蒺藜苜蓿MtPEAMT基因克隆及其序列比對(duì)分析

季曉敏 沈益新 遲英俊

摘要：從蒺藜苜蓿中克隆得到磷酸乙醇胺甲基轉(zhuǎn)移酶（PEAMT）的編碼序列和啟動(dòng)子序列，通過序列對(duì)比，對(duì)蒺藜苜蓿、擬南芥、番茄等14種植物PEAMT的核苷酸序列及氨基酸序列進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，蒺藜苜蓿與其他13種PEAMT的基因結(jié)構(gòu)十分相似，除大豆PEAMT外，均含有12個(gè)外顯子和11個(gè)內(nèi)含子。14種PEAMT蛋白質(zhì)長度為 475～501個(gè)氨基酸，分子量為53.86～57.09 ku，等電點(diǎn)均小于7，為親水性蛋白。14種PEAMT均無跨膜結(jié)構(gòu)，無信號(hào)肽，均定位于細(xì)胞質(zhì)。蒺藜苜蓿PAEMT在其N端和C端各有一個(gè)保守的甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域，并包含4個(gè)SAM依賴性基序（I、p-I、II、III）。14種植物PAEMT嚴(yán)格按照生物種屬進(jìn)行聚類，其中蒺藜苜蓿PEAMT和木豆PEAMT的親緣關(guān)系最近。蒺藜苜蓿PEAMT易被蛋白激酶C、EGFR激酶、蛋白激酶A、cdc2等激酶磷酸化。蒺藜苜蓿與其他13種PEAMT的啟動(dòng)子區(qū)域均含有一些逆境響應(yīng)元件和植物激素響應(yīng)元件。綜上所述，植物PEAMT在進(jìn)化過程中十分保守，都具有響應(yīng)植物非生物脅迫的特性。

關(guān)鍵詞：磷酸乙醇胺甲基轉(zhuǎn)移酶;蒺藜苜蓿;磷脂酰膽堿;甜菜堿甘氨酸;脅迫響應(yīng)

中圖分類號(hào)： S541+.901? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）18-0054-11

收稿日期：2021-01-24

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31601324）;作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題（編號(hào)：ZW201904）。

作者簡介：季曉敏（1994—），男，江蘇南通人，碩士，主要從事草類植物分子生物學(xué)研究。E-mail：xiaominji941219@163.com。

通信作者：遲英俊，博士，講師，主要從事分子遺傳學(xué)研究。E-mail：yingjunchi@njau.edu.cn。

磷酸乙醇胺甲基轉(zhuǎn)移酶（PEAMT）是一種S-腺苷甲硫氨酸依賴性的甲基轉(zhuǎn)移酶。在植物體內(nèi)，它主要催化3步連續(xù)的甲基化反應(yīng)，從磷酸乙醇胺經(jīng)由磷酸單甲基乙醇胺和磷酸二甲基乙醇胺2種中間產(chǎn)物最終轉(zhuǎn)化成磷酸膽堿[1]。磷酸膽堿是磷脂酰膽堿和甘氨酸甜菜堿的合成前體[2-3]。磷脂酰膽堿作為真核生物體內(nèi)一種重要的結(jié)構(gòu)膜脂質(zhì)，有利于增加膜的流動(dòng)性，提高機(jī)體的抗氧化活性，防止膜損傷[4]。此外，磷脂酰膽堿還是磷脂酸等信號(hào)分子的前體[5]，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，磷脂酰膽堿通過與膜蛋白結(jié)合，直接參與膜介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)[6]。甘氨酸甜菜堿是一種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，它能提高細(xì)胞質(zhì)中的滲透壓，在鹽、干旱、低溫等脅迫環(huán)境下保護(hù)植物的細(xì)胞膜，維持其脂膜的完整性[7-8]。由此可見，PEAMT在膜生物發(fā)生、發(fā)育和脅迫適應(yīng)中扮演著重要角色。

