N6-甲基腺嘌呤修飾異常對女性生殖系統(tǒng)疾病的影響

熊佳麗，薛平平，周懷君

(1.南京醫(yī)科大學(xué)鼓樓臨床醫(yī)學(xué)院婦產(chǎn)科，江蘇 南京 210008；2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州婦幼保健院婦產(chǎn)科，江蘇 常州 213000；3.南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州婦幼保健院生殖中心，江蘇 常州 213000)

表觀遺傳是指在不改變基因組DNA序列，但基因表達發(fā)生了可逆且可遺傳化的變化，主要包括DNA甲基化、組蛋白翻譯后修飾和RNA甲基化等，這種基因表達的變化參與了人類重要的生命進程。目前，在生物體內(nèi)已經(jīng)鑒定出超過150種的RNA修飾[1]，其中甲基化修飾是最主要的RNA表觀遺傳學(xué)修飾。甲基化修飾主要包括N1-甲基腺嘌呤(N1-methyladenosine，m1A)、N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine，m6A)和5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，m5C)等；其中，m6A甲基化修飾又是mRNA中最豐富的轉(zhuǎn)錄后修飾。近年來，隨著越來越多m6A甲基化修飾相關(guān)領(lǐng)域研究的涌現(xiàn)及鑒定、檢測技術(shù)的發(fā)展，證實m6A甲基化參與并影響了惡性腫瘤及內(nèi)分泌系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、女性生殖系統(tǒng)疾病的發(fā)生和發(fā)展進程[2-3]。以m6A為代表的RNA表觀遺傳修飾成為當(dāng)今生命科學(xué)研究的前沿和熱點之一[4]，現(xiàn)對m6A修飾參與的女性生殖系統(tǒng)疾病及惡性腫瘤等進行闡述，并對其機制進行探討，旨在為保障女性生殖健康提供新的研究策略。

1 m6A的簡介

1.1 m6A修飾的概念

m6A甲基化是指m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體，利用S-腺苷酸甲硫氨酸(SAM)為甲基供體，將堿基A第6位上的氫甲基化。真核生物RNA上超過50%的表觀遺傳修飾是以m6A為主的。自2011年何川實驗室發(fā)現(xiàn)了第1個m6A去甲基化酶肥胖相關(guān)基因(fat mass and obesity-associated protein，F(xiàn)TO)，m6A相關(guān)蛋白的研究拉開了帷幕。同時伴隨著鑒定技術(shù)及高通量測序技術(shù)的發(fā)展，逐漸完成了m6A分布圖譜的精確繪制，并發(fā)現(xiàn)m6A分布富集于mRNA蛋白質(zhì)編碼區(qū)(coding sequence，CDS區(qū))、3′-非翻譯區(qū)(3′-untranslated region，3′-UTR)、長的外顯子區(qū)域、終止密碼子與剪切位點附近，參與調(diào)控mRNA的穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)錄、可變剪接、結(jié)構(gòu)、定位、降解、翻譯效率及核轉(zhuǎn)運等功能，在轉(zhuǎn)錄后層面參與真核基因的表達調(diào)控，此外還參與細(xì)胞代謝重塑、細(xì)胞分化和生物節(jié)律維持，導(dǎo)致一系列生理或病理效應(yīng)，從而影響人體生命生理過程[5]。

1.2 m6A修飾的相關(guān)蛋白

m6A受甲基轉(zhuǎn)移酶(“Writers”，編碼器)、去甲基化酶(“Erasers”，消碼器)和結(jié)合蛋白(“Readers”，讀碼器)這三種效應(yīng)蛋白的調(diào)控，見圖1。

圖1 m6A的甲基化和去甲基化示意圖Fig.1 The process of m6A methylation and demethylation

1.2.1 關(guān)于編碼器

“編碼器”是指m6A甲基化轉(zhuǎn)移酶，催化m6A的甲基化修飾。m6A甲基化修飾是由多種蛋白組成的甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體完成的。利用串聯(lián)親和沉淀結(jié)合質(zhì)譜分析、免疫熒光共聚焦顯微鏡技術(shù)及基于光交聯(lián)免疫共沉淀技術(shù)的測序技術(shù)等，發(fā)現(xiàn)甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體主要由甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白3(methyltransferase-like 3，METTL3)、甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白14(methyltransferase-like 14，METTL14)、腎母細(xì)胞瘤1結(jié)合蛋白相關(guān)蛋白(wilmstumor 1-associatedprotein，WTAP)等相關(guān)蛋白組成，其中METTL3是最早被鑒定的m6A甲基轉(zhuǎn)移酶組分，同時也是甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體的核心組分。

