淄博市23 689例新生兒耳聾基因篩查結(jié)果分析△

韓佳佳 胡林 劉軼 魏欣 牟凱

導(dǎo)致聽力障礙的因素包括遺傳、環(huán)境及兩者共同作用三大類，研究表明，60%的先天性聽力障礙與遺傳因素密切相關(guān)[1]。遺傳性聾分為綜合征型聾和非綜合征型聾，其中以非綜合征型聾為主。非綜合型聾具有高度的遺傳異質(zhì)性，70%不伴其他癥狀，且?guī)缀醵紝儆趩位蜻z傳。目前已知非綜合征型聾相關(guān)基因約46個，突變頻率在不同種族、不同地域間存在差異[2]。近年來針對中國人群的大規(guī)模耳聾分子流行病學(xué)研究表明，絕大多數(shù)的非綜合征型聾由GJB2、SLC26A4、GJB3和線粒體DNA12SrRNA[3,4]四個基因突變引起，基因突變位點的確定對制定有效的預(yù)防、干預(yù)措施具有重要的指導(dǎo)意義。

新生兒聽力篩查現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于臨床，但是現(xiàn)行聽力篩查模式的局限性使得它不能有效檢出遲發(fā)性聾和藥物性聾患兒，且現(xiàn)有數(shù)據(jù)顯示部分致病基因突變攜帶者也能通過新生兒聽力篩查[5]。耳聾基因篩查不僅能夠盡早明確耳聾的致病原因并盡早采取治療和干預(yù)措施，降低或避免遲發(fā)性聾的發(fā)生，而且能夠盡早篩查出藥物性聾的高危人群，指導(dǎo)用藥，避免藥物性聾的發(fā)生。

本研究采用遺傳性聾基因芯片技術(shù)對淄博市23 689例新生兒4個常見耳聾基因的15個位點進(jìn)行篩查，不僅有效檢出了耳聾基因突變攜帶者，明確診斷，利于改善預(yù)后、指導(dǎo)生育，而且對于藥物敏感性聾和遲發(fā)性聾的早發(fā)現(xiàn)、早診斷和早治療有重要作用。現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1研究對象 選擇2019年1～ 11月在淄博市出生的23 689例新生兒為研究對象，其中，男12 526例，女11 163例，男女比例為1.12∶1。所有受檢新生兒均由家屬簽署知情同意書，自愿進(jìn)行耳聾基因篩查。

1.2耳聾基因篩查方法

1.2.1DNA的提取 新生兒出生后2～3 d，用采血濾紙采集新生兒足跟末梢血2個血斑，充分滲透，血斑直徑≥8 mm，提取DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2PCR擴增 PCR反應(yīng)體系：遺傳性聾基因檢測試劑盒中所涉及GJB2、SLC26A4、GJB3和線粒體DNA12SrRNA[3,4]4個基因的15個檢測位點(GJB2:c.35 dek G、c.235 del C、c.299 del AT、c.176 del 16;GJB3:c.538 C>T;SLC26A4:c.2168 A>G、c.IVS7-2 A>G、c.IVS15+5 G>A、c.1975 G>C、c.2027 T>A、c.1226 G>A、c.1229 C>T、c.1174 A>T;線粒體DNA12SrRNA:m.1495 C>T、m.1555 A>G)分別分布在A、B、C三個擴增體系中,各取三個擴增體系20 μl，各加DNA5 μl;PCR反應(yīng)條件：37 ℃ 10 min，95 ℃ 15 min，95 ℃ 30 s，0.4 ℃/s 退火至57 ℃ 30 s，0.2 ℃/s退火至70 ℃ 45 s，循環(huán)35 次；60 ℃ 10 min，12 ℃ ∞。

1.2.3雜交和檢測 分別取A、B、C三個擴增體系各5 μl進(jìn)行芯片雜交，雜交完成后經(jīng)洗滌和干燥放入全自動掃描儀進(jìn)行芯片掃描和結(jié)果分析。

