中的重要環(huán)節(jié)，如何規(guī)范化的建立既具備西醫(yī)疾病特點，又合乎中醫(yī)證候特征的模型，對于中醫(yī)藥的基礎(chǔ)研發(fā)具有重要意義。

中醫(yī)動物模型的證型建立需要借鑒現(xiàn)代科技方法，并與之結(jié)合，不能局限于單一的生理變化，要整體對實驗動物進行評估，從多角度，多方面進行觀察，才有利于中醫(yī)病證動物模型的成功建立。從整體、系統(tǒng)出發(fā)，有利于更加深入地理解中醫(yī)的傳統(tǒng)理論，從而逐漸深入探索出“證”的本質(zhì)[15-16]。

實驗動物模型的創(chuàng)建，原則上應(yīng)選取與人類構(gòu)造最為接近的動物[17]，如小豬是最佳選擇，因為小豬的心血管結(jié)構(gòu)和人類的最為相近，但由于實驗小豬價格相對較高，不易于實際應(yīng)用與實驗，而大鼠雖不如小豬和人類心血管結(jié)構(gòu)相近，但容易飼養(yǎng)，方便管理，檢驗測量相關(guān)指標也相對容易，故將大鼠作為本實驗的模型動物。

在該實驗動物模型的建立過程中，參考了胸痹心痛病寒凝血瘀證的診斷標準：胸痛如絞，時作時止，感寒痛甚，胸悶，氣短，心悸，面色蒼白，四肢不溫，舌質(zhì)淡紅，苔白，脈沉細或沉緊。但由于大鼠與人類有著差異，所以對于大鼠的證候確認通過以下方式：查超聲心動圖來反應(yīng)大鼠的是否有胸悶痛；觀測大鼠的呼吸來體現(xiàn)是否心悸氣短；用空調(diào)來調(diào)節(jié)溫度來觀察大鼠的胸悶痛是否與寒冷相關(guān)；因大鼠和人的差異，面色沒法收集，所以通過觀測大鼠足底圖像來代表面色；利用溫度計以測定四肢溫度；用舌面的顏色飽和程度來體現(xiàn)舌象變化；測量血管搏動強度來體現(xiàn)脈象情況。最后再結(jié)合大鼠的病理指標，建成完整的寒凝血瘀證型模型。冠脈造影[18]（CAG）是診斷冠心病的金標準，但是由于冠脈造影價格較高，所以也不作為動物模型建立的診斷標準。

J 點，位于QRS 波后，T 波之前，二者交界的地方，即ST段起始部，ST段的位移可反映心肌缺血的情況。寒性凝滯，使血脈收縮，氣血運行不暢，日久導致瘀血，因此出現(xiàn)J 點的位移，即ST 段的變化；寒性凜冽，易傷陽氣，心為人體之太陽，故首當其沖，心陽不足，失于溫煦，因此鼓動乏力，不僅心率減慢，更使氣血運行遲滯。

垂體后葉素[19]是一種從動物的腦垂體中提取的物質(zhì)，大量的垂體后葉素靜脈注射可引起冠狀動脈較長時間的強烈痙攣，同時還收縮全身小血管，加重外周負荷，增加心肌的耗氧量，導致急性心肌缺血，引起急性心絞痛發(fā)生。TXA2與PGI2的穩(wěn)定代謝產(chǎn)物是TXB2、6-Keto-PGF1α，故檢測TXA2和PGI2在體內(nèi)的含量與活性，只需測量TXB2和6-Keto-PGF1α含量水平即可[20]。TXA2與PGI2均由血管內(nèi)皮細胞合成并釋放，是一種血管活性物質(zhì)，TXA2能促進血管收縮和血小板聚集，PGI2則與之作用相反，在舒張血管的同時抑制血小板的聚集[21]，TXA2/PGI2的失衡被認為是血瘀證的特征之一[22]。

中醫(yī)認為，寒性收引，易傷陽氣，使血脈運行不暢通，進而出現(xiàn)瘀滯。《素問·調(diào)經(jīng)論篇》曰：“寒氣積于胸中而不瀉，不瀉則溫氣去，寒獨留，則血凝泣，凝則脈不通。”即闡明寒邪侵犯于人體胸部而不消散，寒邪留存，使血脈凝澀。本研究通過股靜脈注射較大劑量的垂體后葉素，使其冠脈收縮，再結(jié)合反復冷刺激法，構(gòu)建出寒凝血瘀證動物模型，通過測量肛溫降低、心率減慢等指標，反映出寒冷因素對大鼠體溫的影響；心電圖J點變化，符合急性心肌缺血心電圖的特點[23]，TXB2水平的顯著上升以及6-Keto-PGF1α的下降與血瘀證特點吻合。

綜上所述，應(yīng)用本方式可成功建立大鼠寒凝血瘀證模型，既具備西醫(yī)疾病的病理特點，又合乎中醫(yī)的證候特性，且客觀性強。