禾谷鐮刀菌拮抗菌ZQT-9的鑒定與抑菌活性

張艷茹 霍云鳳 石紅利 張強(qiáng)

摘要：為發(fā)掘?qū)坦如牭毒哂休^好拮抗能力的細(xì)菌，從小麥植株殘?bào)w中分離篩選得到1株細(xì)菌菌株ZQT-9，根據(jù)形態(tài)學(xué)特征、生理生化特征以及16S rDNA序列分析相結(jié)合的方法進(jìn)行鑒定，并對其抑菌活性進(jìn)行研究。結(jié)果表明，菌株ZQT-9為多黏類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa），對禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）的抑菌率為（57.6±0.8）%。菌株ZQT-9無菌發(fā)酵液對禾谷鐮刀菌的孢子萌發(fā)和菌絲生長具有明顯抑制作用，并且當(dāng)無菌發(fā)酵液濃度為50%時(shí)可以完全抑制禾谷鐮刀菌孢子的萌發(fā)。PCR檢測結(jié)果表明，菌株ZQT-9可能具有編碼多黏菌素B、多黏菌素C、水解蛋白酶、β-葡聚糖及殺鐮孢菌素等5種抗菌物質(zhì)的相關(guān)基因。此外，菌株ZQT-9對鏈格孢菌（Alternaria alternata）、尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）、凸臍蠕孢（Exserohilum turcicum）、甜櫻間座殼菌（Diaporthe eres）等4種植物病原真菌均具有明顯的抑制作用。綜上所述，多黏類芽孢桿菌ZQT-9具有潛在的生物防治應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：禾谷鐮刀菌;多黏類芽孢桿菌;生物防治;抑菌活性;菌株鑒定

中圖分類號：S435.121.4+5? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2021）18-0111-05

收稿日期：2021-02-15

基金項(xiàng)目：河南科技學(xué)院自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計(jì)劃（編號：208010617006）。

作者簡介：張艷茹（1993—），女，河北南皮人，碩士，助教，主要從事植物病害生物防治研究。E-mail：920415575@qq.com。

通信作者：張 強(qiáng)，博士，講師，主要從事禾谷鐮刀菌基因功能及生物防治研究。E-mail：zhangqiang4503@163.com。

由禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）侵染引起的小麥赤霉病是我國小麥生產(chǎn)上的一種重要病害[1]。2010年以來，我國小麥赤霉病的流行頻率明顯高于20世紀(jì)[2-3]。僅河南省，小麥赤霉病年平均發(fā)生面積為126.17萬hm2，產(chǎn)量年均損失26.72萬t[4]。小麥赤霉病的發(fā)生不僅造成產(chǎn)量損失，而且病原菌還可以分泌多種真菌毒素，進(jìn)而影響人畜健康[5]。除侵染小麥穗部以外，禾谷鐮刀菌還可以導(dǎo)致小麥莖基腐病的發(fā)生[6]。目前，噴施化學(xué)藥劑仍然是防治禾谷鐮刀菌所致病害的重要措施，但隨著化學(xué)藥劑的長期使用，不僅導(dǎo)致耐藥菌株在田間普遍出現(xiàn)，而且還會促進(jìn)病原菌毒素的合成與積累[2，7-8]。

利用微生物或其代謝產(chǎn)物對植物病害進(jìn)行生物防治已成為病害綜合治理中的重要組成部分，并且對我國農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義[9-10]。在禾谷鐮刀菌的眾多生防菌中，芽孢桿菌的研究最為廣泛，如枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[11]、解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefacien）[12]、貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis）[13]、多黏類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）[14]等對禾谷鐮刀菌都具有較好的抑制能力。本研究從田間小麥植株殘?bào)w上分離到1株對禾谷鐮刀菌具有明顯拮抗作用的生防菌株ZQT-9，通過對該菌株進(jìn)行研究，以期為禾谷鐮刀菌所致病害的生物防治提供微生物資源和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）PH-1菌株，由西北農(nóng)林科技大學(xué)-普渡大學(xué)聯(lián)合研究中心惠贈;鏈格孢菌（Alternaria alternata）、尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）、凸臍蠕孢（Exserohilum turcicum）、甜櫻間座殼菌（Diaporthe eres）均為筆者所在研究室保藏菌株;多黏類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）ZQT-9菌株，分離于田間小麥植株殘?bào)w。

