基于分子對接技術篩選金銀花抗新型冠狀病毒活性成分研究

孫玉 郭中原 陳兩綿 關亮俊 房蘊歌 高慧敏 王智民

摘要 目的：運用分子對接技術篩選金銀花抗新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）潛在活性成分，為發(fā)現(xiàn)抗SARS-CoV-2先導化合物以及揭示金銀花抗新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）的物質基礎提供參考。方法：在文獻總結并結合中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）數(shù)據(jù)庫檢索的基礎上，建立涵蓋金銀花中382個化合物的化學成分庫，以SARS-CoV-2 3CL水解酶（3CL Protease，Mpro）以及SARS-CoV-2與血管緊張素轉換酶2（ACE2）復合物為分子對接靶標，利用Discovery Studio軟件進行分子對接，以打分值大小篩選抗SARS-CoV-2潛在活性成分。結果：金銀花中三萜皂苷類成分與SARS-CoV-2 Mpro有較強的結合力，以SARS-CoV-2 Mpro晶體結構復合的原抑制劑N3為陽性對照，7個化合物為其潛在抑制劑;環(huán)烯醚萜類和神經(jīng)酰胺類成分對SARS-CoV-S/ACE2復合物的阻斷較好，保留打分值前3%的化合物，10個化合物可作為SARS-CoV-S/ACE2復合物的潛在阻斷劑。結論：從金銀花中發(fā)現(xiàn)16個潛在抗SARS-CoV-2活性成分。本研究為闡明金銀花抗擊COVID-19的藥效物質基礎提供參考，同時為發(fā)現(xiàn)新的抗SARS-CoV-2先導化合物指明方向。

關鍵詞 金銀花;新型冠狀病毒肺炎;分子對接;新型冠狀病毒Mpro;SARS-CoV-S/ACE2復合物;三萜皂苷;環(huán)烯醚萜;神經(jīng)酰胺

Screening of the Active Components from Flos Lonicerae against SARS-CoV-2 by Molecular Docking

SUN Yu1，2，GUO Zhongyuan2，CHEN Liangmian2，GUAN Liangjun2，F(xiàn)ANG Yunge1，2，GAO Huimin2，WANG Zhimin2，3

（1 Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China; 2 National Engineering Laboratory for Quality Control Technology of Chinese Materia Medica， Institute of Chinese Materia Medica，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China; 3 School of Pharmacy，Henan University of Chinese Medicine，Zhengzhou 450008，China）

Abstract Objective：To screening potential active constituents against SARS-CoV-2 from Lonicera japonica Flos（LJF） by molecular docking technology and provide reference for discovery of lead compounds against SARS-CoV-2 and interpretation of its active substances for the treatment of COVID-19.Methods：The database of 382 chemical constituents from LJF was established based on the literature summary，combining TCMSP database retrieval.SARS-CoV-2 Mpro and SARS-CoV-2/angiotensin-converting enzyme 2（ACE2） were employed as molecular docking targets.Discovery Studio software was used for virtual calculation and the potential active components against SARS-CoV-2 were picked out on the basis of the ranking of docking score.Results：Triterpenoid saponins in LJF had strong affinity with SARS-CoV-2 Mpro and 7 compounds were potential inhibitors，taking SARS-CoV-2 Mpro crystal structure complex inhibitor N3 as the positive control.Iridoids and ceramides had a good blocking effect on SARS-CoV-S/ACE2 complex and 10 compounds were potential blockers.Conclusion：A total of 16 Potential active compounds against SARS-CoV-2 were found from LJF.The present study provides reference for clarifying effective substances of LJF against COVID-19，and discovering lead compounds against SARS-CoV-2 from LJF.

Keywords Flos Lonicerae; COVID-19; Molecular docking; SARS-CoV-2 Mpro; SARS-CoV-S/ACE2 complex; Triterpenoid saponin; Iridoid; Ceramide

中圖分類號：R285;R254.3;R256.1文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.17.002

新型冠狀病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019，COVID-19）疫情成為世界性突發(fā)公共衛(wèi)生事件，并呈持續(xù)蔓延態(tài)勢，多國出現(xiàn)了不同程度的新型冠狀病毒（SARS Coronavirus 2，SARS-CoV-2）毒株變異情況，是當前亟待解決的重大醫(yī)學難題。COVID-19屬于中醫(yī)“疫病”范疇[1]，中醫(yī)藥在疫病防治方面具有積極作用，比如近年來發(fā)生的嚴重急性呼吸綜合征（Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS），甲型H1N1流感（Influenza A，H1N1）以及H7N9型禽流感（Avian Influenza，H7N9）等多次疫情，特別是在本次新冠疫情防治中，展現(xiàn)了令人振奮的臨床效果。然而，仍有一些不和諧的聲音質疑中醫(yī)藥的療效，為此，現(xiàn)就COVID-19診療方案中的重要藥味——金銀花，采用分子對接的方法來揭示中醫(yī)藥抗擊COVID-19的科學性。

