lncRNA CCDC183-AS1通過靶向miR-1301-3p調(diào)控胃癌AGS細胞的增殖、遷移和侵襲

張紅英,何陳聰,鐘定福

張紅英,何陳聰,鐘定福,金華市人民醫(yī)院消化內(nèi)科 浙江省金華市321000

0 引言

胃癌是全球最常見惡性腫瘤之一.飲食、感染、吸煙、肥胖和幽門螺桿菌等都與胃癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[1].據(jù)報道,2018年全球新增胃癌數(shù)量超1000萬,死亡人數(shù)783萬[2].目前治療方法主要有手術(shù)、化療、放療、靶向治療和免疫基因治療等,但由于晚期、耐藥和高復(fù)發(fā)率,患者5年生存率低于30%[3].因此,亟待尋找有效的治療手段.長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是指長度超過200個核苷酸且不具有編碼蛋白功能的轉(zhuǎn)錄本,眾多研究表明,lncRNAs參與人類多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后[4].lncRNA CCDC183-AS1位于人類Chr 9q34.3區(qū)域,研究發(fā)現(xiàn),在肝細胞癌中,lncRNA CCDC183-AS1高表達與患者低總生存率有關(guān),并促進肝細胞癌細胞的增殖、遷移和侵襲以及體內(nèi)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[5].然而lncRNA CCDC183-AS1在胃癌中的表達和作用尚不明確,StarBase預(yù)測顯示,lncRNA CCDC183-AS1與miR-1301-3p具有互補核苷酸序列.研究報道[6],沉默miR-1301-3p可消除下調(diào)LINC01207對胃癌細胞生長和遷移的抑制作用.盡管已有研究確定miR-1301-3p在胃癌中的作用,但lncRNA CCDC183-AS1在胃癌中的作用以及其分子機制是否與miR-1301-3p有關(guān)還尚未可知.因此,本實驗以胃癌AGS細胞為體外研究對象,探討lncRNA CCDC183-AS1是否通過靶向調(diào)控miR-1301-3p表達來影響胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲.

1 材料和方法

1.1 材料 選取本院2017-01/2019-01期間經(jīng)病理檢測為胃癌的患者30例,獲得原發(fā)性胃癌組織及相應(yīng)癌旁組織,每位患者均知情且同意,手術(shù)切除后立即將樣本保存在-80 ℃.本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn).胃癌AGS細胞系購自中國科學(xué)院上海細胞庫;胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司;Trziol、反轉(zhuǎn)錄、實時熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,RTqPCR)試劑盒購自日本Takara公司;四甲基偶氮唑鹽比色法(methye thiazolye telrazlium,MTT)試劑購自上海晶抗生物工程有限公司;Transwell小室購于美國密理博公司;RIPA蛋白裂解液、二辛可寧酸試劑盒購自上海研謹(jǐn)生物科技有限公司;雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司;Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司.

1.2 方法

1.2.1 細胞轉(zhuǎn)染與分組:取對數(shù)生長期AGS細胞,將si-NC、si-CCDC183-AS1、miR-NC、miR-1301-3p分別轉(zhuǎn)染至其中,記為si-NC組、si-CCDC183-AS1組、miRNC組、miR-1301-3p組;將si-CCDC183-AS1分別與antimiR-NC、anti-miR-1301-3p共轉(zhuǎn)染至AGS細胞中,記為si-CCDC183-AS1+anti-miR-NC組、si-CCDC183-AS1+antimiR-1301-3p組.

1.2.2 RT-qPCR:提取細胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,lncRNA CCDC183-AS1和miR-1301-3p分別以GAPDH和U6為內(nèi)參,相對表達量采用2-△△Ct法計算.lncRNA CCDC183-AS1上游引物序列:5'-GACTTGATCCGTTGGCCTGA-3',下游引物序列:5'-CTTGGACTTCCCCTCGAACC-3';miR-1301-3p上游引物序列:5'-TTACAGCTGCCTGAGAGTGACTTA-3',下游引物序列:5'-CTCTACAGCTATATTGCCAGCCA-3';GAPDH上游引物序列:5'-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3',下游引物序列:5'-GCCATCACGCCACAGTTTC-3';U6上游引物序列:5'-CGCTTCGGCAGGCATTATATAC-3',下游引物序列:5'-AAGGGGCCATGCTAATCTT-3';引物由上海生工生物工程公司合成.

