菠蘿蜜AhSS2基因克隆及生物信息學預測

薛亞茹 李瑩 李映志

摘要蔗糖合成酶（ sucrose synthase，? SS）作為催化蔗糖代謝的關鍵酶之一，能夠參與蔗糖的代謝和運輸，調(diào)節(jié)細胞分化與細胞壁的形成，對調(diào)控作物的品質(zhì)和產(chǎn)量也有重要作用?？寺〕霾ぬ}蜜 AhSS2基因并對其進行生物信息學分析。菠蘿蜜 AhSS2基因的開放閱讀框（ open reading frame，? ORF）全長2436 bp，共編碼811個氨基酸，其蛋白理化性質(zhì)預測顯示，相對分子量是92.583 ku，等電點pI為5.77，屬親水性酸性蛋白質(zhì)，二級結構主要為 Alpha helix （α-螺旋）。保守結構域分析顯示，菠蘿蜜 AhSS2基因屬于 PLN00142超級家族成員，主要包括蔗糖合成酶結構域（ Sucrose_synth）與糖基轉移酶結構域（Glycos_transf_1）2個保守結構域。磷酸化位點預測顯示，菠蘿蜜 AhSS2基因蛋白的磷酸化位點主要是絲氨酸（ Ser）磷酸化位點。系統(tǒng)發(fā)育樹分析顯示，菠蘿蜜 AhSS2基因在分類上屬 SSⅡ。本研究為進一步研究菠蘿蜜蔗糖合成酶家族成員的功能提供依據(jù)。關鍵詞菠蘿蜜;蔗糖合成酶;生物信息學;系統(tǒng)進化分析

中圖分類號 S667.8 文獻標識碼 A? DOI：10.12008/j.issn.1009-2196.2021.12.015

Bioinformatics Prediction and Comparative Analysis of Jackfruit AhSS2 Gene

XUE Yaru? LI Ying? LI Yingzhi

（Coastal Agricultural College， Guangdong Ocean University， Zhanjiang， Guangdong 524000， China）

Abstract? Sucrose? synthase （SS） is? one? of? the? key? enzymes? catalyzing? sucrose? metabolism. It? can participate in sucrose metabolism and transportation， regulate cell differentiation and cell wall formation， and also play an important role in regulating crop quality and yield. Jackfruit AhSS2 gene was cloned and bioinformatic analysis was performed. The open reading frame （ORF） of jackfruit AhSS2 gene is full-length 2436 bp， encoding a total of 811 amino acids. The predicted relative molecular weight of the protein is 92.583ku， and the isoelectric point （Pi） is 5.77. It is a hydrophilic acidic protein and its secondary structure is mainly? alpha helix （α-Spiral）. The? conserved? domain? analysis? showed that the jackfruit AhSS2 gene belonged to a PLN00142 superfamily member， including two conserved domains： sucrose synthase domain （Sucrose_synth） and? glycosyltransferase? domain （glycos_ transf_1）. Prediction? of phosphorylation? sites showed that the phosphorylation sites of the jackfruit AhSS2 gene are mainly serine （Ser） phosphorylation sites. Phylogenetic tree analysis showed that the jackfruit AhSS2 gene belonged to SSII in classification. This? study? provides? a? basis? for? further? research? on? the? function? of jackfruit? sucrose? synthase? family members.

Keywords? jackfruit ; sucrose synthase ; bioinformatics analysis ; phylogenetic analysis

菠蘿蜜 （ Artocarpus heterophyllus Lam.）為?？?（ Moraceae）菠蘿蜜屬（ Artocarpus）植物，是世界著名的熱帶水果。其果實香氣濃郁，果肉味美甘甜，營養(yǎng)豐富，有熱帶水果皇后之稱。

對大部分植物來說，蔗糖是重要的轉運糖，是大部分非光合組織有機碳的重要來源，但蔗糖本身不能被直接利用，需被分解成可溶性單糖才能參與植物的各項生理代謝活動。植物體內(nèi)存在蔗糖轉化酶 （ Invertase， INV）和蔗糖合成酶（ SS）2種分解蔗糖的酶， INV是將蔗糖分解為葡萄糖和果糖，該反應為不可逆反應; SS 則能在幾乎不消耗能量的前提下發(fā)生將蔗糖分解生成二磷酸尿苷-葡萄糖 （uridine diphosphate glucose， UDPG）與果糖的可逆反應[1]。已有研究表明， SS 基因家族成員在調(diào)節(jié)蔗糖的分解與合成[2]、調(diào)控淀粉生物合成[3]、纖維細胞分化[4]、抗逆性提高[5]等方面發(fā)揮著重要的作用。

