NEFA 對(duì)奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞凋亡因子基因表達(dá)的影響

付世新，邢菲菲，羅勝繽，曹一鳴，溫小慶，李美娟，羅春海

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶 163319）

胎衣不下（Retained fetal membranes，RFM）是奶牛臨床常見(jiàn)的繁殖障礙疾病之一，大多數(shù)研究將牛的胎衣不下定義為12 h 內(nèi)[1]。分娩后奶牛的發(fā)病率為10%～25%，一些規(guī)模較小、養(yǎng)殖環(huán)境差的牧場(chǎng)甚至可高達(dá)50%左右，且環(huán)境溫度高時(shí)發(fā)病率會(huì)增加[2]。目前已被證實(shí)，胎衣不下與子宮內(nèi)膜炎、乳腺炎、酮病等風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)[3]。胎衣不下會(huì)影響奶牛的生產(chǎn)和繁殖潛力，這給乳制品行業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。其帶來(lái)的負(fù)面影響包括子宮復(fù)舊的延遲、妊娠率下降、屢配不孕等。目前為止，對(duì)于奶牛胎衣不下的研究已經(jīng)深入到一定層次，涉及到了飼養(yǎng)管理、免疫調(diào)節(jié)、激素分泌、基因遺傳等多個(gè)方面，但是仍未能準(zhǔn)確的揭示胎衣不下發(fā)生的關(guān)鍵因素。胎膜排出的基礎(chǔ)是胎盤(pán)成熟，之后妊娠晚期胎盤(pán)結(jié)構(gòu)的變化，內(nèi)分泌以及免疫學(xué)變化共同作用，最終使胎盤(pán)中血流減少乃至消失，進(jìn)而使得子葉絨毛變小和塌陷，同時(shí)子葉與肉阜分離，最后經(jīng)過(guò)子宮的收縮，從而使胎盤(pán)及時(shí)分離和排出[4]。而胎盤(pán)成熟的標(biāo)志就在于母體胎盤(pán)與胎兒胎盤(pán)分離時(shí)上皮細(xì)胞的凋亡。Boos 等[5]研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)生胎衣不下的奶牛胎盤(pán)中，子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的凋亡數(shù)量顯著降低。

奶牛在圍產(chǎn)期易處于能量負(fù)平衡（negative energy balance，NEB）的狀態(tài)，此時(shí)儲(chǔ)存的體脂將以非酯化脂肪酸（non-esterified fatty acids，NEFA）的形式被動(dòng)員，導(dǎo)致血液中NEFA 的濃度增加。通過(guò)查閱資料得知，高濃度的NEFA 對(duì)動(dòng)物和人類(lèi)的生殖性能都有不利影響[6-7]；Swangchan-Uthai 發(fā)現(xiàn)產(chǎn)犢前最后7至10 d 的高濃度NEFA（>0.4 mM）與胎衣不下的風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)[8]；Ospina 則發(fā)現(xiàn)在圍產(chǎn)期期間，比起β-羥丁酸，NEFA 與胎衣不下的風(fēng)險(xiǎn)增加更為相關(guān)[9]，并且高濃度的NEFA 可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激從而使肝細(xì)胞凋亡[10]。故實(shí)驗(yàn)使用不同濃度的NEFA 刺激奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，來(lái)探討NEFA 是否通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡因子的表達(dá)來(lái)?yè)p傷子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，進(jìn)而影響胎衣不下的發(fā)生。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

棕櫚酸、硬脂酸、棕櫚油酸、油酸、亞油酸購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；RIPA 裂解液（強(qiáng)）、蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；青霉素-鏈霉素溶液、胰蛋白酶-EDTA 消化液購(gòu)自上海索萊寶公司；胎牛血清購(gòu)自四季青公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit、TB Green Premix Ex TaqTMII 購(gòu)自日本Takara 公司。

1.2 奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的培養(yǎng)