1.2.3 MTT檢測細胞活性:取各組AGS細胞(2.5×104個/mL),接種于96孔板(100 μL/L),培養(yǎng)48 h后,加入MTT溶液20 μL/孔,培養(yǎng)4 h,棄上清,加入DMSO 150 μL/孔,室溫震蕩孵育5 min,酶標(biāo)儀檢測450 nm處的OD值.

1.2.4 Transwell檢測細胞遷移與侵襲:Transwell小室上室接種AGS細胞(5×104個/孔),下室加入600 μL(含10%胎牛血清)培養(yǎng)液,37 ℃下孵育24 h后,棉簽擦去未穿膜細胞.多聚甲醛固定,0.1%結(jié)晶紫染色.置于顯微鏡下計數(shù).

1.2.5 Western blot檢測蛋白表達:提取各組細胞總蛋白,BCA試劑盒進行定量.各組蛋白上樣量60 μg,進行聚丙烯酰胺凝膠電泳后,轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上,5%脫脂牛奶室溫封閉1 h,一抗4 ℃孵育過夜,二抗室溫孵育2 h,暗室中曝光顯影,定影,Image J軟件分析目的蛋白的相對表達量.

1.2.6 雙熒光素酶報告實驗:StarBase預(yù)測顯示lncRNA CCDC183-AS1與miR-1301-3p存在結(jié)合位點,構(gòu)建CCDC183-AS1野生型和突變型熒光素酶表達載體WT-CCDC183-AS1和MUT-CCDC183-AS1,將其分別與miR-NC和miR-1301-3p共轉(zhuǎn)染至AGS細胞中,按照說明書檢測熒光素酶活性.

統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù),每組實驗重復(fù)9次,計量資料以(mean±SD)表示且均符合正態(tài)分布,兩組間比較采用獨立樣本t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析,以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 lncRNA CCDC183-AS1和miR-1301-3p在胃癌組織中的表達 與癌旁組織比較,胃癌組織中CCDC183-AS1和miR-1301-3p的表達水平分別顯著升高和降低(P<0.05);與人正常胃粘膜細胞GES-1比較,胃癌細胞AGS、N87、HGC-27、SNU-484中CCDC183-AS1和miR-1301-3p的表達水平分別顯著升高和降低(P<0.05)(表1,表2).后續(xù)實驗選用AGS細胞.

表1 lncRNA CCDC183-AS1和miR-1301-3p在胃癌組織中的表達(mean±SD,n=30)

表2 lncRNA CCDC183-AS1和miR-1301-3p在不同胃癌細胞中的表達(mean±SD,n=9)

2.2 抑制lncRNA CCDC183-AS1表達對胃癌AGS細胞增殖、遷移和侵襲的影響 轉(zhuǎn)染si-CCDC183-AS1后,AGS細胞中CCDC183-AS1的表達水平降低,OD值、遷移細胞數(shù)、侵襲細胞數(shù)、細胞周期素D1(CyclinD1)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,MMP-2)和基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9,MMP-9)表達水平降低,p21表達水平升高(P<0.05)(圖1,表3,表4).

圖1 抑制lncRNA CCDC183-AS1表達對胃癌AGS細胞增殖、遷移和侵襲的影響. A:遷移侵襲圖;B:CyclinD1、MMP-2、MMP-9和p21蛋白的表達.MMP-2:基質(zhì)金屬蛋白酶2;MMP-9:基質(zhì)金屬蛋白酶9;lncRNA:長鏈非編碼RNA.