鑒于PEAMT在植物磷脂合成和脅迫響應(yīng)中的關(guān)鍵作用，已陸續(xù)在擬南芥[2]、小麥[9]、玉米[10]等植物中被深入研究。Cruz-Ramírez等發(fā)現(xiàn)PEAMT1在擬南芥根系發(fā)育[11]和維持外胚層細(xì)胞完整性的磷脂代謝中十分重要。AtPEAMT1還可以通過影響活性氧-生長素信號(hào)傳導(dǎo)模塊調(diào)節(jié)細(xì)胞分化，維持根尖分生組織的正常生長[12]。而在對(duì)小麥PEAMT的研究中發(fā)現(xiàn)，低溫處理和鹽處理都會(huì)誘導(dǎo)PEAMT的表達(dá)，導(dǎo)致其蛋白質(zhì)表達(dá)量上調(diào)以及酶活性的提升[9]，這也為通過轉(zhuǎn)基因手段提高植物抗逆性提供了一條可行之策。

然而，目前的研究多集中于對(duì)單個(gè)植物PEAMT的分離鑒定及功能表征，缺乏對(duì)多種植物PAEMT的共性認(rèn)識(shí)。此外，有生化證據(jù)表明不同植物，尤其是豆科植物與其他植物間磷脂酰膽堿合成通路差異很大[13-14]，而不同植物PEAMT之間的功能差異尚不明確。

蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）是豆科生物學(xué)和基因組學(xué)研究的模式植物[15]，因此本研究通過對(duì)蒺藜苜蓿PEAMT的克隆，以及與其他植物PAEMT的對(duì)比分析，闡明不同植物PEAMT間的進(jìn)化關(guān)系，初步分析豆科植物與其他植物間功能分化的內(nèi)在原因，以期為挖掘優(yōu)質(zhì)基因和分子育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

植物材料為蒺藜苜蓿（Medicago truncatula cv. R108）。菌株為大腸桿菌DH5α感受態(tài)（南京鼎思生物技術(shù)有限公司）。載體為克隆載體pMD-19T[寶生物工程（大連）有限公司]。

本研究分析所用植物磷酸乙醇胺甲基轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列和氨基酸序列來源于美國國家生物信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蒺藜苜蓿的培養(yǎng)

挑選籽粒飽滿的蒺藜苜蓿種子，用6%NaClO溶液對(duì)種子消毒5 min，用去離子水漂洗5遍，隨后將其均勻分布在鋪有2層濾紙的培養(yǎng)皿上，添加去離子水使培養(yǎng)皿內(nèi)部保持濕潤，放入恒溫培養(yǎng)箱中，24 ℃、黑暗條件下萌發(fā)。3 d 后，挑選長勢(shì)一致的苜蓿幼苗，移入土中，采用盆栽土培，營養(yǎng)土、蛭石體積比為1 ∶1，光照—黑暗時(shí)間為12 h—12 h，溫度為光照24 ℃、黑暗20 ℃。

1.2.2 植物總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

待蒺藜苜蓿生長至1個(gè)月左右，取2～3張新鮮幼嫩葉片，采用RNA simple 總RNA提取試劑盒[DP419，天根生化科技（北京）有限公司]提取RNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的總RNA的完整性。隨后采用HiScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）合成cDNA第1鏈。

1.2.3 植物基因組DNA的提取

待蒺藜苜蓿生長至1個(gè)月左右，取2～3張新鮮幼嫩葉片，采用新型植物基因組提取試劑盒[DP320，天根生化科技（北京）有限公司]提取基因組DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳及微型分光光度計(jì)確定提取質(zhì)量。

1.2.4 蒺藜苜蓿PEAMT基因及其啟動(dòng)子的克隆

以擬南芥PEAMT1（At3g18000）序列為探針，在NCBI數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中搜索與之同源性最高的蒺藜苜?；蛐蛄?，將其命名為MtPEAMT。

根據(jù)蒺藜苜蓿PEAMT的預(yù)測(cè)序列，利用軟件Premier 5.0設(shè)計(jì)引物，引物序列見表1。以蒺藜苜蓿葉片cDNA為模板，擴(kuò)增基因的CDS區(qū)域。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 3 min;95 ℃ 15 s，56 ℃ 15 s，72 ℃ 2 min，32個(gè)循環(huán);72 ℃ 5 min。