1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15 g、水1 L。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、瓊脂15 g、水1 L，pH值為7.4～7.6。

羧甲基纖維鈉（CMC）培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉15.0 g、酵母提取物1.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、NH4NO3 1.0 g、KH2PO4 1.0 g、水1 L。

酵母浸出粉胨葡萄糖（YEPD）培養(yǎng)基：酵母提取物3 g、葡萄糖20 g、蛋白胨10 g、水1 L。

1.3 細(xì)菌分離

于2019年6月在河南科技學(xué)院東區(qū)試驗(yàn)田采集小麥植株殘?bào)w，并于資源與環(huán)境學(xué)院植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室開展后續(xù)試驗(yàn)。樣品用無菌水沖洗干凈后，置于75%乙醇中浸泡3 min，再用無菌水沖洗3遍。處理后的樣品放于研缽中研碎，然后將研磨液用 80 ℃ 水浴處理30 min，以殺死大多非芽孢細(xì)菌。取100 μL研磨液于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上涂布，28 ℃培養(yǎng)3 d。最后根據(jù)菌落特征挑取不同單菌落，劃線純化后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.4 禾谷鐮刀菌拮抗細(xì)菌的篩選

采用皿內(nèi)對峙法，將5 mm直徑大小的禾谷鐮刀菌菌餅接于PDA培養(yǎng)基平板中央，挑取待測細(xì)菌接種4點(diǎn)（距中心25 mm處），25 ℃條件下培養(yǎng)3 d后計(jì)算抑菌率。以不接禾谷鐮刀菌菌餅，只接待測細(xì)菌的處理為對照。抑菌率=（對照組菌落直徑-試驗(yàn)組菌落直徑）/對照菌落直徑×100%。

1.5 菌株ZQT-9分類鑒定

1.5.1 形態(tài)及生理生化鑒定

具體方法參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》進(jìn)行[15]。

1.5.2 16S rDNA PCR擴(kuò)增及系統(tǒng)發(fā)育分析

以基因組DNA為模板，利用通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）對菌株ZQT-9的16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行純化測序。根據(jù)測序結(jié)果，在GenBank數(shù)據(jù)庫下載相關(guān)菌株的16S rDNA序列，用ClustalX 1.83軟件比對后，利用Mega 7.0軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6 菌株ZQT-9無菌發(fā)酵液的獲得

挑取菌株ZQT-9單菌落于10 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，180 r/min、28 ℃條件下培養(yǎng)24 h，之后按照10%接種量2次搖培3 d，獲得菌株 ZQT-9 發(fā)酵液。將發(fā)酵液置于12 000 r/min條件下離心15 min，再將上清液用0.22 μm微孔濾膜過濾，從而獲得無菌發(fā)酵液。

1.7 菌株ZQT-9無菌發(fā)酵液對禾谷鐮刀菌的抑制作用

1.7.1 對孢子萌發(fā)的影響

挑取禾谷鐮刀菌1 cm×1 cm大小菌塊于CMC培養(yǎng)基中，150 r/min、25? ℃條件下?lián)u培5 d。培養(yǎng)液用濾布進(jìn)行過濾，3 500 r/min離心10 min后收集孢子，然后用YEPD培養(yǎng)基重懸浮，并調(diào)整孢子濃度為1×106個(gè)/mL。按照10%、20%、50%的終濃度加入菌株ZQT-9無菌發(fā)酵液，搖培12 h后利用顯微鏡觀察禾谷鐮刀菌孢子的萌發(fā)情況。以不加菌株ZQT-9無菌發(fā)酵液為對照。

1.7.2 對菌絲生長的影響

在9 mL YEPD培養(yǎng)基中加入1 mL禾谷鐮刀菌孢子懸浮液，150 r/min、25 ℃ 條件下?lián)u培12 h，以獲得菌絲體。之后按照10%、20%、50%的終濃度加入菌株ZQT-9無菌發(fā)酵液，搖培24 h后對禾谷鐮刀菌的菌絲形態(tài)進(jìn)行顯微觀察。以不加菌株ZQT-9無菌發(fā)酵液為對照。