奶牛原代子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞是由本研究室鄭程遠(yuǎn)等[11]利用貼壁法分離培養(yǎng)的，經(jīng)過(guò)純化后，純度可達(dá)90%以上。該細(xì)胞10 代以?xún)?nèi)的細(xì)胞活性較好，10代以后細(xì)胞活性下降，傳代次數(shù)較多后細(xì)胞形態(tài)有所改變。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)都采取10 代以?xún)?nèi)的細(xì)胞。

細(xì)胞復(fù)蘇：凍存的細(xì)胞從液氮中拿出后迅速放入37 ℃水浴鍋中搖晃，遵循“慢凍速溶”原則。直至剩一小塊冰渣，拿出水浴鍋搖晃至完全融化。將細(xì)胞凍存液轉(zhuǎn)入15 mL 離心管，加入5 mL 含有血清雙抗的RPMI1640 培養(yǎng)液，4 min、1 000 g 離心后棄上清。加入新的培養(yǎng)液混勻細(xì)胞團(tuán)，然后按適當(dāng)比例將細(xì)胞接種至細(xì)胞培養(yǎng)皿中，放入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，次日換液，之后2 d 一傳代，準(zhǔn)備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 NEFA 的配置

配置10 mM 的NEFA 母液：取1.595 mM 棕櫚酸、0.72 mM 硬脂酸、0.265 mM 棕櫚油酸、2.175 mM油酸、0.245 mM 亞油酸，加到60 ℃預(yù)熱過(guò)的0.1 mM KOH 中，充分震蕩混勻，直至脂肪酸完全融化。取適量預(yù)熱過(guò)的1 M HCl 和超純水，加入到脂肪酸混合物中，調(diào)節(jié)其pH 為7.2。無(wú)菌條件下用0.22 μm 的濾器過(guò)濾分裝，-20 ℃保存，使用時(shí)用含3%白蛋白的培養(yǎng)液稀釋至工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.4 CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞活性

將子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞消化后按每孔2 萬(wàn)個(gè)細(xì)胞接種到96 孔板中，孔板外側(cè)一周的孔內(nèi)加入磷酸鹽緩沖溶液培養(yǎng)液防止在培養(yǎng)箱內(nèi)蒸發(fā)過(guò)多。培養(yǎng)約24 h 后，棄掉培養(yǎng)液，加入配置好的0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mM NEFA 加入96 孔板中，每個(gè)濃度5 個(gè)復(fù)孔，分別刺激12、24、48 h 后，棄掉舊液，加入含有10% CCK-8 試劑的無(wú)血清無(wú)雙抗培養(yǎng)液，再培養(yǎng)孵育1 h。將96 孔板放入酶標(biāo)儀中，選用450 nm測(cè)定OD 值，并根據(jù)公式：細(xì)胞活性=100%×［（實(shí)驗(yàn)組OD-空白組OD）/（對(duì)照組OD-空白組OD）］，計(jì)算細(xì)胞活性。

1.5 總RNA 的提取

實(shí)驗(yàn)中所有耗材皆為無(wú)RNA 酶耗材，在冰上操作。將子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞消化后，按每孔25 萬(wàn)個(gè)細(xì)胞接種于6 孔板中，1.2 mM NEFA 刺激細(xì)胞12 h后，取TRizol 加入到實(shí)驗(yàn)孔中，每孔1 000 μL。裂解5 min 后吸取液體到EP 管中，每管加入200 μL 的氯仿，劇烈震蕩混勻，4 ℃、12 000 g 離心10 min。小心吸取上層水相至新的EP 管中，加入200 μL 異丙醇，靜置10 min 后4 ℃、12 000 g 離心10 min。棄上清，往管中沉淀加入75%的酒精，輕輕上下混勻，4 ℃、7 500 g 離心5 min。棄上清后再4 ℃、7 500 g 離心5 min，用槍頭吸取殘余的液體，最后晾干EP 管。往管中加入30 μL 的DEPC 水，拿去測(cè)定RNA 濃度。