截取蒺藜苜蓿PEAMT起始密碼子ATG上游 1 500～2 000 bp為目標(biāo)片段，利用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列見表1。以蒺藜苜?；蚪MDNA為模板，擴(kuò)增基因的啟動(dòng)子區(qū)域。反應(yīng)程序：94 ℃ 1 min;94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 32 min，30個(gè)循環(huán);72 ℃ 5 min。

將MtPEAMT基因及其啟動(dòng)子的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，與pMD-19T載體進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，對(duì)通過菌液PCR驗(yàn)證后的陽性單克隆菌種進(jìn)行測(cè)序。

1.2.5 植物PEAMT基因的對(duì)比分析

本研究對(duì)蒺藜苜蓿等14種植物PEAMT基因進(jìn)行對(duì)比分析。對(duì)植物PEAMT基因結(jié)構(gòu)分析通過GSDS網(wǎng)站（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）進(jìn)行;蛋白分子量及等電點(diǎn)等理化性質(zhì)預(yù)測(cè)使用BioXM? 2.7軟件進(jìn)行?？偲骄H水性，脂肪族指數(shù)及氨基酸分布預(yù)測(cè)通過ExPASy在線程序（https：//web.expasy.org/protparam/）進(jìn)行;亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)通過ProtComp 9.0在線程序（http：//linux1.softberry.com/）進(jìn)行;信號(hào)肽預(yù)測(cè)通過SignalP-5.0在線程序（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）進(jìn)行;跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)通過TMHMM工具（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）進(jìn)行;蛋白序列比對(duì)通過MEGA 10軟件和GENEDOC軟件進(jìn)行;蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)通過Pfam網(wǎng)站（http：//pfam.xfam.org/）進(jìn)行，并使用TBtools對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化分析;磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)使用NetPhos3.1網(wǎng)站（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）進(jìn)行;系統(tǒng)進(jìn)化樹使用MEGA10軟件的鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建，自展值（bootstrap）設(shè)定為1000。啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測(cè)使用PlantCARE程序（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）進(jìn)行，經(jīng)過篩選與整理后，使用TBtools對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化分析;使用Excel 2019、Powerpoint 2019、Adobe Illustrator 2020作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒺藜苜蓿PEAMT及其啟動(dòng)子的克隆

以蒺藜苜蓿葉片cDNA為模板，通過PCR反應(yīng)，特異性擴(kuò)增出推定的PEAMT（圖1）。蒺藜苜蓿PEAMT（Medtr6g069600）的CDS長度為1 491 bp，推測(cè)編碼497個(gè)氨基酸，蛋白分子量為56.99 ku，等電點(diǎn)為6.05，總平均親水性小于0，為親水性蛋白。

以蒺藜苜?；蚪MDNA為模板，通過PCR反應(yīng)，特異性擴(kuò)增出推定的PEAMT啟動(dòng)子區(qū)域（圖1）。蒺藜苜蓿PEAMT的啟動(dòng)子長度為1 558 bp。

2.2 不同植物PEAMT基因的初步鑒定

以擬南芥PEAMT的氨基酸序列為探針，利用BLAST功能，在NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行目的基因搜索，共得到28個(gè)注釋為磷酸乙醇胺甲基轉(zhuǎn)移酶的植物PEAMT基因。再次通過其蛋白序列，搜索NCBI基因組數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)有部分PEAMT的基因組數(shù)據(jù)缺失。為保證數(shù)據(jù)分析的完整性與一致性，本研究選取基因組序列和蛋白序列均完整存在的13種植物PEAMT（表2）及蒺藜苜蓿PEAMT進(jìn)行序列比較分析。