表3 抑制lncRNA CCDC183-AS1表達對胃癌AGS細胞增殖、遷移和侵襲的影響(mean±SD,n=9)

表4 抑制lncRNA CCDC183-AS1表達對胃癌AGS細胞CyclinD1、MMP-2、MMP-9和p21蛋白表達的影響(mean±SD,n=9)

2.3 lncRNA CCDC183-AS1靶向調(diào)控miR-1301-3p的表達(StarBase Predicted) StarBase預(yù)測的lncRNA CCDC183-AS1與miR-1301-3p的互補核苷酸序列(圖2).轉(zhuǎn)染miR-1301-3p的WT-CCDC183-AS1熒光素酶活性降低(P<0.05)(表5).lncRNA CCDC183-AS1靶向調(diào)控miR-1301-3p表達(P<0.05)(表6).

圖2 CCDC183-AS1的序列中含有與miR-1301-3p互補的核苷酸序列.

表5 雙熒光素酶報告實驗(mean±SD,n=9)

表6 lncRNA CCDC183-AS1調(diào)控miR-1301-3p表達(mean±SD,n=9)

2.4 過表達miR-1301-3p對胃癌AGS細胞增殖、遷移和侵襲的影響 轉(zhuǎn)染miR-1301-3p后,AGS細胞中miR-1301-3p的表達水平升高,OD值、遷移細胞數(shù)、侵襲細胞數(shù)、CyclinD1、MMP-2和MMP-9表達水平降低,p21表達水平升高(P<0.05)(圖3,表7,表8).

圖3 過表達miR-1301-3p對胃癌AGS細胞增殖、遷移和侵襲的影響. A:遷移侵襲圖;B:CyclinD1、MMP-2、MMP-9和p21蛋白的表達.MMP-2:基質(zhì)金屬蛋白酶2;MMP-9:基質(zhì)金屬蛋白酶9.

表7 過表達miR-1301-3p對胃癌AGS細胞增殖、遷移和侵襲的影響(mean±SD,n=9)

表8 過表達miR-1301-3p對胃癌AGS細胞CyclinD1、MMP-2、MMP-9和p21蛋白表達的影響(mean±SD,n=9)

2.5 下調(diào)miR-1301-3p表達逆轉(zhuǎn)了抑制lncRNA CCDC183-AS1表達對胃癌AGS細胞增殖、遷移和侵襲的影響 共轉(zhuǎn)染si-CCDC183-AS1、anti-miR-1301-3p后,AGS細胞中miR-1301-3p的表達水平降低,OD值、遷移細胞數(shù)、侵襲細胞數(shù)、CyclinD1、MMP-2和MMP-9表達水平升高,p21表達水平降低(P<0.05)(圖4,表9,表10).

圖4 下調(diào)miR-1301-3p表達逆轉(zhuǎn)了抑制lncRNA CCDC183-AS1表達對胃癌AGS細胞增殖、遷移和侵襲的影響. A:遷移侵襲圖;B:CyclinD1、MMP-2、MMP-9和p21蛋白的表達.MMP-2:基質(zhì)金屬蛋白酶2;MMP-9:基質(zhì)金屬蛋白酶9;lncRNA:長鏈非編碼RNA.

表9 下調(diào)miR-1301-3p表達逆轉(zhuǎn)了抑制lncRNA CCDC183-AS1表達對胃癌AGS細胞增殖、遷移和侵襲的影響(mean±SD,n=9)

表10 下調(diào)miR-1301-3p表達逆轉(zhuǎn)了抑制lncRNA CCDC183-AS1表達對胃癌AGS細胞CyclinD1、MMP-2、MMP-9和p21蛋白表達的影響(mean±SD,n=9)

