總膽紅素冰凍人血清國家標(biāo)準(zhǔn)品的研制

于 婷， 沈 敏， 曲守方， 孫 楠， 孫 晶， 黃 杰

（1. 中國食品藥品檢定研究院體外診斷試劑所非傳染病診斷試劑室，北京 100050；2. 美康生物參考實驗室，浙江 寧波 315104）

膽紅素是人體膽汁中的主要色素，由鐵卟啉化合物代謝而來，80%由體內(nèi)被破壞的衰老紅細胞釋放出的血紅蛋白衍化生成。包括直接膽紅素、間接膽紅素、δ-膽紅素。血清總膽紅素是新生兒高膽紅素血癥和肝膽疾病的重要指標(biāo)[1-2]。膽紅素因其獨特的分子特性，極易與自由基相結(jié)合，因此具有很強的抗氧化性，近年來的許多研究結(jié)果均表明其與2型糖尿病微血管并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[3-4]。還有研究結(jié)果顯示，冠狀動脈粥樣硬化與總膽紅素的降低有明顯聯(lián)系[5-6]。因此，準(zhǔn)確測定血清總膽紅素濃度對于疾病的診斷具有重要意義。由于膽紅素很不穩(wěn)定，容易見光分解，研制和保存都存在一定難度。目前，還沒有以人血清為基質(zhì)的總膽紅素國際標(biāo)準(zhǔn)品，我國僅北京航天總醫(yī)院在2012年曾研制過1批，但數(shù)量較少，不能滿足市場需求。為解決人血清基質(zhì)的總膽紅素標(biāo)準(zhǔn)品匱乏的現(xiàn)狀，保證總膽紅素量值溯源穩(wěn)定可靠，本實驗室開展了總膽紅素冰凍人血清國家標(biāo)準(zhǔn)品的研制。

1 材料和方法

1.1 主要儀器和試劑

1.1.1 儀器 2XZ-1旋片式真空泵（臨海譚氏真空設(shè)備公司）。78-1磁力攪拌器（常州國華公司）。XS205DU電子天平、S40 SevenMulti綜合測試儀（瑞士梅特勒-托利多公司）。Cary 100 UV-vis分光光度計（美國安捷倫公司）。U-3900H紫外分光光度計、7180全自動生化分析儀（日本日立公司）。

1.1.2 試劑盒 （1）均勻性評價用試劑盒：總膽紅素檢測試劑盒（化學(xué)氧化法，批號171215102，寧波美康生物科技股份有限公司）；（2）穩(wěn)定性評價用試劑盒：總膽紅素檢測試劑盒（化學(xué)氧化法，批號180702101和180608101，寧波美康生物科技股份有限公司）；（3）互通性評價用試劑盒：總膽紅素檢測試劑盒（化學(xué)氧化法，批號180702101，寧波美康生物科技股份有限公司）；（4）總膽紅素測定試劑盒（釩酸鹽氧化法；批號18-0730，北京九強生物技術(shù)股份有限公司；批號20180612，上?？迫A生物工程股份有限公司；批號18061201，北京利德曼生化股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 侯選品的制備 收集外觀澄清，無溶血、黃疸和脂血的血清，且人類免疫缺陷病毒抗體、乙型肝炎病毒表面抗原、丙型肝炎病毒抗體和梅毒螺旋體抗體均為陰性；以20 μmol/L為界，合并成2個不同水平的大樣（候選品Ⅰ、Ⅱ），混勻后依次進行初濾、0.45 μm濾膜過濾、0.22 μm濾膜過濾。將過濾好的血清分裝入1.5 mL棕色冷凍玻璃瓶，0.5 mL/瓶，并于-70 ℃保存。

1.2.2 均勻性評價 按照文獻[7-8]進行評價，方法為單因素方差分析法。在候選品分裝的前、中、后階段各抽取15、20和15支，采用7180全自動生化分析儀對抽樣進行測定，每支候選品均測定3次。