2.3 蒺藜苜蓿與其他植物PEAMT基因結(jié)構(gòu)的比較分析

由圖2可知，蒺藜苜蓿PEAMT的CDS長度為1 491 bp，基因組長度為7 864 bp。通過GSDS網(wǎng)站在線分析基因結(jié)構(gòu)，蒺藜苜蓿PEAMT具有12個(gè)外顯子和11個(gè)內(nèi)含子。另外13種植物PEAMT的CDS長度為1 425～1 503 bp，基因組長度為4 179～9 518 bp。不同植物PEAMT基因結(jié)構(gòu)十分相似，除大豆PEAMT含有11個(gè)外顯子和10個(gè)內(nèi)含子以外，其他13種植物PEAMT基因均含有12個(gè)外顯子和11個(gè)內(nèi)含子。不同植物之間內(nèi)含子的長度差異較大，導(dǎo)致了基因全長的差異。

2.4 蒺藜苜蓿與其他植物PEAMT基本性質(zhì)比較分析

由表3可知，蒺藜苜蓿與其他13種植物PAEMT在蛋白質(zhì)長度、分子量、等電點(diǎn)等蛋白質(zhì)的基本性質(zhì)方面表現(xiàn)出高度的一致性。植物PEAMT的蛋白長度范圍為475～501個(gè)氨基酸，分子量范圍為53.86～57.09 ku。14種植物PEAMT的等電點(diǎn)均小于7，總平均親水性均小于0，表現(xiàn)為親水性蛋白，脂肪族指數(shù)范圍為76.62～83.24。預(yù)測(cè)的亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，14種植物PEAMT均定位于細(xì)胞質(zhì)，無信號(hào)肽，而跨膜預(yù)測(cè)結(jié)果也表明14種植物PEAMT均無跨膜結(jié)構(gòu)域的存在。氨基酸序列對(duì)比結(jié)果（表4）表明，PEAMT序列之間的相似性很高，為76.26%～95.95%，其中蒺藜苜蓿PEAMT與木豆PEAMT的相似度最高，為90.34%。

2.5 蒺藜苜蓿與其他植物PEAMT的結(jié)構(gòu)域比對(duì)分析

通過Pfam數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)結(jié)果（圖3）得知，蒺藜苜蓿PEAMT在蛋白的N端和C端各包含1個(gè)典型的甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域，14種植物PEAMT其N端的甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域的大小和位置均高度一致，而C端的甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域的大小差異明顯。其中蒺藜苜蓿的C端結(jié)構(gòu)域最大，與木豆的C端結(jié)構(gòu)域較為相似。

進(jìn)一步選取PEAMT結(jié)構(gòu)域區(qū)域序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果（圖4）表明，2個(gè)甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域序列在14種植物之間具有一定的保守性，2個(gè)結(jié)構(gòu)域的N端保守性均高于C端。每個(gè)結(jié)構(gòu)域均含有Ⅰ、p-Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 4個(gè)基序。且14種植物PEAMT基序I中的排列符合（LIV）-（VL）-（ED）-xG-（APC）-GxG[16]的排列方式。通過序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，同樣符合要求。同時(shí)，在對(duì)線蟲、瘧原蟲PEAMT結(jié)構(gòu)研究中發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)催化殘基和磷酸化位點(diǎn)[17]，它們?cè)谥参颬AEMT中依舊存在并且序列沒有發(fā)生變化。

2.6 蒺藜苜蓿與其他植物PEAMT進(jìn)化分析

為探究不同植物PEAMT的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，本研究利用MEGA 10軟件的Neighbor-joining（鄰接）法初步構(gòu)建了植物PEAMT的系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果見圖5，14種植物PEAMT嚴(yán)格按照生物種屬進(jìn)行聚類。單子葉植物分支由禾本科的水稻、高粱和玉米PEAMT組成。雙子葉植物分支由豆科植物PEAMT、葫蘆科植物PEAMT、藜科植物PEAMT、茄科植物PEAMT、胡麻科植物PEAMT、十字花科植物PEAMT和錦葵科植物PEAMT組成。其中蒺藜苜蓿PEAMT與木豆PEAMT的親緣關(guān)系最為接近。