金銀花是清熱解毒藥的代表品種之一，為忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾或初開的花，具有清熱解毒、涼散風熱功效，主治癰腫疔瘡、喉痹、丹毒、熱毒血痢、風熱感冒、溫病發(fā)熱[2]。在國家及26個省市公布推薦用于防治COVID-19的中成藥和臨床調劑方中，金銀花有著較高的使用頻率，如痰熱清注射液、熱毒寧注射液、金花清感顆粒和連花清瘟膠囊等。自疫情發(fā)生以來，采用網(wǎng)絡藥理學和分子對接技術研究金銀花復方及其中成藥制劑抗COVID-19的研究有很多[3-6]，為快速發(fā)現(xiàn)和開發(fā)新的治療方法和藥物提供了有效信息。但是在多數(shù)研究中，組方藥味（包括金銀花）所含化學成分的搜集來源于中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）公共數(shù)據(jù)庫，該數(shù)據(jù)庫收載的金銀花化學成分主要為以綠原酸為代表的酚酸類、黃酮類和揮發(fā)性成分，對于許多新發(fā)現(xiàn)的化合物，比如結構新穎的環(huán)烯醚萜類和三萜皂苷類成分，未及時更新和補錄。為了充分認識金銀花在COVID-19防治中的作用，闡明其發(fā)揮藥效的物質基礎，本研究在自建金銀花化學成分庫的基礎上，選用文獻研究相對成熟的SARS-CoV-2 Mpro和SARS-CoV-S/血管緊張素轉換酶2（Angiotensin Converting Enzyme 2，ACE2）復合物為篩選靶標，從抑制病毒復制和阻斷病毒與宿主細胞ACE2結合2個方面，進行金銀花全成分的分子對接研究，以獲得抗SARS-CoV-2的潛在活性成分，為揭示金銀花發(fā)揮防治作用的科學內涵提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究使用數(shù)據(jù)庫包括TCMSP（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）和蛋白質結構數(shù)據(jù)庫（Protein Data Bank，PDB，https：//www.rcsb.org）;分析軟件包括繪制化合物結構的ChemBio Draw Ultra 2014和用于分子對接的Discovery Studio 2019（DS 2019）。

1.2 金銀花化學成分庫建立 金銀花主要化學成分包括有機酸、黃酮、環(huán)烯醚萜、三萜皂苷及揮發(fā)油等，具有抑菌、抗病毒、抗炎、抗氧化等藥理作用[7]。在本課題組長期研究金銀花的基礎上，結合最新文獻報道，整理了金銀花中各類別化學成分382個，涵蓋TCMSP數(shù)據(jù)庫中215個化合物，增補167個化合物。TCMSP數(shù)據(jù)庫中下載化合物2D結構保存為*mol2格式，新增補的成分利用ChemBio Draw 2014軟件構建2D結構保存為*cdx格式，利用DS 2019軟件轉換為*dsv格式。見表1，圖1。

1.3 靶點蛋白的選擇 分子對接用的蛋白晶體結構通過PDB獲得，SARS-CoV-2 Mpro晶體結構PDB編號為6LU7，分辨率為2.16 。見圖2A。SARS-CoV-S/ACE2復合蛋白晶體結構PDB編號為2AJF，分辨率為2.90 。見圖2B。

1.4 分子對接 通過DS 2019的Receptor-Ligand interactions模塊定義晶體結構的活性口袋半徑及坐標位置。SARS-CoV-2 Mpro由306個氨基酸組成，形成二聚體后產(chǎn)生水解酶活性，其145位的半胱氨酸（CYS）和41位的組氨酸（HIS）是形成催化二聚體的關鍵位點。根據(jù)靶標蛋白6LU7中復合物N3定義活性口袋，活性口袋半徑為13.893 ，坐標位置為-10.786、12.536、68.919。見圖3A。以SARS-CoV-S/ACE2作為靶標，靶標蛋白2AJF中A鏈的氨基酸ASP38、GLN42、GLN325和GLU329，E鏈的氨基酸TYR436和TYR491作為關鍵氨基酸，以關鍵氨基酸定義活性口袋，活性口袋半徑為17.552 ，坐標位置為9.409、-7.134、70.739。見圖3B。金銀花化學成分加入立場以及立體化處理，采用DS 2019軟件Libdock模塊分別與6LU7和2AJF進行分子對接，選取BEST對接模式，每個配體保留最優(yōu)的構象，其他參數(shù)默認設置。計算完畢后，將對接結果按照打分值排序，對于Mpro，以其晶體結構復合物抑制劑N3為陽性對照，保留打分值大于N3的化合物作為潛在抑制劑;對于SARS-CoV-S/ACE2復合物，保留打分值排序前3%的化合物，作為潛在的阻斷劑。