1.6 qRT-PCR

使用PrimeScriptTMRT reagent Kit 將RNA 反轉(zhuǎn)錄成為cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系見(jiàn)表1。將配置好的體系放入PCR 儀中，37 ℃15 min、85 ℃5 s，4 ℃冷卻。得到產(chǎn)物-20 ℃保存。引物設(shè)計(jì)和購(gòu)買(mǎi)來(lái)自上海生工生物工程有限公司，使用β-actin 為內(nèi)參，qRT-PCR 法檢測(cè)凋亡因子caspase 3、caspase 8、Bcl-2、Bax 的基因相對(duì)表達(dá)量，引物序列見(jiàn)表2，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃30 s，95 ℃5 s、60 ℃30 s、39 個(gè)循環(huán)；95 ℃10 s、melt curve 65 ℃to 95 ℃。2-△△ct法分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

表1 反轉(zhuǎn)錄體系Table 1 The system of reverse transcription

表2 引物序列Table 2 The primer sequences of the genes

1.7 數(shù)據(jù)分析

結(jié)果為平均數(shù)±SEM 表示，使用SPSS 26.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（ANOVA 分析），qRT-PCR 結(jié)果用獨(dú)立樣本T 檢驗(yàn)分析顯著性，“*”為差異顯著（P＜0.05），“**”為差異極顯著（P＜0.01）。

2 結(jié)果與分析

2.1 CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

不同濃度NEFA 刺激子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞后，各個(gè)濃度下的OD 值如表3 所示：

表3 NEFA 處理子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞后的吸光度Table 3 Absorbance of endometrial epithelial cells treated with NEFA

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪制不同濃度的NEFA 對(duì)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞活性影響的圖，如圖1 所示，隨著NEFA濃度的升高，細(xì)胞活性先是小幅度的升高，然后下降，再小幅度的升高，之后隨著濃度的升高細(xì)胞活性急劇的下降。在NEFA 濃度為1.2 mM 時(shí)，三個(gè)不同的時(shí)間處理組的細(xì)胞活性均顯著下降（P＜0.05），而12 h 的細(xì)胞活性大于80%，24 h、48 h 時(shí)的細(xì)胞活性小于80%。有研究表明[12]，圍產(chǎn)期奶牛體內(nèi)NEFA 濃度平均為0.2～0.7 mM 左右，公認(rèn)的妊娠末期NEFA含量的上限為0.4 mM，故本實(shí)驗(yàn)接下來(lái)選擇0.2 mM為低濃度組、1.2 mM 為高濃度組，12 h 作為NEFA 的刺激時(shí)間。

圖1 不同濃度NEFA 處理子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞不同時(shí)間后的細(xì)胞活性Fig.1 Cell viability of endometrial epithelial cells treated with different concentrations of NEFA for different time

2.2 qRT-PCR 結(jié)果

如圖2 所示，與對(duì)照組（NEFA 為0 mM）時(shí)相比，NEFA 在低濃度0.2 mM 時(shí)對(duì)細(xì)胞內(nèi)caspase-3、caspase-8、Bcl-2、Bax 的基因表達(dá)無(wú)顯著影響，而NEFA在高濃度1.2 mM 時(shí)，極顯著上調(diào)促凋亡基因caspase-3、caspase-8、Bax 的mRNA 表達(dá)（P＜0.01），顯著下調(diào)Bcl-2 的mRNA 表達(dá)（P＜0.05）。

圖2 NEFA 對(duì)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞caspase-3、caspase-8、Bcl-2、Bax 基因表達(dá)的影響Fig.2 The effect of NEFA on the expression of caspase-3，caspase-8，Bcl-2 and Bax genes in endometrial epithelial cells