3 討論

越來越多證據(jù)表明,lncRNAs在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用,如lncRNA KCNQ1OT1在胃癌組織和細胞中高表達,敲減lncRNA KCNQ1OT1可抑制腫瘤生長、細胞活力和集落形成,促進細胞凋亡,lncRNA KCNQ1OT1通過miR-145-5p/ARF6軸促進胃癌進展[7].在胃癌中,LINC01224和CDK8表達上調(diào),miR-193a-5p表達下調(diào),LINC01224促進細胞增殖、遷移和侵襲,抑制細胞凋亡,下調(diào)miR-193a-5p部分消除了沉默LINC01224對胃癌細胞惡性行為的抑制作用[8].lncRNA HOXA-AS3的高表達與胃癌腫瘤大小、淋巴結(jié)狀態(tài)、浸潤深度和幽門螺桿菌感染狀態(tài)相關(guān),敲除lncRNA HOXA-AS3可抑制細胞增殖、遷移、侵襲和腫瘤轉(zhuǎn)移[9].與正常胃粘膜上皮細胞相比,胃癌細胞中l(wèi)ncRNA SNHG4表達水平升高,下調(diào)其表達通過靶向上調(diào)miR-204-5p抑制細胞的增殖、遷移和侵襲,并阻斷細胞周期的進程[10].lncRNA HIF1A-AS2在胃癌組織和細胞中表達升高,下調(diào)miR-429消除了敲減lncRNA HIF1AAS2對細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用[11].lncRNA HCP5通過miR-519d/HMGA1軸增強胃癌細胞的增殖和順鉑耐藥性[12].與上述結(jié)果一致,本實驗結(jié)果顯示,與癌旁組織相比,胃癌組織中l(wèi)ncRNA CCDC183-AS1表達水平顯著升高,抑制lncRNA CCDC183-AS1表達顯著降低了胃癌AGS細胞的增殖、遷移和侵襲能力.CyclinD1促進細胞周期由G1期到S期的轉(zhuǎn)變,其過表達可促進細胞增殖,導(dǎo)致細胞增殖異常[13],而p21發(fā)揮腫瘤抑制作用,促進多種刺激下的細胞周期阻滯[14,15].MMPs在癌細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成中發(fā)揮重要作用,MMP-2、MMP-9是MMPs家族的兩個重要成員,是癌細胞轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵調(diào)控因子[16,17].本實驗結(jié)果顯示,抑制lncRNA CCDC183-AS1表達后,CyclinD1、MMP-2和MMP-9表達水平降低,p21表達水平升高,進一步說明lncRNA CCDC183-AS1對胃癌AGS細胞增殖、遷移和侵襲的調(diào)控作用.

研究表明lncRNAs可作為ceRNA或“分子海綿”負調(diào)控腫瘤相關(guān)miRNA表達來促進胃癌進展[7-12].本實驗的StarBase預(yù)測顯示,lncRNA CCDC183-AS1與miR-1301-3p含有互補核苷酸序列,雙熒光素酶報告實驗顯示,在WT-CCDC183-AS1中,轉(zhuǎn)染miR-1301-3p的熒光素酶活性顯著降低,lncRNA CCDC183-AS1靶向負調(diào)控miR-1301-3p表達.研究表明,miR-1301-3p參與了多種癌癥細胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡,下調(diào)miR-1301-3p可逆轉(zhuǎn)敲減circ_0004370對食管癌細胞惡性行為的抑制作用[18].miR-1301-3p的低表達與甲狀腺乳頭狀癌的T、N分級升高顯著相關(guān),上調(diào)miR-1301-3p通過下調(diào)PCNA表達抑制TPC-1細胞的增殖[19].在膀胱癌細胞中,lncRNA NNT-AS1和PODXL表達升高,miR-1301-3p表達降低,lncRNA NNTAS1通過靶向miR-1301-3p/PODXL軸和激活Wnt通路促進細胞生長[20].miR-1301在骨肉瘤細胞中低表達,表阿霉素通過調(diào)控miR-1301/TRIAP1軸抑制骨肉瘤細胞的增殖,并促進細胞凋亡[21].miR-1301-3p的低表達與乳腺癌腫瘤大小及臨床分期密切相關(guān),上調(diào)miR-1301-3p通過靶向下調(diào)ICT1表達抑制乳腺癌細胞的增殖,促進細胞凋亡[22].與前人研究結(jié)果一致,與癌旁組織相比,胃癌組織中miR-1301-3p表達顯著降低,過表達miR-1301-3p顯著降低了胃癌AGS細胞的增殖、遷移和侵襲能力.且下調(diào)miR-1301-3p表達逆轉(zhuǎn)了抑制lncRNA CCDC183-AS1表達對胃癌AGS細胞增殖、遷移和侵襲的影響.提示lncRNA CCDC183-AS1可能通過調(diào)控miR-1301-3p表達影響AGS細胞的增殖、遷移和侵襲.