1.2.3 短期穩(wěn)定性評價 按照文獻[8-9] 進行評價，分別在第1、2、3、5、7、12、20、30 d 8個時間點從候選品Ⅰ、Ⅱ中各隨機抽取6支，置于20～25 ℃、2～8 ℃、-20 ℃條件下各2支。8個時間點的取樣時間保持一致。采用7180全自動生化分析儀對抽樣進行測定，每支候選品測定3次，取平均值，中間穿插測定2個水平質(zhì)控品。以時間為橫坐標(biāo)，測定值為縱坐標(biāo)作圖，使用Excel 2010軟件進行線性擬合回歸分析，評價候選品測定值的趨勢性變化，并計算斜率（k）、截距（b）和斜率的標(biāo)準(zhǔn)差（sk），計算公式為：

在自由度為n－2，置信水平p=0.95（95%的顯著水平）條件下，查t-分布臨界值表，得到對應(yīng)的t（0.95，n－2）值。計算t（0.95，n－2）·sk的值，比較|k|與t（0.95，n－2）·sk的關(guān)系，如果|k|

1.2.4 聯(lián)合定值 選擇近3年參加總膽紅素項目的參考實驗室外部質(zhì)量評價計劃比對或國內(nèi)參考實驗室室間比對，結(jié)果達到國際或國內(nèi)參考實驗室及格標(biāo)準(zhǔn)的實驗室進行聯(lián)合定值，且參加實驗室數(shù)量不少于3家。定值方法均采用檢驗醫(yī)學(xué)溯源性聯(lián)合委員會推薦的總膽紅素參考測量方法（Doumas法）[10]。實驗前采用正確度物質(zhì)或國際臨床化學(xué)與檢驗醫(yī)學(xué)聯(lián)合委員會-參考實驗室外部質(zhì)量評價計劃樣本驗證本實驗室建立的參考測量程序，同時測定質(zhì)控物質(zhì)。實驗分3批（次），每批（次）依次測定有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、質(zhì)控物質(zhì)、2個水平候選品，每個樣本至少測定5次，3批（次）每個樣本共收集15個數(shù)據(jù)。按照以下標(biāo)準(zhǔn)判定數(shù)據(jù)是否有效：（1）樣本測定結(jié)果應(yīng)在范圍內(nèi)，且室內(nèi)變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）≤2.0%；（2）質(zhì)控物質(zhì)測定結(jié)果應(yīng)在（靶值±3.0%）范圍內(nèi)，且室內(nèi)CV≤2.0%。（1）中的和s是全部實驗室所有結(jié)果的和s。不滿足要求的數(shù)據(jù)為無效數(shù)據(jù)，直接剔除，取各實驗室2個水平候選品有效數(shù)據(jù)的，合并計算總，作為該樣本的最終靶值。由于本研究制備的2個水平候選品濃度較低，當(dāng)因反應(yīng)靈敏度不夠高導(dǎo)致檢測出現(xiàn)偏差時，采用低濃度樣本檢測方法[10]。

1.2.5 不確定度評估 以Guide to the Expression of Uncertainty in Measurement（GUM）為基礎(chǔ)，按照文獻[9]要求進行不確定度評估。不確定度來源包括定值、均勻性和穩(wěn)定性3部分，候選品的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度（uCRM）計算公式為：

式中uchar為定值引起的標(biāo)準(zhǔn)不確定度，ubb為均勻性引起的標(biāo)準(zhǔn)不確定度，us為穩(wěn)定性引起的標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

1.2.6 互通性評估 參照文獻[11]，采用參考方法和常規(guī)方法（美康公司試劑盒、九強公司試劑盒、科華公司試劑盒和利德曼公司試劑盒分別與7180全自動生化分析儀組成4個常規(guī)系統(tǒng)）同時對選定的一系列具有代表性的40份臨床樣本[7-8]和候選品進行分析。以參考方法測定臨床樣本的值為X軸，以常規(guī)方法測定臨床樣本的值為Y軸，采用Origin 8.0軟件繪制散點圖，并確定95%可信區(qū)間。如果常規(guī)方法測定候選品的在該區(qū)間內(nèi)，說明該候選品對常規(guī)方法無基質(zhì)效應(yīng)，表明其在參考方法和常規(guī)方法間具有互通性。