2.7 蒺藜苜蓿與其他植物PEAMT的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)分析

本研究通過NetPhos對(duì)PEAMT的磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，結(jié)果見圖6、表5。預(yù)測(cè)的磷酸化位點(diǎn)均勻分布于蛋白全長，14種PEAMT均含有大量的蛋白激酶C和EGFR激酶的磷酸化位點(diǎn)，蒺藜苜蓿PEAMT最易受蛋白激酶C磷酸化。此外，大部分PEAMT還易受蛋白激酶A、蛋白激酶G、CKⅠ、CKⅡ、cdc2等激酶磷酸化。

2.8 不同植物PEAMT的啟動(dòng)子分析

通過PlantCare對(duì)PEAMT基因啟動(dòng)子區(qū)域可能存在的順式作用元件進(jìn)行預(yù)測(cè)，數(shù)據(jù)經(jīng)分類整理后使用TBtools進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化處理。由圖7可知，蒺藜苜蓿PEAMT的啟動(dòng)子區(qū)域存在光響應(yīng)元件、干旱誘導(dǎo)元件、 脫落酸響應(yīng)元件和分生組織特異表達(dá)元件。其他植物PEAMT啟動(dòng)子均含有大量的光響應(yīng)元件，以及一些逆境響應(yīng)元件，如干旱誘導(dǎo)元件、防御和應(yīng)激響應(yīng)元件、厭氧誘導(dǎo)原件和低溫響應(yīng)元件。此外還有很多例如脫落酸響應(yīng)元件、茉莉酸響應(yīng)元件和水楊酸響應(yīng)元件的植物激素響應(yīng)元件和一些組織特異性表達(dá)元件。

3 討論與結(jié)論

測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展，產(chǎn)生了大量生物序列信息，而大數(shù)據(jù)的到來給數(shù)據(jù)挖掘和管理提出了新的挑戰(zhàn)，為有效地使用這些數(shù)據(jù)，需要有效的方法來存儲(chǔ)和分析此類數(shù)據(jù)，這也為推動(dòng)生物信息學(xué)的發(fā)展創(chuàng)造了契機(jī)[18-20]。磷酸乙醇胺甲基轉(zhuǎn)移酶在植物的許多生物學(xué)功能中發(fā)揮重要作用，是磷脂酰膽堿合成途徑中的關(guān)鍵酶。前人研究表明，不同植物的磷脂酰膽堿合成通路存在很大差異，暗示不同物種的PEAMT可能存在特異性功能[13]。因此，本研究選擇豆科模式植物蒺藜苜蓿作為研究對(duì)象，成功從蒺藜苜蓿中克隆了PEAMT的CDS序列和啟動(dòng)子區(qū)域，并通過序列對(duì)比，系統(tǒng)地分析了蒺藜苜蓿PEAMT和其他13種植物PEAMT的核苷酸序列和氨基酸序列，為確定其功能差異的形成原因提供了理論基礎(chǔ)。

蒺藜苜蓿PEAMT和其他13種植物的PEAMT在生化性質(zhì)如蛋白質(zhì)長度、等電點(diǎn)、親水性等方面十分相似。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果表明，14種PEAMT均定位于細(xì)胞質(zhì)，而親水性、信號(hào)肽及跨膜預(yù)測(cè)結(jié)果也與之保持一致。目前已表征功能的PEAMT均定位于細(xì)胞質(zhì)[2]，這也從側(cè)面說明了預(yù)測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示，植物PEAMT嚴(yán)格按照其種屬分類關(guān)系進(jìn)行聚類，顯示了其在進(jìn)化過程中的保守性。本研究還發(fā)現(xiàn)，不同植物之間內(nèi)含子的長度差異較大，其中蒺藜苜蓿、木豆、藜麥和菠菜PEAMT的第2個(gè)內(nèi)含子明顯長于其他植物PEAMT的第2個(gè)內(nèi)含子，這可能是造成不同物種PEAMT功能差異的原因之一。