4 結(jié)論

綜上所述,lncRNA CCDC183-AS1在胃癌組織中表達上調(diào),抑制lncRNA CCDC183-AS1通過靶向上調(diào)miR-1301-3p表達降低胃癌AGS細胞的增殖、遷移和侵襲能力.這意味著lncRNA CCDC183-AS1可能是治療胃癌的新靶點,但僅限于體外實驗,其在體內(nèi)的作用及調(diào)控機制還有待進一步研究.

文章亮點

實驗背景

胃癌的致病機理尚不明確,已有研究發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)的異常表達與胃癌細胞的惡性生物學(xué)行為有關(guān),但lncRNA CCDC183-AS1對胃癌細胞惡性生物學(xué)行為的影響尚未可知.

實驗動機

lncRNA CCDC183-AS1在肝細胞癌中表達上調(diào),促進肝細胞癌細胞的增殖、遷移和侵襲以及體內(nèi)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移,但其對胃癌細胞的影響及分子機制還尚未可知.StarBase預(yù)測顯示,lncRNA CCDC183-AS1可能靶向結(jié)合miR-1301-3p.已有研究稱,沉默miR-1301-3p可消除下LINC01207對胃癌細胞生長和遷移的抑制作用.但lncRNA CCDC183-AS1能否靶向調(diào)控miR-1301-3p影響胃癌細胞 的增殖、遷移和侵襲尚不清楚.因此,探究lncRNA CCDC183-AS1對胃癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響及其能否靶向miR-1301-3p發(fā)揮作用,以期為胃癌治療提供新思路.

實驗?zāi)繕?biāo)

探究lncRNA CCDC183-AS1對胃癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響及其能否靶向miR-1301-3p發(fā)揮作用,為胃癌治療提供新思路.

實驗方法

RT-qPCR檢測胃癌組織和細胞中l(wèi)ncRNA CCDC183-AS1和miR-1301-3p的表達.分別轉(zhuǎn)染lncRNA CCDC183-AS1小干擾RNA、miR-1301-3p模擬物至胃癌細胞AGS中,RT-qPCR檢測其轉(zhuǎn)染效果,MTT檢測細胞增殖,Transwell檢測細胞遷移和侵襲,Western blot檢測CyclinD1、p21、基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,MMP-2)和基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9,MMP-9)蛋白表達.雙熒光素酶報告實驗驗證lncRNA CCDC183-AS1與miR-1301-3p的靶向調(diào)控關(guān)系.

實驗結(jié)果

胃癌組織中l(wèi)ncRNA CCDC183-AS1高表達,miR-1301-3p低表達.抑制lncRNA CCDC183-AS1表達或高表達miR-1301-3p可降低AGS細胞OD值、遷移細胞數(shù)、侵襲細胞數(shù)以及CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達水平,提高p21表達水平.lncRNA CCDC183-AS1可靶向負調(diào)控miR-1301-3p表達,下調(diào)miR-1301-3p表達逆轉(zhuǎn)了抑制lncRNA CCDC183-AS1表達對AGS細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用.

實驗結(jié)論

胃癌組織中l(wèi)ncRNA CCDC183-AS1表達升高,抑制lncRNA CCDC183-AS1表達可降低AGS細胞的增殖、遷移和侵襲能力,其分子機制可能與靶向上調(diào)miR-1301-3p有關(guān),為胃癌的靶向分子治療提供了新靶點.

展望前景

miR-1301-3p下游靶基因以及信號通路在胃癌進展中的作用還未知,且本研究僅僅限于體外實驗,還需進一步驗證lncRNA CCDC183-AS1/miR-1301-3p軸在裸鼠移植瘤實驗中對胃癌進展的作用.