1.2.2 關(guān)于消碼器

“消碼器”是指m6A去甲基化酶，介導(dǎo)m6A的去甲基化修飾過程。目前在哺乳動物體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)的去甲基化酶，有FTO和ALKB同源蛋白5(AlkBhomolog 5，ALKBH5)，兩者均是二價鐵、α-酮戊二酸鹽依賴型雙加氧酶ALKB家族蛋白成員，即需要依賴輔因子Fe2+和α-酮戊二酸來催化m6A去甲基化活性。

1.2.3 關(guān)于讀碼器

“讀碼器”是指甲基結(jié)合蛋白，是一組識別m6A修飾信息的蛋白。m6A雖然是受甲基化酶和去甲基化酶動態(tài)調(diào)控，但m6A的生物學(xué)功能主要通過其結(jié)合識別蛋白實現(xiàn)。由此可見，m6A功能性調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄組及參與生物學(xué)的過程，在很大程度上取決于其結(jié)合蛋白的有效識別。目前發(fā)現(xiàn)的m6A結(jié)合蛋白主要有YTH結(jié)構(gòu)域家族蛋白、異質(zhì)性胞核核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein，hnRNP)家族蛋白成員、真核起始因子3(eukaryotic initiation factor 3，eIf3)及胰島素樣生長因子2 mRNA結(jié)合蛋白(insulin-likegrowth factor 2 mRNA-binding proteins，IGF2BPs)。這些蛋白可選擇性地結(jié)合到m6A修飾的序列上，分別調(diào)控相關(guān)mRNA介導(dǎo)的生物學(xué)功能，見表1。

表1 m6A結(jié)合蛋白的種類和功能Table 1 Types and functions of m6A binding proteins

2 m6A修飾對女性生殖健康的影響

m6A是人體內(nèi)最主要的RNA修飾方式，由于m6A動態(tài)可逆地調(diào)控著各種生命進程，其含量異常升高或降低均可導(dǎo)致不同疾病的發(fā)生。m6A對女性生殖健康，包括早發(fā)性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency，POI)、多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)、女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤等疾病有著重要的影響。

2.1 m6A修飾與女性生殖內(nèi)分泌疾病

女性生殖內(nèi)分泌疾病是婦科常見病，主要是由于下丘腦-垂體-卵巢軸異常所致，此外還涉及環(huán)境、遺傳等因素。隨著表觀遺傳學(xué)的深入研究，發(fā)現(xiàn)m6A修飾也與該類疾病存在一定的關(guān)系。

2.1.1 m6A修飾與早發(fā)性卵巢功能不全

POI指女性40歲以前出現(xiàn)卵巢功能衰退，以促性腺激素升高及雌激素缺乏為特征，主要表現(xiàn)為月經(jīng)異常(閉經(jīng)、月經(jīng)稀發(fā)或頻發(fā))，最終逐漸發(fā)展為以閉經(jīng)和不同程度的圍絕經(jīng)期癥狀為主要表現(xiàn)的卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)[6]，并影響女性卵泡發(fā)育、成熟，進而影響育齡女性的生育及日常生活。雖然多數(shù)POI患者的發(fā)病原因尚不完全明確，但Xia等[7]的相關(guān)實驗指出，Zmettl3m/m斑馬魚(靶向METTL3外顯子的合子缺陷突變系)的卵母細(xì)胞發(fā)育滯緩，多數(shù)依然停留在早期階段，m6A修飾顯而易見地影響著卵泡成熟率；實驗中同時指出，由于Zmettl3m/m斑馬魚的卵母細(xì)胞中m6A含量明顯下降，引起其體內(nèi)性激素合成與促性腺激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的關(guān)鍵因子無法正常表達，從而使得子代胚胎中11-酮基睪酮和17β-雌二醇分泌下降，最終導(dǎo)致配子成熟障礙和生育能力下降。還有研究提出，有YTH結(jié)構(gòu)域含蛋白(YTH domain containing，YTHDC)缺陷的卵母細(xì)胞停滯于早期階段，而YTHDC1的缺失致使卵母細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量的選擇性多腺苷酸，改變了mRNA3′UTR長度，無法正常與甲基結(jié)合蛋白相結(jié)合，失去了甲基結(jié)合蛋白的有效識別后，顯著降低了轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定性，并干擾mRNA的正常翻譯，顯著降低了卵泡成熟率[8]。以往的臨床調(diào)查發(fā)現(xiàn)，與卵巢儲備功能正?；颊呦啾龋琍OI患者的顆粒細(xì)胞中m6A含量明顯升高，并伴隨著FTO表達的下降；體外細(xì)胞實驗發(fā)現(xiàn)，利用siRNA抑制人卵巢顆粒細(xì)胞中FTO的表達后，顆粒細(xì)胞中m6A含量升高，增殖活力下降、凋亡增加，同時FOXL2+、FSHR+、CYR19A1+、AMH+的細(xì)胞比例均顯著下調(diào)[9]。FTO可能成為POI的潛在新型生物標(biāo)志，為POI提供新的診療方案。