3 討論

奶牛胎盤(pán)組織在妊娠晚期、分娩、胎盤(pán)分離和排出過(guò)程中發(fā)生一系列變化，包括細(xì)胞凋亡、細(xì)胞外基質(zhì)重塑、免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)等，這些過(guò)程中的任何一個(gè)異?，F(xiàn)已都被證實(shí)與胎衣不下的發(fā)生有關(guān)[13]。胎衣不下發(fā)病機(jī)理中目前比較認(rèn)可的就是胎盤(pán)成熟假說(shuō)，而胎盤(pán)的成熟依賴(lài)于母體和胎兒上皮細(xì)胞的低增殖和高凋亡。與妊娠期間相比，胎兒分娩后母體和胎兒上皮細(xì)胞中細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)因子的大量積累，表明細(xì)胞凋亡在正常分離和排出胎盤(pán)的過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用[14]。凋亡的主要調(diào)節(jié)因子包括Fas、細(xì)胞表面死亡受體、Bcl2 家族蛋白和半胱氨酸蛋白酶（caspases）。Fas 是腫瘤壞死因子受體超家族的成員，當(dāng)其配體被激活時(shí)，F(xiàn)as 會(huì)啟動(dòng)受體細(xì)胞的凋亡程序，caspase-8 通過(guò)兩種途徑對(duì)Fas 作出反應(yīng)：高濃度的活性caspase-8 可以直接作用于下游的caspases，例如caspase-3，從而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡。但是，如果caspase-8 含量低，則通過(guò)BID（Bcl2 家族的促凋亡成員）間接促使凋亡，BID 促進(jìn)細(xì)胞色素C（CytochromeC，Cytc）入核，而最后激活caspase-8 促使細(xì)胞凋亡。在產(chǎn)犢后的幾個(gè)小時(shí)內(nèi)，胎盤(pán)中的Fas 的表達(dá)量增加，表明Fas-caspase-8-caspase-3 途徑在胎盤(pán)排出中起到一定的作用[14-16]。且國(guó)內(nèi)一些NEFA 對(duì)奶牛肝細(xì)胞損傷作用的研究中表明，高濃度的NEFA造成的肝細(xì)胞凋亡主要是通過(guò)激活c-Jun 氨基末端激酶和抑制細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶，由線粒體途徑介導(dǎo)活化caspase-3、caspase-9 和Bax 的mRNA 表達(dá)水平，顯著降低抗凋亡基因Bcl-2 的mRNA 表達(dá)水平。而從實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可得知，高濃度的NEFA 刺激奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)促凋亡基因caspase-3、caspase-8 和Bax 的mRNA 表達(dá)顯著上調(diào)，而抗凋亡基因Bcl-2 的mRNA 卻顯著下降，說(shuō)明NEFA 的確通過(guò)caspase 家族的一些因子誘導(dǎo)了子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的凋亡。

胎兒和母體上皮細(xì)胞的凋亡、膠原基質(zhì)的降解和免疫反應(yīng)后誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是胎盤(pán)成熟的必要前提。例如，在分娩時(shí)，宮頸中促炎細(xì)胞因子白介素-8、白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-10 的轉(zhuǎn)錄物的豐度比奶牛妊娠第185 d 至少高8 倍[17]。高濃度的NEFA 能夠激活NF-κB 增加促炎因子腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、IL-6 和IL-1β 的釋放，從而導(dǎo)致牛肝細(xì)胞的損傷[10]；NEFA 還可以通過(guò)Toll 樣受體4 信號(hào)通路來(lái)激活細(xì)胞的IκB 激酶，增強(qiáng)NF-κB 的轉(zhuǎn)錄活性，上調(diào)炎性因子IL-8、IL-6 和TNF-α 的mRNA 表達(dá)量，從而導(dǎo)致子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞損傷[18]。團(tuán)隊(duì)前期的研究發(fā)現(xiàn)，胎衣不下奶牛胎盤(pán)組織中基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP2）、MMP-9 的活性與胎衣正常排出的奶牛相比顯著升高[19]。而MMP-2 和MMP-9 在胎盤(pán)中膠原蛋白的降解有著重要的作用[20]。故NEFA 可能通過(guò)多方面影響胎衣不下的發(fā)生。

綜上所述，高濃度的NEFA 可以通過(guò)上調(diào)細(xì)胞凋亡因子的表達(dá)和抑制抗凋亡因子的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞凋亡，進(jìn)而影響胎衣不下的發(fā)生。但是NEFA 調(diào)控胎衣不下發(fā)生的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步的研究。