本研究采用 RACE 技術擴增菠蘿蜜中的AhSS2基因全長序列，對該基因的開放閱讀框和氨基酸序列進行相關的生物信息學分析，以期為研究 AhSS2基因的功能及其體內(nèi)表達，進一步揭示菠蘿蜜果實品質(zhì)形成機制以及菠蘿蜜的分子育種提供理論基礎。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1植物材料

菠蘿蜜為廣東海洋大學農(nóng)學院種植資源圃內(nèi)種質(zhì) B5-23，在果實成熟期，采摘鮮果，取樣后立刻用液氮冷凍保存于-80℃中以備后用。

1.1.2主要儀器設備

3H30R1智能高速冷凍離心機（湖南赫西儀器裝備有限公司）， AUY120島津電子分析天平（日本島津公司）， T1+/T1單槽 PCR儀（德國Biometra公司）， UV756CRT 型紫外可見分光光度計（上海佑科儀表有限公司）， DYY-6C 電泳儀（北京六一儀器廠）， DYCP-31E 電泳槽（北京六一儀器廠）， Elix5超純水儀（美國 Millipore公司）， YXQ-LS-100SII 型高壓蒸汽滅菌鍋（上海博迅公司），恒溫培養(yǎng)箱，超凈工作臺，恒溫搖床等。

1.2方法

1.2.1總 RNA 的提取和 cDNA 第一鏈的合成

菠蘿蜜果實的總 RNA 提取參照寶生物RNAiso- mate for Plant Tissue提取試劑盒說明書，按照寶生物 Prime ScriptTM II 1st strand cDNA Synthesis Kit說明書進行反轉錄，合成 cDNA第一鏈。

1.2.2菠蘿蜜AhSS2基因克隆

利用 RACE （rapid-amplification of cDNAends） 技術克隆了菠蘿蜜蔗糖合成酶基因（ AhSS2）的全長序列。根據(jù)前期試驗已經(jīng)得到的蔗糖合成酶基因中的保守序列，利用Primer Pre ‐mier 6.0軟件設計3RACE和5RACE 基因的特異性引物。3RACE擴增體系總體積為20?L：MgCl21.2?L， dNTPs 2.0?L，10×PCR Buffer 2.0?L， cDNA溶液1.0?L，上游引物3GSP 0.2?L，下游引物 UPM 2.0?L，TaKaRa Taq 0.2?L，滅菌水11.4?L。PCR 反應的條件：94℃5 min; 94℃1 min，72℃3 min，共5個循環(huán);94℃1 min，70℃50 s，72℃3 min，共32個循環(huán);72℃10 min;4℃1 h。5RACE 擴增體系與反應條件同3RACE相同，引物為5GSP。PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，使用鼎國生物 DNA快速回收/純化試劑盒，切膠進行回收;通過 pMD19-T 載體進行 T 載體連接，轉化至制備好的感受態(tài)細胞，培養(yǎng)單菌落，利用菌落 PCR篩選陽性克隆并送廣州生工生物科技有限公司測序。菠蘿蜜 AhSS2基因全長擴增體系總體積為20?L： MgCl21.2?L， dNTPs 2.0?L， 10×Taq Buffer with （ NH4）2SO42.0?L，cDNA溶液2.0?L，上游和下游引物共0.8?L，Taq 0.2?L，滅菌水11.8?L。 PCR擴增條件：94℃4 min;94℃1 min，55～58℃50 s， 72℃1 min;共35個循環(huán)， 72℃10 min，4℃保存。按之前的步驟對得到的產(chǎn)物進行回收、純化、克隆，將其與測序結果進行比對，從而得到基因的內(nèi)含子及外顯子序列。