1.8 菌株ZQT-9抗菌物質(zhì)的PCR檢測

菌株ZQT-9抗菌物質(zhì)的類別利用已報(bào)道的抗菌物質(zhì)合成相關(guān)基因的PCR擴(kuò)增進(jìn)行檢測，引物序列見表1。

1.9 菌株ZQT-9對不同植物病原真菌的拮抗作用

將直徑為5 mm的不同病原真菌菌餅置于PDA培養(yǎng)基平板中央，挑取菌株ZQT-9接種4點(diǎn)（距中心 25 mm 處），25 ℃條件下培養(yǎng)5 d后測量抑菌帶寬度。抑菌帶寬度為細(xì)菌菌落與平板中心方向，細(xì)菌菌落邊緣至真菌菌落邊緣的距離。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株ZQT-9對禾谷鐮刀菌的拮抗效果

將菌株ZQT-9與禾谷鐮刀菌PH-1菌株進(jìn)行皿內(nèi)對峙培養(yǎng)，結(jié)果表明，菌株ZQT-9對禾谷鐮刀菌的菌落生長具有較強(qiáng)的抑制作用，抑菌率為（57.6±0.8）%（圖1）。

2.2 菌株ZQT-9的分類鑒定

2.2.1 形態(tài)特征及生理生化特征

菌株ZQT-9在PDA培養(yǎng)基上的菌落呈乳白色，凸起，表面光滑，邊緣規(guī)則，具有黏性，菌體桿狀，革蘭氏染色陽性。生理生化特征鑒定結(jié)果表明，菌株ZQT-9能夠利用葡萄糖、蔗糖、甘油、甘露醇，不能利用半乳糖，可以水解淀粉和明膠，硝酸鹽還原和V-P試驗(yàn)呈陽性，不產(chǎn)生硫化氫（表2）。

2.2.2 16S rDNA 序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

以基因組DNA為模板，對菌株ZQT-9的16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測序后獲得1 500 bp左右的序列。經(jīng)GenBank數(shù)據(jù)庫比對后發(fā)現(xiàn)，菌株ZQT-9與多黏類芽孢桿菌（P. polymyxa）多個(gè)菌株的16S rDNA序列同源性達(dá)99%以上。采用鄰接法構(gòu)建16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明，菌株ZQT-9與P. polymyxa VNRM51、VNRM47、PY7及1178聚類在一起，形成1個(gè)分支（圖2）。結(jié)合形態(tài)和生理生化特征，將菌株ZQT-9鑒定為多黏類芽孢桿菌。

2.3 菌株ZQT-9無菌發(fā)酵液對禾谷鐮刀菌孢子萌發(fā)和菌絲生長的抑菌作用

在YEPD中培養(yǎng)12 h后，對照組中的禾谷鐮刀菌孢子能夠正常萌發(fā)，并形成粗細(xì)均勻的菌絲。當(dāng)溶液中分別含有10%、20%濃度的菌株ZQT-9無菌發(fā)酵液時(shí)，禾谷鐮刀菌的孢子可以正常萌發(fā)，但是部分芽管生長出現(xiàn)畸形，頂端囊泡化。當(dāng)菌株ZQT-9無菌發(fā)酵液濃度達(dá)到50%時(shí)，孢子結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯變化，局部膨大變形，并且喪失萌發(fā)能力（圖3）。分別用10%、20%、50%終濃度的菌株ZQT-9無菌發(fā)酵液處理禾谷鐮刀菌的菌絲24 h后，不同濃度下禾谷鐮刀菌的菌絲生長都出現(xiàn)畸形，頂端囊泡化。而對照組的菌絲能夠正常生長（圖4）。結(jié)果表明，菌株ZQT-9不同濃度的無菌發(fā)酵液都可以影響禾谷鐮刀菌的孢子萌發(fā)及菌絲生長，并且高濃度的無菌發(fā)酵液還能夠完全抑制孢子的萌發(fā)。

2.4 菌株ZQT-9拮抗物質(zhì)基因的鑒定

利用5對拮抗物質(zhì)基因的引物對菌株ZQT-9的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示，5種基因都被成功擴(kuò)增（圖5）。由此推測，菌株ZQT-9基因組中可能存在水解蛋白酶、β-葡聚糖、多黏菌素B、 多黏菌素C及殺鐮孢菌素代謝合成操縱子序列，并產(chǎn)生相應(yīng)的抗菌物質(zhì)。