1.2.4測序驗證 檢測為陽性的樣本送由北京博奧生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序驗證。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1耳聾基因突變在不同性別中的分布 23 689例新生兒共檢測出突變者1 162例，總體突變攜帶率4.90%。其中男嬰檢出基因突變616例(4.92%，616/1 2 526)；女嬰檢出突變546例(約4.89%，546/11 163)。不同性別之間基因突變檢出率無統(tǒng)計學(xué)差異(χ2=4.495，P>0.05)。

2.2耳聾基因突變位點篩查結(jié)果 1 162例耳聾基因突變中，GJB2基因突變608例(52.32%，608/1 162)；GJB3基因突變96例，約占8.26%(96/1 162)；SLC26A4基因突變396例，占34.08%(396/1 162)；線粒體DNA12SrRNA 基因突變 45例，占3.87%(45/1 162)；雙基因突變17例，占1.46%(17/1 162)(表1)。

表1 耳聾基因突變位點、突變類型、例數(shù)及突變率

3 討論

遺傳性聾基因芯片技術(shù)是目前安全、高效、敏感的檢測方法之一，可有效檢出耳聾基因突變攜帶者[6]。與全面的診斷測試方法相比，它具有成本低、檢測周期短、易于解釋以及結(jié)果不確定性低的優(yōu)點，為本地區(qū)耳聾基因篩查提供了技術(shù)支持。

GJB2基因位于13號染色體，表現(xiàn)為常染色體隱性遺傳，是最常見的耳聾致病基因[7]。在我國人群中，常見的GJB2突變類型主要有c.35 del G、c.176 del 16、 c.235 del C和c.299 del AT[8,9]。GJB2 基因的遺傳異質(zhì)性突出，聽力學(xué)表型呈多樣化，可表現(xiàn)為輕度至極重度聽力損失。本組對象中共篩查出GJB2基因突變608例(2.57%)，其中雜合突變607例，純和突變1例，另有12例雙雜合突變，c.235 del C和c.299 del AT位點突變率較高，分別為1.68%和0.70%。該基因純合突變是造成患者先天性聽力損失的主要病因，盡管雜合突變不絕對致病，但也要密切關(guān)注攜帶者的聽力變化情況，定期檢查，一旦發(fā)現(xiàn)聽力異常，要及時采取干預(yù)措施，最大程度避免聽力損傷。

SLC26A4基因位于7號染色體，也是常染色體隱性遺傳，是僅次于 GJB2 基因的常見致聾基因[10]。SLC26A4與大前庭水管綜合征(large vestibular aqueduct syndrome，LVAS) 密切相關(guān)，可引起中度至極重度的感音神經(jīng)性聽力損失[11]。SLC26A4基因突變患者出生時可表現(xiàn)為聽力正常，但當(dāng)頭部受到撞擊、外傷或者感冒后才出現(xiàn)聽力損失，嚴(yán)重者可引起中度、重度甚至極重度聾，多為語后聾[12]。遲發(fā)性聾患兒往往能夠通過新生兒聽力篩查，很容易被漏檢。本研究共篩查出SLC26A4基因突變396例(1.67%)，其中雜合突變395例，純和突變1例，另有12例雙雜合突變；IVS7-2位點突變率較高,突變率為1.03%。對于SLC26A4基因突變攜帶者應(yīng)及時告之其避免顱壓增大和外傷，如：頭部撞擊以及感冒、發(fā)燒等外因誘發(fā)耳聾的發(fā)生。

GJB3基因位于1號染色體，屬常染色體顯性或隱性遺傳，該基因突變往往會導(dǎo)致高頻聽力損失或后天性耳聾[13,14]。本研究共篩查出GJB3基因雜合突變96例(0.41%)，另有7例雙雜合突變；對此類攜帶者應(yīng)定期復(fù)查聽力，及時治療。