2.1.2 m6A修飾與多囊卵巢綜合征

PCOS是由于女性生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)失調(diào)引起的一系列病征，常見于育齡期婦女。PCOS主要有月經(jīng)紊亂、卵巢呈多囊性改變、卵巢排卵功能障礙、胰島素抵抗、肥胖、高雄激素和不孕等臨床表現(xiàn)，從而嚴(yán)重地?fù)p害了女性的正常生殖功能及身心健康[10]。由于PCOS患者臨床表現(xiàn)存在普遍的個體特異性及種族的差異性，由此不難推測，PCOS的發(fā)生及發(fā)展受多種因素的影響。木良善等(2018年)研究認(rèn)為，肥胖與PCOS可能存在互為正相關(guān)的聯(lián)系。FTO是第1個被發(fā)現(xiàn)的肥胖候選基因，位于人類染色體16q12.2，并被廣泛驗證與體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)和肥胖的發(fā)生息息相關(guān)；但是關(guān)于FTO基因上的多態(tài)位點與PCOS的相關(guān)性研究結(jié)論不一致。有研究指出，F(xiàn)TO基因中的rs8050136、rs1588413與PCOS的易感性有一定關(guān)聯(lián)，具有這兩個位點的婦女卵泡發(fā)育或排卵雖然有不同程度的障礙，但植入率高于其他基因型[11]。而在過去一些更早不同地域的相關(guān)研究中，針對FTO基因中的另外一個位點rs9939609，是否與PCOS發(fā)病率有相關(guān)性，則存在截然不同的觀點。這些研究間的差異，一方面有可能來源于研究對象的種族不同，另一方面亦可能來源于PCOS診斷標(biāo)準(zhǔn)及研究方法的不同。但不難推斷FTO是可以不依賴于BMI或肥胖獨立影響PCOS的因素之一。另外，F(xiàn)TO同時又作為一種m6A去甲基化酶，F(xiàn)TO基因異?？梢餸6A修飾出現(xiàn)異常，但若要證實PCOS與m6A甲基化的關(guān)聯(lián)性，尚需行更大樣本量的病例-對照研究。

2.2 m6A修飾與女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤

女性生殖系統(tǒng)腫瘤能嚴(yán)重?fù)p害育齡期女性的生育功能，引發(fā)不孕，或者導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局，惡性腫瘤還會危及女性的生命健康。m6A甲基化與女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤有著緊密的關(guān)系，m6A甲基轉(zhuǎn)移酶、去甲基化酶、結(jié)合蛋白異常都有可能導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

2.2.1 m6A修飾與子宮內(nèi)膜癌

子宮內(nèi)膜癌為女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一。近年來，子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈上升趨勢。據(jù)2015年國家癌癥中心統(tǒng)計，我國子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率為63.4/10萬，死亡率為21.8/10萬。Liu等[12]研究發(fā)現(xiàn)，約70%子宮內(nèi)膜癌組織呈低水平的m6A甲基化，并提出m6A甲基轉(zhuǎn)移酶METTL14(R298P)突變和METTL3的表達下調(diào)，降低了AKT信號通路負(fù)性調(diào)節(jié)分子PHLPP2的表達，同時mTORC2的表達升高，從而增強了AKT信號通路活性，而AKT信號通路的活化可促進子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖、侵襲和致癌性。m6A甲基化可能參與了子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展。但鑒于目前相關(guān)研究數(shù)據(jù)的欠缺，其具體發(fā)病機制仍待進一步的研究。