2 結果

金銀花中三萜皂苷類成分對SARS-CoV-2 Mpro具有較強的親合力，環(huán)烯醚萜類和神經(jīng)酰胺類成分對SARS-CoV-S/ACE2復合物的阻斷較好，共篩選出16個潛在活性化合物。各類型的化合物參與對接和篩選出的潛在結合成分見圖4。篩選出的化合物結構式見圖5。

2.1 SARS-CoV-2 Mpro潛在抑制劑 金銀花化學成分庫中，382個化合物參與分子對接，與Mpro結合的有359個，以Mpro抑制劑N3為陽性對照，打分值高于N3的化學成分有7個，潛在活性成分與靶點對接作用情況見表2。三萜皂苷類成分1、2和黃酮類成分4對Mpro結合能力強，打分值最高?；衔?糖鏈上的羥基與MET165、THR190、GLN192、TYR54、ARG188形成H鍵，與ALA191、PRO168殘基形成烷基-π鍵，附近也存在一些較弱的C、H鍵，如GLN189、GLU166。MET165不僅作為H鍵提供質子，還與配體產(chǎn)生硫-X（Sulfur-X）作用。SER144與皂苷母核上的基團形成H鍵作用，CYS145、HIS163與配體產(chǎn)生烷基-π鍵作用。在打分值高的化合物中，能與關鍵氨基酸CYS145或HIS41形成H鍵的有4個，提示這4個化合物可能有抑制Mpro二聚體形成的作用，其中化合物4為含有咖啡?；狞S酮雙糖苷，具有較強的抗炎活性[8]，HIS41不僅可以與黃酮糖苷上的羥基形成H鍵，還可與咖啡?；系谋江h(huán)發(fā)生T形π-π鍵作用，這可能是化合物4與Mpro結合力強的原因?；衔?是含有2個糖的苯并呋喃木脂素，CYS145不僅可以和糖上的酚羥基形成H鍵，和苯環(huán)形成硫-π鍵，還可與呋喃環(huán)形成烷基-π鍵，多鍵相互作用可能是化合物9成為潛在Mpro抑制劑的原因。N3和代表性成分與Mpro的相互作用見圖6。

2.2 潛在SARS-CoV-S/ACE2復合物結合阻斷劑?? 金銀花化學成分庫中382個化合物參與分子對接，與SARS-CoV-S/ACE2復合物結合的有331個，保留打分值排序前3%的10個成分作為潛在活性成分，潛在活性成分與靶點對接作用見表3。

保留打分值排序前3%的化合物，環(huán)烯醚萜類和神經(jīng)酰胺類化合物與SARS-CoV-S/ACE2復合物有較好親和力，化合物5和7（神經(jīng)酰胺類）以及化合物11（環(huán)烯醚萜類）的打分值最高。作為潛在的SARS-CoV-S/ACE2復合物阻斷劑，化合物11與SER44、ASN394、HIS401發(fā)生H鍵作用，與HIS401殘基產(chǎn)生烷基-π鍵作用，PHE390、熱點殘基GLU37的正電荷、ARG393的陰離子對配體也存在影響;化合物11還可與ASP350形成電荷吸引力，與ARG393形成鹽橋作用。化合物7、10和14均能與熱點殘基HIS34產(chǎn)生烷基-π鍵作用，而化合物14不僅能與熱點殘基GLU37產(chǎn)生電荷吸引力，還可與關鍵氨基酸TYR491發(fā)生H鍵作用。ACE2中LYS353殘基在與病毒S蛋白結合過程中起非常關鍵的作用，是核心位點[9]，既可以與化合物8形成烷基-π鍵，還能與化合物16形成H鍵。代表性活性成分與SARS-CoV-S/ACE2蛋白質的相互作用見圖7。