線粒體DNA12SrRNA基因為線粒體遺傳，即母系遺傳。線粒體DNA12SrRNA 基因突變攜帶者通常表現(xiàn)為藥物引起的感音神經(jīng)性聾，主要與氨基糖苷類抗生素造成耳聾相關(guān)[15,16]。該基因突變的攜帶者應(yīng)慎用氨基糖苷類藥物，在臨床咨詢過程中應(yīng)充分告知新生兒家屬，并對其進(jìn)行用藥指導(dǎo)，避免“一針致聾”悲劇的發(fā)生。本研究共篩查出線粒體DNA12SrRNA基因突變者45例(0.19%)，其中m.1494 C>T均質(zhì)突變3例，m.1555 A>G均質(zhì)突變36例，m.1555 A>G異質(zhì)突變6例，另有3例雙雜合突變。對于攜帶線粒體DNA12SrRNA突變的新生兒，可以指導(dǎo)其臨床用藥；同時運用線粒體疾病的母系遺傳規(guī)律，進(jìn)一步明確先證者家族中尚未發(fā)病的母系家庭成員，給予宣教，是一種有效的前瞻性預(yù)防手段。

本研究首次在淄博市開展新生兒耳聾基因篩查，初步獲得了淄博市遺傳性聾的基因突變分布情況。對23 689例新生兒4個常見耳聾基因的15個位點進(jìn)行篩查，共檢出耳聾基因突變攜帶者1 162例，突變檢出率4.90%。其中，GJB2基因突變檢出率最高，其次是SLC26A4基因突變，線粒體DNA 12SrRNA最少；以GJB2基因c.235delC雜合突變(1.68%)、 IVS26A4基因IVS7-2雜合突變(1.03%)最多見。由于基因芯片技術(shù)所檢測的耳聾基因位點有限，因此不能確定所篩查的雜合突變攜帶者是否還存在其他等位基因突變，因而還需結(jié)合聽力篩查或者對相應(yīng)基因進(jìn)行全序列測序，以確定其是否是先天性或遲發(fā)性聽力障礙。本研究還檢出2例純合突變和17例雙基因雜合突變，有研究表明GJB2和SLC26A4 基因純合突變與復(fù)合雜合突變引起的聽力損失程度都以重度、極重度為主，純合突變引起的聽力損失程度往往要重于復(fù)合雜合突變引起的聽力損失程度[17]。戴樸等[18]對攜帶GJB2單等位基因突變的中國耳聾人群進(jìn)行GJB3 基因突變分析，認(rèn)為同為編碼連接蛋白家族成員的GJB3與GJB2 基因可能會以雙基因雜合模式導(dǎo)致耳聾，但也有研究[19]顯示GJB2、GJB3 雙基因雜合突變攜帶者可以通過聽力篩查。因此，GJB2、GJB3 雙基因雜合突變是否對其攜帶者的聽力造成影響還需長期的隨訪進(jìn)行驗證。

本研究通過大樣本量的耳聾基因篩查結(jié)果分析，補充了本地區(qū)人群常見耳聾基因突變分布情況的相關(guān)數(shù)據(jù)，但沒有結(jié)合聽力篩查結(jié)果對耳聾基因突變攜帶者進(jìn)行分析是本研究的不足之處；此外，本研究還缺乏對耳聾基因篩查異常者的聽力隨訪。對高風(fēng)險基因型個體的聽力狀況進(jìn)行長期隨訪，對于驗證篩查結(jié)果、闡明其基因型特有的發(fā)病機理至關(guān)重要。今后的研究中在進(jìn)行耳聾基因篩查的同時還要建立完善可行的長期隨訪制度，并補充聽力篩查數(shù)據(jù)，以驗證發(fā)病機制，評估干預(yù)效果，進(jìn)一步增強耳聾基因篩查的優(yōu)勢。