迄今為止，已經(jīng)在26種生物中鑒定出30多種PEAMT。根據(jù)其結(jié)構(gòu)域的分布，可將已發(fā)現(xiàn)的磷酸乙醇胺甲基轉(zhuǎn)移酶分為三大類。第1類是植物特有的甲基轉(zhuǎn)移酶，包含2個(gè)SAM依賴性的甲基轉(zhuǎn)移酶催化結(jié)構(gòu)域MT1和MT2，其N端的MT1結(jié)構(gòu)域催化由磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)化為磷酸單甲基乙醇胺的初始甲基化反應(yīng);其C端的MT2結(jié)構(gòu)域則催化由磷酸單甲基乙醇胺經(jīng)磷酸二甲基乙醇胺轉(zhuǎn)化為磷酸膽堿的2步后續(xù)甲基化反應(yīng)[21]。第2類磷酸乙醇胺甲基轉(zhuǎn)移酶是在惡性瘧原蟲（Plasmodium falciparum）中發(fā)現(xiàn)的，其只具備MT2結(jié)構(gòu)域的特征，并且能催化連續(xù)3步甲基化反應(yīng)[22]。第3類磷酸乙醇胺甲基轉(zhuǎn)移酶是在線蟲（Caenorhabditis elegans）中發(fā)現(xiàn)的，它也有2個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域，但是只有其中1個(gè)甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域起作用，而另1個(gè)并不具有催化活性[23]。本研究的蛋白結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果表明，植物PEAMT在其N端和C端各有1個(gè)甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域，符合典型的植物PEAMT蛋白結(jié)構(gòu)域排布方式。此外，鑒于PEAMT甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域的串聯(lián)形式以及其相當(dāng)于典型小分子甲基轉(zhuǎn)移酶2倍大小的分子量，結(jié)合系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果，本研究推斷PEAMT可能是2個(gè)甲基轉(zhuǎn)移酶基因的融合產(chǎn)物，這種融合可能發(fā)生于被子植物分化之前。多序列比對(duì)結(jié)果表明，一些在線蟲或者瘧原蟲中發(fā)現(xiàn)的催化殘基和磷酸化位點(diǎn)，它們?cè)谥参颬EAMT中同樣存在，且序列未發(fā)生變化[17]，表明不同物種的磷酸乙醇胺甲基轉(zhuǎn)移酶在進(jìn)化過程中也具有高度的保守性。本研究還發(fā)現(xiàn)，不同PEAMT的C端序列保守性較差，推測(cè)在物種進(jìn)化過程中可能發(fā)生了某些突變，這也有可能是造成不同物種PEAMT功能差異的原因之一。

磷酸化作為一種常見的蛋白翻譯后修飾方式，其位點(diǎn)活性與狀態(tài)對(duì)植物生長發(fā)育和信號(hào)傳導(dǎo)十分重要[24]。通過NetPhos預(yù)測(cè)磷酸化位點(diǎn)可知，植物PEAMT易被蛋白激酶C、蛋白激酶A和酪氨酸激酶Ⅱ等磷酸化。前人研究表明，蛋白激酶C，蛋白激酶A，酪蛋白激酶Ⅱ等激酶在生物磷脂代謝過程中扮演著十分重要的角色。例如Opi1是酵母脂質(zhì)合成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的一個(gè)關(guān)鍵阻遏物，酪蛋白激酶Ⅱ和蛋白激酶A的磷酸化會(huì)激活其阻遏功能，而蛋白激酶C的磷酸化則會(huì)抑制阻遏功能。而在磷脂酸介導(dǎo)的脂質(zhì)代謝過程中十分重要的磷脂酸水解酶也會(huì)被酪氨酸激酶Ⅱ和蛋白激酶C磷酸化[25]。磷脂酸作為脂質(zhì)合成的重要前體物質(zhì)[26]，其水解酶與PEAMT在受到同種激酶磷酸化時(shí)是否存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，以及是否會(huì)對(duì)生物的脂質(zhì)代謝造成影響值得進(jìn)一步探究。此外，某些蛋白會(huì)通過磷酸化和去磷酸化來調(diào)節(jié)其位置和活性狀態(tài)[25]，因此蛋白激酶C和蛋白激酶A等對(duì)PEAMT磷酸化作用的差異性也值得深思。