2.5 菌株ZQT-9對不同植物病原真菌的抑制效果

皿內(nèi)對峙結(jié)果表明，菌株ZQT-9對4種植物病原真菌都具有明顯的抑制作用，其中對鏈格孢菌的抑制作用最強(qiáng)，抑菌帶寬度為7.6 mm左右。對尖孢鐮刀菌、凸臍蠕孢及甜櫻間座殼菌的抑菌帶寬度均在 4～5 mm之間（表3）。表明菌株ZQT-9具有一定的抑菌譜。

3 結(jié)論與討論

由于缺乏優(yōu)質(zhì)抗病品種、揚(yáng)花期天氣高溫高濕、秸稈還田及病原菌抗藥性的普遍出現(xiàn)，導(dǎo)致近年來我國小麥赤霉病的發(fā)生危害日益嚴(yán)重，從而給小麥安全生產(chǎn)帶來巨大威脅[3]。另外，小麥莖基腐病的發(fā)生也逐漸出現(xiàn)加重的趨勢[16]。利用有益微生物對禾谷鐮刀菌所致病害進(jìn)行防治，不僅能夠有效減少化學(xué)農(nóng)藥的使用，而且符合綠色農(nóng)業(yè)的發(fā)展要求。本研究從小麥植株殘?bào)w上分離得到1株對禾谷鐮刀菌具有明顯抑制作用的拮抗菌株ZQT-9，綜合培養(yǎng)特征、生理生化特性及系統(tǒng)進(jìn)化分析，將其鑒定為多黏類芽孢桿菌。該菌株的不同濃度無菌發(fā)酵液都能夠影響禾谷鐮刀菌的孢子萌發(fā)過程，并且該菌株高濃度的無菌發(fā)酵液可以完全抑制禾谷鐮刀菌的孢子萌發(fā)。另外，該菌株無菌發(fā)酵液對禾谷鐮刀菌的菌絲生長也具有明顯的抑制作用，可以導(dǎo)致菌絲出現(xiàn)畸形。此外，菌株ZQT-9對尖孢鐮刀菌等4種植物病原真菌均有較好的抑制效果，說明該菌株具有防治多種病害的潛力。

多黏類芽孢桿菌在自然界分布廣泛，不僅可以能夠固氮，而且可以產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)和植物生長素，從而對植物具有很好的防病促生作用[17-19]。研究表明，多黏類芽孢桿菌對大豆疫霉病菌[20]、油菜菌核病病菌[21]、辣椒炭疽病菌[22]、蘋果樹腐爛病菌[23]、海棠銹病[24]及南方根結(jié)線蟲[25]等多種病原物都具有拮抗能力。李峰等發(fā)現(xiàn)，多黏類芽孢桿菌HB022無菌發(fā)酵液可以使禾谷鐮刀菌的菌絲出現(xiàn)畸形、斷裂等現(xiàn)象;另外，無菌發(fā)酵液濃度越高，對禾谷鐮刀菌孢子萌發(fā)的抑制能力越強(qiáng)，當(dāng)濃度為20%時(shí)就可以完全抑制孢子的萌發(fā)[26]。本研究結(jié)果表明，多黏類芽孢桿菌ZQT-9無菌發(fā)酵液也能夠使禾谷鐮刀菌的菌絲出畸形，但是只有當(dāng)ZQT-9無菌發(fā)酵液終濃度為50%時(shí)才能夠完全抑制禾谷鐮刀菌孢子的萌發(fā)能力。推測造成這一試驗(yàn)結(jié)果不同的原因，可能與菌株來源或培養(yǎng)條件不同，從而產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)不同有關(guān)。

多黏類芽孢桿菌能夠產(chǎn)生植物激素、胞外多糖等多種活性物質(zhì)，如菌株A26的胞外多糖，尤其是糖醛酸鹽的含量在對禾谷鐮刀菌的拮抗中起到重要作用[27]。多黏類芽孢桿菌合成脂肽類抗生素是發(fā)揮其生防功能的重要原因之一[28]。本研究利用PCR檢測發(fā)現(xiàn)，菌株ZQT-9具有水解蛋白酶、β-葡聚糖、多黏菌素B、多黏菌素C及殺鐮孢菌素代謝合成相關(guān)基因，由此推測該菌株可能產(chǎn)生上述幾種抗菌物質(zhì)。

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