肉豬體內(nèi)組織和體液中多西環(huán)素含量的相關(guān)性研究

余軍軍 藍棋浩 寧軍 韋田 梁立杰 孫堅

摘 要：采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析法，對肉豬體內(nèi)組織（肌肉、肝臟、腎臟、肺臟）和體液（尿液、血液）中多西環(huán)素含量進行檢測，分析多西環(huán)素在豬體內(nèi)組織和體液中的殘留消除情況，探討多西環(huán)素在體液與各組織殘留量的相關(guān)性，并預測達到休藥期時體液中多西環(huán)素的含量范圍。結(jié)果表明，豬混飲多西環(huán)素后各組織中藥物代謝快，體液中藥物濃度低，休藥期為11 d，體液與各組織間藥物殘留量呈較高相關(guān)性。當尿液多西環(huán)素含量低于57.07 μg/L、血液低于2.76 μg/L時，預測99%動物體內(nèi)組織中多西環(huán)素殘留量低于最大殘留限量，為肉豬宰前監(jiān)測體內(nèi)多西環(huán)素殘留提供了一種簡單經(jīng)濟的方法。

關(guān)鍵詞：多西環(huán)素;豬;殘留消除;休藥期;宰前監(jiān)測

多西環(huán)素（Doxycycline，DOX）是由土霉素在6-位脫氧而制成的第二代半四環(huán)素衍生物，又名強力霉素或脫氧土霉素，由美國輝瑞制藥廠在上世紀60年代發(fā)明[1]。多西環(huán)素是廣譜抗生素，對腸球菌、肺炎球菌、沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、衣原體、支原體和立克次氏體等具有良好的抗菌效果[2]。因其在體內(nèi)具有分布廣、長效、高生物利用度和無明顯腎毒性等特點，臨床上廣泛應(yīng)用于豬、牛、雞和羊的養(yǎng)殖，以治療呼吸道、消化道和泌尿道的細菌性疾病。隨著多西環(huán)素在獸醫(yī)臨床上的使用，其殘留問題也越來越被重視。目前，國內(nèi)外對多西環(huán)素在動物體內(nèi)的殘留消除的研究已有很多，但對多西環(huán)素在體內(nèi)的殘留監(jiān)控主要用動物的可食用組織，尿液和血液中多西環(huán)素殘留的消除及殘留監(jiān)控較少[3-4]。本文通過計算多西環(huán)素在豬體內(nèi)的休藥期，并預測休藥期豬尿液和血液中藥物殘留量范圍，以探索尿液或血液樣品用于多西環(huán)素殘留監(jiān)控的可操作性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器設(shè)備

液質(zhì)聯(lián)用儀（QTRAP 5500，美國AB SCIEX公司）;組織勻漿機（HM6300，北京Lab Precition公司）;氮吹儀（MV5，北京萊伯泰科公司）;電子分析天平（BT125D，德國Sartorius公司）;冷凍高速離心機（5804R，德國Eppendorf公司）;C18固相吸附劑（月旭科技公司）;6cc/200 mg的固相萃取小柱（Oasis HLB，美國Waters公司）。

1.1.2 試劑

多西環(huán)素對照品，純度97.2%，批號1-F-4F4-1，美國CATO公司;多西環(huán)素-D3對照品，純度97%，批號T291402，加拿大TRC公司;甲醇、乙腈和甲酸均為色譜純，購于德國默克公司;正己烷、三氯乙酸為分析純，購于廣州化學試劑廠;鹽酸多西環(huán)素可溶性粉，獸藥字190172193，含量10%，批號20191004，購于河北遠征禾木藥業(yè)有限公司。

1.1.3 試驗動物的飼養(yǎng)與管理

選擇健康、體重相近的三元雜商品豬41頭（40.5±3.8） kg，隨機分成2組，分別為對照組1頭，試驗組40頭。試驗組在基礎(chǔ)飲水中添加鹽酸多西環(huán)素可溶性粉，制成多西環(huán)素濃度為50 mg/L的藥液，連續(xù)混飲給藥5 d。于停藥后第1 d、2 d、3 d、5 d、8 d、12 d、15 d和18 d隨機選擇5頭豬只，采集組織（肌肉、肝臟、腎臟、肺臟）和體液（尿液、血液）作為檢測樣品。

1.2 試驗方法

1.2.1 溶液配制

（1）多西環(huán)素儲備液（1 000 μg/mL）.準確稱取50.0 mg多西環(huán)素對照品，置于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻密封，置-20 ℃冰箱中保存。

（2）多西環(huán)素-D3儲備液（100 μg/mL）。準確稱取1.0 mg多西環(huán)素-D3對照品，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻密封，置-20 ℃冰箱中保存。