2 結(jié)果

2.1 均勻性評價結(jié)果

單因素方差分析結(jié)果顯示，候選品Ⅰ、Ⅱ的F值均

表1 總膽紅素侯選品均勻性評價結(jié)果

2.2 穩(wěn)定性評價結(jié)果

30 d穩(wěn)定性評價結(jié)果顯示，候選品Ⅰ在20～25 ℃和2～8 ℃下放置30 d均不穩(wěn)定，但在-20 ℃下可穩(wěn)定30 d；候選品Ⅱ在3種溫度條件下放置30 d均不穩(wěn)定；見表2。減少時間點數(shù)重新分析結(jié)果顯示，候選品Ⅰ在20～25 ℃條件下只在當(dāng)天穩(wěn)定，2～8 ℃條件下，可穩(wěn)定3 d（|k|=0.106 7，t（0.95，n-2）·sk=0.323 3）；候選品Ⅱ 20～25 ℃條件下只在當(dāng)天穩(wěn)定，2～8 ℃條件下可穩(wěn)定2 d（|k|=0.800 0，t（0.95，n-2）·sk=2.078 5），-20 ℃條件下可以穩(wěn)定5 d（|k|=0.072 3，t（0.95，n-2）·sk=0.154 4）。根據(jù)以上結(jié)果，又開展了候選品Ⅰ、Ⅱ 20～25 ℃條件下24 h穩(wěn)定性研究，結(jié)果顯示，從-70 ℃取出后，在20～25 ℃條件下，候選品Ⅰ能穩(wěn)定6 h，候選品Ⅱ能穩(wěn)定4 h，見表3。

表2 總膽紅素候選品30 d穩(wěn)定性評價結(jié)果

表3 總膽紅素候選品20～24 ℃條件24 h穩(wěn)定性分析結(jié)果

2.3 聯(lián)合定值結(jié)果

有3家實驗室參加聯(lián)合定值，共得到獨立的4組數(shù)據(jù)?？偰懠t素候選品Ⅰ、Ⅱ定值結(jié)果的實驗室內(nèi)CV均<1.0%，表明各實驗室建立的參考方法重復(fù)性好、數(shù)據(jù)可靠。聯(lián)合定值結(jié)果見表4。

表4 總膽紅素候選品聯(lián)合定值結(jié)果 μmol/L

2.4 不確定度評估

2.4.1 定值引入的不確定度 定值引入的不確定度計算公式為：

式中s為所有實驗室測定值的總s，p為實驗室數(shù)。候選品Ⅰ、Ⅱ定值引入的不確定度分別為0.028 7、0.087 8 μmol/L。

2.4.2 均勻性引入的不確定度 根據(jù)表1中的方差分析結(jié)果，候選品Ⅰ均勻性引入的不確定度的計算公式為：

式中n為（有效）單元數(shù)，vwithin為組內(nèi)均方的自由度。候選品Ⅱ均勻性引入的不確定度的計算公式為：

候選品Ⅰ、Ⅱ均勻性引入的不確定度分別為0.053 2、0.082 2 μmol/L。

2.4.3 穩(wěn)定性引入的不確定度 穩(wěn)定性引入的不確定度計算公式為：

式中sk為穩(wěn)定性數(shù)據(jù)經(jīng)線性擬合得到的方程的斜率的s，X為候選品的有效期。候選品穩(wěn)定性引入的不確定度結(jié)果見表5。

表5 總膽紅素候選品穩(wěn)定性引入的不確定度

2.4.4 合成不確定度 根據(jù)候選品的定值、均勻性和穩(wěn)定性引入的不確定度計算出候選品Ⅰ、Ⅱ的合成不確定度分別為0.141 5、0.270 7 μmol/L。經(jīng)聯(lián)合定值和不確定度評估，候選品Ⅰ、Ⅱ定值結(jié)果分別為（7.01±0.28）μmol/L（k=2）、（27.10±0.54）μmol/L（k=2）。