3 討論

現(xiàn)代研究表明金銀花具有多種抗病毒作用，其單味藥材的口服液能較好改善COVID-19普通型患者的肺部功能，并能顯著縮短住院天數(shù)及病毒核酸轉陰時長，具有廣闊的COVID-19治療前景[10]。鑒于中藥多成分、多靶點的作用特點，以及開展SARS-CoV-2活性成分篩選工作的難度和時效性，分子對接技術已成為揭示中醫(yī)藥抗擊COVID-19作用科學性的重要手段，并可快速挖掘具有潛在抗SARS-CoV-2的類藥小分子。SARS-CoV-2 Mpro和ACE2是當前抗SARS-CoV-2藥物篩選的關鍵靶標，因此，本研究在自建金銀花化學成分庫的基礎上，采用分子對接技術，從抑制Mpro和阻斷S-蛋白和宿主ACE2結合2個環(huán)節(jié)，篩選出金銀花中16個潛在抗SARS-CoV-2的活性化合物，其中Mpro潛在抑制劑7個，主要為三萜皂苷類;潛在SARS-CoV-S/ACE2復合物結合阻斷劑10個，多為環(huán)烯醚萜和神經(jīng)酰胺類成分，其中神經(jīng)酰胺類成分Lonijaposide A1（5）既能夠抑制Mpro，又可阻斷S-蛋白和宿主ACE2結合。金銀花中三萜皂苷類成分抗病毒作用鮮有研究，后續(xù)可針對該類成分開展藥理活性驗證，以發(fā)現(xiàn)新的先導化合物。

以SARS-CoV-2 Mpro為靶標，通過結合模式分析，活性成分與N3發(fā)生作用的關鍵氨基酸重合，預測的活性成分與N3有相似的生物活性，形成相互作用主要是CYS145、HIS41和GLU166殘基等。從化合物類別來看，主要是三萜皂苷類與靶點的親和力相對較強，特別是其中糖上羥基容易和Mpro的氨基酸雜原子形成H鍵。此外，皂苷與蛋白質能以H鍵、疏水相互作用、范德華力等方式進行結合，從而更好地發(fā)揮生物活性[11]，這可能是三萜皂苷類成分與Mpro結合力相對較強的原因。以SARS-CoV-S/ACE2復合物為靶標，篩選出的潛在阻斷劑主要是環(huán)烯醚萜類和神經(jīng)酰胺類成分。通過結合模式分析，潛在活性成分多與SARS-CoV-S/ACE2復合物蛋白的熱點殘基發(fā)生作用。環(huán)烯醚萜類Lonijaposide W（11）和Lonijaposide R（12）與ARG393殘基間鹽橋作用，從而阻斷SARS-CoV-S/ACE2復合物，這與之前研究認為冠狀病毒S-蛋白與宿主細胞受體的特異性識別和結合主要通過氨基酸分子間電性、極性差異形成的鹽橋結果一致[12-13]。神經(jīng)酰胺類化合物Lonijaposide A3-A4（7-8）、Lonijaposide A1（5）與SARS-CoV-S/ACE2復合物靶點蛋白親和力較好，而化合物5既是潛在的Mpro抑制劑，又是SARS-CoV-S/ACE2復合物阻斷劑。

除了上述靶點，文獻報道金銀花三萜皂苷和環(huán)烯醚萜部位具有抑菌作用，尤其是對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌敏感[14-15]，可以輔助治療COVID-19患者后期感染問題。在臨床上，有大量COVID-19患者會出現(xiàn)呼吸系統(tǒng)癥狀外的肝受損現(xiàn)象[16]，金銀花總皂苷能降低血清中丙二醛含量和天冬氨酸轉氨酶活力，提高超氧化物歧化酶活力從而起到保肝作用[17]。此外，需要說明的是，COVID-19危重型患者病情加重與“細胞因子風暴”密切相關，多項研究從炎癥-氧化應激-細胞因子風暴角度闡明了中醫(yī)藥治療COVID-19與抗炎、抗氧化作用有關[18]。金銀花可能通過酚酸或黃酮類成分發(fā)揮抗炎、免疫調節(jié)、抗氧化等其他藥理作用，實現(xiàn)多成分、多途徑、多靶點防治COVID-19的作用，比如金銀花醇提物可顯著抑制NO釋放，降低IL-1β、TNF-α、IL-6等炎癥介質的釋放[19];有機酸類成分綠原酸、隱綠原酸、3，4-二咖啡?？鼘幩岬葘PS刺激的巨噬細胞炎癥介質均具有不同程度的抑制作用[20];黃酮類成分如金絲桃苷、忍冬苷和木犀草素可通過抑制核因子κB信號通路顯著發(fā)揮抗氧化和抗炎作用[21];金銀花湯劑中MIR-2911可通過飲用被人體有效吸收，并在體內有效抑制SARS-CoV-2復制，加速COVID-19患者康復[22]。

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（2021-01-26收稿 責任編輯：王明）