（3）三氯乙酸（1 mol/L）。準確稱取16.3 g三氯乙酸置于100 mL容量瓶中，加入超純水溶解并定容至刻度，搖勻。

1.2.2 樣品處理

（1）組織。稱取2.0 g勻漿后的組織樣品置于50 mL離心管中，加入50 μL內(nèi)標溶液（濃度5 μg/mL），靜置5 min。然后加入2 mL水、8 mL乙腈。渦旋混勻后，超聲提取10 min。然后室溫條件下4 000 r/min離心5 min，上清液倒入50 mL離心管中，加入500 mg C18吸附劑，渦旋30 s凈化。再重復離心1次，移取5 mL上清液在50 ℃水浴中氮氣吹干。殘渣中加入1 mL甲醇水（10︰90）、2 mL正己烷，渦旋30 s。室溫條件4 000 r/min下離心10 min，吸取下層過0.22 μm濾膜，待測。

（2）尿液：取5 mL尿液樣品于15 mL離心管中，并加入20 μL內(nèi)標溶液（濃度5 μg/mL），靜置10 min。將HLB萃取小柱固定在固相萃取裝置上，依次用5 mL甲醇、5 mL超純水活化后，倒入尿液樣品，用5 mL水、5 mL甲醇水（20︰80）淋洗，抽干，5 mL甲醇洗脫，收集洗脫液。洗脫液在在50 ℃水浴中氮氣吹干，殘渣用1 mL甲醇水（10︰90）溶解，渦旋30 s。樣品過0.22 μm濾膜，待測。

（3）血液。準確吸取500 μL血漿，依次加入20 μL內(nèi)標（5 μg/mL）、500 μL三氯乙酸溶液，渦旋混勻，10 000 r/min室溫條件下離心10 min，上清液過0.22 μm針頭濾膜，待上機。

1.2.3 儀器條件

（1）色譜條件：Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱

（2.1 mm ×50 mm，1.7 μm）;流速：0.25 mL/min;流動相：A為0.1%甲酸溶液，B為甲醇;梯度洗脫條件：0～2 min，5%～15% B;2～5 min，15%～40% B;5～7 min，40%～95% B;7～7.1 min，95%～5% B;7.1～12 min，5%。柱溫為35 ℃。進樣體積為10 μL。

（2）質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI）;多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）正離子模式;離子源溫度550 ℃;電噴霧電壓（IS）5.5 kV;氣簾氣壓力（CUR）、霧化氣壓力（GS1）及輔助氣壓力（GS2）分別為35 kPa、55 kPa和60 kPa。藥物優(yōu)化的去簇電壓和碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 組織中多西環(huán)素殘留消除規(guī)律

不同時間點各組織中多西環(huán)素殘留量見表2。結(jié)果顯示，10%多西環(huán)素可溶性粉按推薦劑量連續(xù)用藥5 d后，多西環(huán)素在肝臟和腎臟中的殘留含量最高，在肌肉、肺臟中的含量較低，停藥2 d后，多西環(huán)素在肌肉和肝臟的殘留量分別為（99.30±33.84）μg/kg和（104.51±29.20）μg/kg，均低于最高殘留量MRL[5]（肝臟300 μg/kg，肌肉100 μg/kg），停藥3 d后，腎臟中的多西環(huán)素殘留量為（350.28±136.12）μg/kg，低于了最高殘留量MRL（腎臟600 μg/kg）。多西環(huán)素主要殘留部位在腎臟，各組織中殘留消除的速度較快，在停藥后5 d，組織中均檢測不出多西環(huán)素。在停藥8 d采集的5頭豬血液中，只有1份樣品檢出多西環(huán)素。

2.2 休藥期計算

按照農(nóng)業(yè)部對多西環(huán)素最大殘留限量[5]和歐盟對休藥期計算方法，利用WT1.4軟件按雙單側(cè)99%置信區(qū)間計算多西環(huán)素在豬組織中休藥期[6]。由圖1可知，多西環(huán)素在肌肉中的休藥期為10.58 d、肝臟為10.80 d、腎臟為8.13d、肺臟為10.51 d，考慮到給藥方式等因素的影響，建議休藥期為11 d。

2.3 體液中多西環(huán)素殘留量相關(guān)性研究

通過統(tǒng)計學軟件SPSS，采用統(tǒng)計學軟件SPSS，對雙變量“停藥后體液中多西環(huán)素含量”“各組織中多西環(huán)素含量”進行相關(guān)性分析。由表3可知，停藥后體液中多西環(huán)素殘留量與各組織中多西環(huán)素殘留量之間的相關(guān)系數(shù)大于0.85，相關(guān)系數(shù)的顯著性水平為0.01，體液與各組織中多西環(huán)素殘留量之間是高度相關(guān)的。