1.2.3菠蘿蜜AhSS2基因的生物信息學分析

利用 NCBI 進行 BLAST 比對，利用 ORF finder 軟件尋找并預測菠蘿蜜 AhSS2基因的全長序列開放閱讀框;使用 CDD （https：//www.ncbi.nlm.nih. gov/Structure/cdd/docs/cdd_ search.html）在線軟件對蛋白質(zhì)保守結構域進行分析預測;利用在線軟件ExpasyProtParam （https：//web.ex‐pasy. org/cgi-bin/protparam/protparam） 預測菠蘿蜜 AhSS2基因編碼蛋白理化性質(zhì);利用在線軟件 TMHMM 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/servic ‐ es/TMHMM/）預測菠蘿蜜 AhSS2基因編碼蛋白的跨膜結構;利用在線軟件NetPhos （http：//www. cbs. dtu. dk/services/NetPhos/） 預測菠蘿蜜 AhSS2基因的磷酸化位點;利用在線軟件ExPasy-ProtScale? （https：//web. expasy. org/ protscale/）預測菠蘿蜜 AhSS2基因的親疏水性;利用 SOPAM （https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi- bin/secpred_sopma.pl）預測蛋白二級結構并進行分析;使用 SWISS-MODEL 軟件預測蛋白三級結構;采用 MEGA X 軟件的 Neighbor-Joining 法構建系統(tǒng)進化樹。

2結果與分析

2.1菠蘿蜜AhSS2基因克隆及序列分析

電泳結果顯示，28S 和18S 的條帶清晰完整（圖1），可用于下一步實驗。將逆轉錄后的 cDNA 第一鏈作為模板，進行 RACE 擴增，電泳結果見圖2-A （3端擴增的目標條帶）、圖2-B （5端擴增的目標條帶）。將目的條帶進行膠回收純化，膠回收產(chǎn)物經(jīng)連接轉化后進行測序，得到目的基因序列，命名為 AhSS2;該基因包含一個長為2436 bp 的開放閱讀框（open reading frame， ORF），位于148～2583 nt，共編碼811個氨基酸 （圖3）。

2.2菠蘿蜜AhSS2基因編碼蛋白的理化性質(zhì)分析

蛋白理化性質(zhì)分析結果顯示，編碼氨基酸數(shù)量為811個，蛋白的相對分子量是92.583 ku，等電點pI為5.77，屬酸性蛋白質(zhì)，酸性氨基酸總數(shù)（Asp+Glu）為110，堿性氨基酸總數(shù) （Arg+Lys）為94。該蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為36.86，屬穩(wěn)定蛋白。脂肪系數(shù)為90.17。親水性平均值（ GRAVY）為-0.259，屬于親水性蛋白。

2.3菠蘿蜜AhSS2基因編碼蛋白質(zhì)的保守結構域

使用 CDD在線軟件對蛋白質(zhì)保守結構域進行分析預測，結果發(fā)現(xiàn)了2個明顯的結構域（圖4）：一個是蔗糖合成酶位點，位于8～555 nt，該家族包括大部分的蔗糖合成酶蛋白，而蔗糖合成酶的羧基末端區(qū)域屬于糖基轉移酶家族 IPR001296，該酶主要存在于植物中，但也出現(xiàn)在細菌中;另一個是糖基化轉移酶位點，位于558～745 nt，二糖、寡糖和多糖的生物合成有許多不同糖基轉移酶參與，這些酶催化了糖基從活性受體分子到特定受體分子間的轉移，形成糖苷鍵。

2.4菠蘿蜜AhSS2基因編碼蛋白的跨膜結構區(qū)、親疏水性

TMHMM對菠蘿蜜 AhSS2基因跨膜區(qū)的預測分析結果表明，該蛋白不存在跨膜結構（圖5）。

ProtScale對基因的疏水性分析結果如圖6所示。正值越大，該區(qū)域疏水性越強;負值越小，表明該區(qū)域親水性越強。菠蘿蜜的最大值為2.544，最小值為-3.011，為親水性蛋白，與ProtParam中的理化性質(zhì)預測結果類似。