2.5 互通性評估

采用參考方法和4個不同常規(guī)方法對40份新鮮血清樣本同時進行測定，利用臨床樣本測定結(jié)果得到線性回歸方程，通過參考方法測定值的計算候選品的95%可信區(qū)間。結(jié)果顯示，候選品常規(guī)方法測定值均可在該區(qū)間范圍內(nèi)，表明侯選品具有良好的互通性。見圖1。

圖1 總膽紅素候選品4種常規(guī)方法互通性評估

3 討論

臨床上血清總膽紅素的檢測方法主要有重氮法、化學(xué)氧化法/釩酸鹽氧化法、氧化酶法等。我國具有醫(yī)療器械注冊證的總膽紅素檢測試劑盒超過200個，各品牌試劑盒因溯源途徑、校準(zhǔn)品基質(zhì)、試劑組分來源等不盡相同，測定值之間存在一定差異。在這種情況下，通過各種方式促進總膽紅素檢測的標(biāo)準(zhǔn)化具有非常重要的意義。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是實現(xiàn)檢測結(jié)果準(zhǔn)確、具有可比性的重要工具，也是保證量值傳遞的計量實物標(biāo)準(zhǔn)，故本實驗室開展了總膽紅素國家標(biāo)準(zhǔn)品的研制。

眾所周知，不同基質(zhì)來源的同一濃度樣本，測定結(jié)果差異可能非常大，所以在制備標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的時候，應(yīng)盡量采用與實際應(yīng)用相同的基質(zhì)。本實驗室采用的是人源血清基質(zhì)，未添加任何抗菌藥物和防腐劑，因此候選品的互通性結(jié)果良好。均勻性、穩(wěn)定性和定值準(zhǔn)確是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的三大特征。本研究制備的標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)均勻性評估，顯示候選品均勻性良好。在穩(wěn)定性方面，因膽紅素具有易見光分解的特性，在研制初期，我們篩選出合格血清后，-70 ℃避光靜置1個月以上，待測定值穩(wěn)定后分裝，再進行后續(xù)研究。即便如此，本研究短期穩(wěn)定性評價結(jié)果也驗證了膽紅素的不穩(wěn)定性，尤其是20～25 ℃ 30 d的測定值呈現(xiàn)明顯下降趨勢；故本研究又開展了24 h的穩(wěn)定性分析，結(jié)果表明，在20～25 ℃條件下，候選品Ⅰ能穩(wěn)定6 h，候選品Ⅱ能穩(wěn)定4 h。而通常來說，無論是參考方法，還是常規(guī)方法，血清中總膽紅素的檢測均可在30 min或者更短時間內(nèi)完成，故該批候選品穩(wěn)定性依然是滿足要求的。但是，需告知臨床實驗室在使用前避光恢復(fù)至20～25 ℃，充分混合后，務(wù)必在4 h內(nèi)完成檢測。為了確保候選品的量值準(zhǔn)確，本實驗室縮短了候選品長期穩(wěn)定性的評估間隔，以便及時監(jiān)測到該候選品的穩(wěn)定性變化。該候選品的定值采用的是參考方法，各實驗室在定值前均要驗證所建立方法的準(zhǔn)確性，確?？偰懠t素檢測能力的穩(wěn)定，最終的定值結(jié)果令人滿意，且各實驗室內(nèi)部的CV均<1.0%，表明重復(fù)性較好，數(shù)據(jù)可靠。

綜上所述，本實驗室研制的總膽紅素候選品均勻性、互通性良好，定值結(jié)果準(zhǔn)確，穩(wěn)定性滿足要求，可以作為國家標(biāo)準(zhǔn)品使用。這批標(biāo)準(zhǔn)品將主要用于總膽紅素常規(guī)方法的校準(zhǔn)和正確度評價，以保障對總膽紅素體外診斷試劑的監(jiān)管。同時，也將促進臨床血清總膽紅素檢測結(jié)果的互認。