啟動(dòng)子是重要的基因表達(dá)調(diào)控區(qū)域，不同環(huán)境下，植物會(huì)通過自身的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制，誘導(dǎo)特定基因的表達(dá)，而這種誘導(dǎo)表達(dá)與基因上游啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件以及相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子之間存在密不可分的關(guān)系。本研究在對(duì)植物PEAMT基因啟動(dòng)子區(qū)域順式作用元件的預(yù)測(cè)中發(fā)現(xiàn)，它們的啟動(dòng)子區(qū)域除了大量的光響應(yīng)元件以外，還分布著一些逆境響應(yīng)元件和脫落酸響應(yīng)元件等一系列植物激素響應(yīng)元件。脫落酸介導(dǎo)植物對(duì)很多非生物脅迫的響應(yīng)，如鹽脅迫和干旱脅迫，而脫落酸響應(yīng)元件是其信號(hào)傳導(dǎo)通路中的關(guān)鍵一環(huán)[27-28]。馬賽箭在對(duì)鹽角草PEAMT啟動(dòng)子的分析過程中同樣發(fā)現(xiàn)其啟動(dòng)子區(qū)域包含諸如低溫響應(yīng)元件，熱脅迫響應(yīng)元件一類的逆境響應(yīng)元件和諸如脫落酸響應(yīng)元件、生長素響應(yīng)元件的植物激素響應(yīng)元件[29]。目前已有部分報(bào)道證實(shí)了PEAMT是植物抗性相關(guān)基因。謝瑾卉在對(duì)遼寧堿蓬的研究中發(fā)現(xiàn)，PEAMT啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下GUS的表達(dá)會(huì)受鹽、冷、干旱和ABA等脅迫的誘導(dǎo)[30]，而在對(duì)玉米PEAMT啟動(dòng)子的研究中也得出相似的結(jié)果[31]。Nuccio等發(fā)現(xiàn)鹽處理會(huì)誘導(dǎo)菠菜PEAMT的大量表達(dá)，繼而提高Cho的產(chǎn)量以促進(jìn)甜菜堿的積累[32]。這些發(fā)現(xiàn)也與本研究中的對(duì)比分析結(jié)果一致，暗示植物PEAMT除了調(diào)控磷脂酰膽堿的生物合成外，可能還具有響應(yīng)非生物脅迫的能力。

綜上所述，本研究通過對(duì)蒺藜苜蓿等14種植物PEAMT的對(duì)比分析，初步確定了蒺藜苜蓿PEAMT具有響應(yīng)非生物脅迫的特性，推測(cè)了造成不同植物PEAMT功能差異的可能原因，但是對(duì)于解釋不同植物PEAMT之間功能差異的形成原因仍然需要進(jìn)一步試驗(yàn)證據(jù)的支撐。植物體內(nèi)的脂質(zhì)合成通路十分復(fù)雜，PEAMT是脂質(zhì)合成通路種的關(guān)鍵限速酶，但除此以外，還需要多種酶的共同參與，如磷脂甲基轉(zhuǎn)移酶和磷酸胞苷酰轉(zhuǎn)移酶[33]，而它們與PEAMT的上下游關(guān)系及對(duì)底物的競(jìng)爭(zhēng)勢(shì)必會(huì)對(duì)自身活性及脂質(zhì)代謝造成影響。此外，基因差異功能的形成與其表達(dá)模式也存在密切關(guān)系。因此，探究PEAMT與其他基因之間的互作關(guān)系以及確定其時(shí)空表達(dá)特性將有助于更好了解PEAMT的功能。

蒺藜苜蓿PEAMT的cDNA全長1 491 bp，編碼蛋白分子量56.99 ku，理論等電點(diǎn)為6.05，為親水性蛋白。植物PEAMT在進(jìn)化過程中十分保守，都具有響應(yīng)植物逆境脅迫的特性。

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