2.2.2 m6A修飾與宮頸癌

宮頸癌是常見的婦科生殖惡性腫瘤，高發(fā)年齡為50～55歲，并且有年輕化趨勢。Zhou等[13]研究發(fā)現(xiàn)，m6A去甲基化酶FTO在宮頸鱗狀細(xì)胞癌中呈高表達，并可能通過降低β-鏈蛋白(β-catenin) mRNA的m6A甲基化，促進β-catenin的表達，從而引起切除修復(fù)交叉互補基因1(excision repair cross-complementary group 1，ERCC1)水平上升，導(dǎo)致宮頸癌放化療的敏感性降低，影響宮頸癌患者的預(yù)后，提示FTO可能作為宮頸癌患者臨床預(yù)后評估的一項指標(biāo)。Wang等[14]對286例宮頸癌患者的研究發(fā)現(xiàn)，較于相鄰的正常組織，宮頸癌組織中的m6A甲基化處于顯著低水平；敲低宮頸癌細(xì)胞中m6A的METTL3和METTL14，或者過表達m6A去甲基化酶(FTO和ALKBH5)，可下調(diào)m6A甲基化水平，增強腫瘤細(xì)胞增殖活力；相反，敲除FTO和ALKBH5后，可上調(diào)m6A甲基化水平，抑制腫瘤細(xì)胞增殖。綜上可以推斷，m6A甲基化與宮頸癌有密不可分的關(guān)系，而且m6A修飾的關(guān)鍵酶可能成為宮頸癌患者的診斷及臨床預(yù)后評估的一項指標(biāo)。

2.2.3 m6A修飾與卵巢癌

在我國，卵巢癌的發(fā)病率居婦科惡性腫瘤第3位。由于卵巢癌早期無特異性癥狀，篩查有限，早期診斷有較大困難，大部分患者就診時多為晚期。晚期卵巢癌的療效通常不理想，故死亡率居婦科惡性腫瘤之首。X染色體失活特異性轉(zhuǎn)錄因子(X inactive specific transcription factor，XIST)為一種長鏈非編碼RNA，是哺乳動物X染色體大部分基因去活化的主要影響因子，也是X染色體啟動最早的轉(zhuǎn)錄基因。XIST失活可誘發(fā)腫瘤，XIST與卵巢癌存在密切的關(guān)聯(lián)性。人類細(xì)胞中的XIST呈高度甲基化水平。RNA結(jié)合基序蛋白15(RBM15)及其類似物RBM15B，可以富集METTL3，從而實現(xiàn)了對XIST的甲基化修飾；當(dāng)RBM15和RBM15B過表達時，XIST則會抑制X基因的沉默化[15]，引發(fā)卵巢癌。Hua等[16]檢測到卵巢癌患者腫瘤組織中METTL3高表達，并發(fā)現(xiàn)過表達METTL3可促進卵巢癌細(xì)胞的增殖、侵襲；而敲低METTL3，則反之。該研究提示，METTL3能夠通過激活重組AXL受體酪氨酸激酶誘發(fā)卵巢癌細(xì)胞的細(xì)胞上皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，促進卵巢癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移；m6A修飾不但與卵巢癌相關(guān)，且其甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3在卵巢癌的表達水平與卵巢癌的發(fā)生、分期、轉(zhuǎn)移、預(yù)后密切相關(guān)。

3 小結(jié)與展望

RNA表觀遺傳學(xué)對女性生殖系統(tǒng)影響的相關(guān)研究已逐漸成為近年來的熱門話題。而在100多種不同的RNA化學(xué)修飾中，m6A修飾處于尤其重要的地位。各種檢測技術(shù)的發(fā)展也逐漸揭開m6A的神秘面紗。通過這些技術(shù)認(rèn)識到，m6A修飾受到“編碼器”和“消碼器”共同動態(tài)的可逆調(diào)控，并通過不同“讀碼器”的識別作用，調(diào)控RNA的轉(zhuǎn)錄、剪接、加工、穩(wěn)定性、翻譯和衰變，從而參與女性生殖系統(tǒng)相關(guān)疾病的發(fā)生，甚至惡性腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移。同時，這些檢測方法也為疾病患者的早期診斷、早期治療提供了新的方向。雖然對m6A進行了不斷深入的研究，但還存在一些問題。例如，由于m6A同時受到“編碼器”和“消碼器”的動態(tài)調(diào)控，并通過具有不同功能“讀碼器”特異性的精密調(diào)控RNA加工過程。目前尚缺乏對m6A進行動態(tài)監(jiān)測的檢測技術(shù)，所以m6A修飾在疾病發(fā)展過程中的一些潛在機制還有待于進一步探索。這對現(xiàn)有的檢測技術(shù)而言是新的挑戰(zhàn)，也是必然的發(fā)展趨勢。此外，盡管有研究證實某些m6A抑制劑在部分其他系統(tǒng)腫瘤的治療研究方面顯示出可喜的成果[17]，但目前尚缺乏對女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤治療的相關(guān)深入研究，這也正是繼續(xù)努力的方向。期待在不久的將來，m6A抑制劑能充分應(yīng)用在女性生殖診療方面，為女性生殖健康保駕護航。