2.4 組織中藥物殘留量低于MRL時體液中殘留量區(qū)間預測

使用SPSS軟件對時間-體液中藥物濃度進行線性分析，并根據(jù)建立的模型預測停藥為10.80 d時的體液中藥物濃度區(qū)間范圍。結(jié)果顯示，當時間為10.80 d時，即肉豬體內(nèi)組織中多西環(huán)素殘留量低于最大殘留限量時，尿液中藥物濃度區(qū)間范圍為57.07～252.12 μg/L;血液中藥物濃度區(qū)間范圍為2.76～28.68 μg/L。

3 結(jié)論與討論

目前，常用的動物體內(nèi)藥物殘留檢測方法包括微生物法、毛細管電泳法、酶聯(lián)免疫法、液相色譜法和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法等，其中液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法作為唯一確證方法應(yīng)用最多。龐國芳等[7]采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測了體內(nèi)各組織和體液中多西環(huán)素的殘留量，制定了該產(chǎn)品的休藥期為11 d，為藥物的臨床使用提供了數(shù)據(jù)支持。

劉欣[3]按體重10 mg/kg的劑量給予鹽酸多西環(huán)素顆粒，每天1次，連續(xù)5 d，研究多西環(huán)素在動物體內(nèi)的消除規(guī)律，結(jié)果顯示，停藥后第3天，除1頭豬肝臟組織中的殘留量高于MRL外，其他各組織中藥物的殘留量均低于MRL，同時計算休藥期為12 d[8-9]。而本試驗結(jié)果中，停藥后第3天，豬各組織中藥物殘留量均低于MRL，計算休藥期為11 d，翟克影[4]也做了相關(guān)研究，除了劑型和給藥方式不同，鹽酸多西環(huán)素在豬體殘留分布與消除結(jié)果基本相似。

在實際生產(chǎn)中，通過對豬活體尿液樣品的檢測，建立的回歸方程，可以間接判斷豬體內(nèi)多西環(huán)素殘留量是否低于最大殘留限量。20世紀末開始已有不少學者采用這種經(jīng)典回歸法來預測組織中藥物的殘留濃度，但在研究時均沒有考慮個體間差異，試驗的重復性較差[10]。本文根據(jù)停藥后尿液、血液中藥物消除情況，引入置信區(qū)間預測，考慮了個體間差異，通過計算發(fā)現(xiàn)當動物停藥時間到達休藥期時，尿液中多西環(huán)素殘留量區(qū)間下限為57.07 μg/L、血液為2.76 μg/L，表明可通過監(jiān)測體液中多西環(huán)素濃度判斷動物體內(nèi)組織中藥物殘留量是否安全。考慮到尿液樣品獲取更便捷，采取時動物應(yīng)激更小，動物屠宰前可檢測尿液判斷動物是否符合屠宰要求，判定限為57 μg/L。

參考文獻

[1]趙嬋娟.多西環(huán)素研究進展[J].湖北畜牧獸醫(yī)，2012（12）：10-14.

[2]操繼躍.豬呼吸系統(tǒng)感染性疾病藥物治療[J].養(yǎng)殖與飼料，2005（4）：39-43.

[3]劉欣，魏麗娟，瞿紅穎，等.鹽酸多西環(huán)素顆粒在豬體內(nèi)殘留消除的研究[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2017，539（23）：201-203.

[4]翟克影.鹽酸多西環(huán)素可溶性粉在豬體內(nèi)藥物動力學及殘留研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學，2008.

[5]中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部，國家衛(wèi)生健康委員會，國家市場監(jiān)督管理總局.食品安全國家標準 食品中獸藥最大殘留限量：GB 31650—2019[S].北京：中國標準出版社，2019.

[6]Nahler M.Committee for veterinary medicinal products （CVMP）[J].Springer Vienna，2009，296：9-10.

[7]龐國芳.獸藥多組分殘留分析技術(shù)[M].北京：科學出版社，2016.

[8]Chiesa L，Nobile M，Arioli F，et al.Determination of veterinary antibiotics in bovine urine by liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Food Chemistry，2015，185（15）：7-15.

[9]Junior L B，Leal M G，Uchoa F，et al.Determination of quinine and doxycycline in rat plasma by LC–MS–MS：Application to a pharmacokinetic study[J].Chromatographia，2011，73（11）：1081-1088.

[10]黃顯會，蔡勤仁，劉戎，等.克倫特羅在豬組織和尿液中殘留消除規(guī)律研究[J].動物毒物學，2003，18（1）：32-37.