2.5菠蘿蜜AhSS2基因編碼蛋白的磷酸化位點利用在線軟件對上述蛋白氨基酸序列中的磷酸化位點進行預測分析，以 0.5為閾值，結果顯示，菠蘿蜜中共有113個磷酸化位點（圖7），其中絲氨酸磷酸化位點（ serine，Ser）67個，蘇氨酸磷酸化位點（threonine，Thr）28個，酪氨酸磷酸化位點（tyrosine，Tyr）18個，由此推測其生物功能是以絲氨酸磷酸化修飾調(diào)控為主。

2.6菠蘿蜜AhSS2基因的蛋白結構預測

2.6.1蛋白二維結構

利用 SOPA 預測蛋白的二級結構，結果如圖8所示。圖中藍色曲線代表α-螺旋，綠色曲線代表β-折疊，紅色曲線代表突出鏈，紫色曲線代表無規(guī)則卷曲。分析發(fā)現(xiàn)，該基因編碼的二級結構主要有占比52.77%的α-螺旋、占比13.07%的延伸鏈、占比7.77%的β-折疊和占比為26.39%的無規(guī)則卷曲等4種構象，據(jù)此推測該蛋白的二級結構主要為α-螺旋。

2.6.2蛋白三維結構

用 SWISS-MODEL 對氨基酸序列進行比對分析，根據(jù)數(shù)據(jù)庫中已有的蛋白質(zhì)三級結構進行 AhSS2基因的三級結構預測，結果如圖9所示。

2.7系統(tǒng)進化分析

根據(jù)進化分析可將高等植物 SS基因分為3種類型，即 SS Ⅰ、SS Ⅱ、SSⅢ， SS Ⅰ又可分為單子葉組 （ Monocot SS Ⅰ） 和雙子葉組 （ Dicot SSⅠ）[6-9]。通過與擬南芥、水稻構建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖10）發(fā)現(xiàn)，菠蘿蜜 AhSS2屬于 SSⅡ。

通過ClustalX對川桑、棗、核桃、葡萄的 SS2基因與菠蘿蜜 AhSS2基因進行多序列比對，并利用 MEGA 5.0構建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖11）。結果發(fā)現(xiàn)，菠蘿蜜 AhSS2基因與核桃、葡萄的 SS2基因同源性以及系統(tǒng)進化關系較近。

3討論

SS基因能夠參與蔗糖的代謝和運輸，調(diào)節(jié)細胞分化與細胞壁的形成，對調(diào)控作物的品質(zhì)和產(chǎn)量也有重要作用。目前已在擬南芥（Arabidopsis thaliana）[10]、玉米（ Zea mays）[11]、番茄（Ly ‐copersicon esculentum）[12]、水稻（Oryza sati ‐va）[13]等多種植物中進行了 SS基因研究。通過與擬南芥、水稻構建系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)，菠蘿蜜 AhSS2屬于 SSⅡ。在同一植物中不同類型的 SS基因的表達具有發(fā)育、組織器官和功能特異性。

目前認為，蔗糖合成酶基因含有2個結構域：蔗糖合成酶結構域、糖基轉移酶結構域[14]，這與本研究結果相符。根據(jù) SS 與質(zhì)膜的緊密聯(lián)系以及跨膜預測分析[15]，研究人員假設 SS 的一部分可能是跨膜的[16];另一方面，Amor等[17]得出結論，SS 不是跨膜蛋白， SS更可能與其他蛋白質(zhì)相互作用并形成與纖維素合成酶相關的復合物[18-19]。

蛋白質(zhì)磷酸化對細胞功能起著重要的調(diào)控作用，它是蛋白質(zhì)最重要的翻譯后修飾之一[20]。SS 蛋白包含兩個磷酸化位點，第一個是11至15處的絲氨酸磷酸化位點，主要在膜締合中起作用;第二個是170附近的一個絲氨酸，主要參與調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)降解[21]，這與本研究預測結果（ AhSS2基因的磷酸化位點主要為絲氨酸位點）相符。體內(nèi)和體外實驗表明，蔗糖合成酶蛋白的磷酸化會降低其與膜的關聯(lián)度[22]。

目前，在蔗糖合成酶基因的克隆、調(diào)控機制、生物學功能等分子生物學研究方面均取得了一定的進展，但其參與調(diào)控蔗糖分配的機理仍不清楚，還需要做一系列更加深入的研究，方可利用其來調(diào)控植物產(chǎn)量和品質(zhì)。

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（編輯排版：林海妹）