多重RT-PCR MassARRAY技術檢測27種呼吸道病原體方法的建立和臨床應用評價

劉宏錢， 宋朝暉， 梁巧米

（浙江大學醫(yī)學院附屬杭州市第一人民醫(yī)院，浙江 杭州 310006）

呼吸道感染是臨床較為常見的感染性疾病，尤其是在嬰幼兒、老年人和免疫缺陷患者中，常常導致其出現(xiàn)嚴重的臨床癥狀，甚至死亡。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的報道，2016年全球約有300萬例患者死于下呼吸道感染[1]。常見的呼吸道感染病原體包括病毒、細菌、支原體、衣原體等。病毒性病原體主要有甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、偏肺病毒、腺病毒等。細菌性病原體有肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌等。大多數(shù)呼吸道感染具有相似的臨床癥狀，導致臨床醫(yī)生很難通過臨床癥狀鑒別病原體，而快速鑒定呼吸道感染的病原體對于臨床精準診斷以及用藥具有重要意義。過去幾年，分子檢測技術快速發(fā)展，在很大程度上彌補了傳統(tǒng)培養(yǎng)和免疫學檢測等方法對于呼吸道病原體檢測的缺陷，使呼吸道病原體的檢測速度更快，靈敏度和特異性也得到了很大的提高。尤其是多重聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）病原體檢測方法的建立及其在臨床上的應用，使同時檢測多種不同的病原體成為可能。多重PCR檢測具有比較高的靈敏度和特異性，但受限于每個反應中熒光類型的數(shù)量，一般1個反應孔只能檢測3～4種病原體，如果需要檢測更多的病原體，則需要更多的反應孔，從而使檢測的便利性和檢測通量大大降低?；谝合嘈酒夹g的NxTAG Respiratory Viral Panel可以同時檢測20種病原體，包括18種病毒及其亞型、肺炎支原體和肺炎衣原體，但該試劑盒成本較高，并未廣泛應用于臨床。

核酸質(zhì)譜檢測整合了PCR技術的高靈敏度和質(zhì)譜技術的高通量，1個反應體系最高可實現(xiàn)40重基因擴增，可應用于基因的單核苷酸多態(tài)性分析、基因突變檢測、DNA甲基化分析和基因拷貝數(shù)鑒定等研究[2]。目前，在臨床領域的應用主要有耳聾基因檢測、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）突變檢測、液體活檢和高血壓易感基因檢測等。本研究擬應用核酸質(zhì)譜技術同時檢測導致呼吸道感染的27種常見病原體，探討該方法在呼吸道感染病原體診斷中的應用價值。

1 材料和方法

1.1 樣本來源

收集2019年9月—2020年3月杭州市第一人民醫(yī)院疑似呼吸道感染患者鼻咽拭子樣本207份?；颊咧心?12例、女95例，年齡1～76歲。

1.2 儀器與試劑

2720 PCR儀（美國ABI公司），LightCycler 480Ⅱ?qū)崟r熒光定量PCR系統(tǒng)（瑞士羅氏公司），MassARRAY分析系統(tǒng)、Iplex Pro樣本鑒定試劑盒、Spectro Chip（美國Agena公司），PrimeScript Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄酶、TaKaRa Taq Hot Start Version（日本Takara公司），DNA/RNA抽提試劑盒（杭州倍沃醫(yī)療科技有限公司），呼吸道病原體檢測試劑盒（上海之江生物科技股份有限公司）。

1.3 DNA和RNA的提取

采用DNA/RNA核酸提取試劑盒提取樣本DNA和RNA，嚴格按照試劑盒說明書要求進行操作。

1.4 擴增引物和延伸引物設計

選取病原體基因保守區(qū)域，通過MassARRAY Design軟件設計擴增引物和延伸引物，引物序列見表1。引物由上海百力格生物技術有限公司合成。

表1 27種病原體對應引物序列

1.5 呼吸道病原體質(zhì)粒的構(gòu)建

選取病原體保守區(qū)域基因片段（100～300 bp），連接到pUC57質(zhì)粒載體上，病原體質(zhì)粒由通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司合成。

1.6 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）及MassARRAY核酸質(zhì)譜檢測

1.6.1 RT-PCR PCR反應體系為40 μL，反應條件：50 ℃ 25 min；95 ℃ 5 min；94 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，68 ℃ 20 s，45個循環(huán)；72 ℃3 min；4 ℃永久保溫。

1.6.2 去磷酸化反應 取5 μL RT-PCR產(chǎn)物，加入蝦堿性磷酸酶反應液2 μL，45 ℃ 25 min，80 ℃2 min，以去除反應體系中的脫氧核糖核苷三磷酸。

1.6.3 單堿基延伸反應 加2 μL單堿基延伸反應液于去磷酸化反應產(chǎn)物中，然后進行單堿基延伸反應：94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s，52 ℃5 s、80 ℃ 5 s（5個循環(huán)），30個循環(huán)；72 ℃3 min。單堿基延伸反應液中以雙脫氧核糖核苷酸代替脫氧核糖核苷三磷酸，僅在特異性延伸引物后面延伸1個堿基即終止反應。

1.6.4 前處理 在9 μL單堿基延伸反應產(chǎn)物中加入16 μL去離子水和6 mg樹脂，進行脫鹽和檢測前處理。

1.6.5 核酸質(zhì)譜點芯片和質(zhì)譜檢測 基于各病原體延伸產(chǎn)物相對分子質(zhì)量的差異判讀質(zhì)譜檢測結(jié)果，在病原體特定產(chǎn)物分子質(zhì)量位置出現(xiàn)檢測峰，則判斷為該病原體陽性。

1.7 RT-PCR MassARRAY法呼吸道病原體檢測性能評估

利用27種病原體的標準質(zhì)粒對反應體系的靈敏度進行分析。將質(zhì)粒稀釋成1×104、1×103、1×102、1×101拷貝/μL 4個梯度，然后再進行檢測。檢測結(jié)果通過儀器進行自動判讀。陽性結(jié)果為延伸引物峰降低或消耗干凈。并在相應位置出現(xiàn)擴增1個堿基的延伸產(chǎn)物峰，各病原體延伸引物峰序列和相對分子質(zhì)量以及延伸產(chǎn)物序列和相對分子質(zhì)量見表2。對每個質(zhì)粒梯度均進行3次重復試驗，3次重復試驗結(jié)果均為陽性的最低稀釋濃度即為最低檢出限。將1×104拷貝/μL濃度的各病原體標準質(zhì)粒分別進行多重RT-PCR檢測，評估該檢測體系的特異性。若各病原體延伸產(chǎn)物峰出現(xiàn)在特定位置，且產(chǎn)物峰之間不交叉重疊，則認為檢測體系特異性良好。

表2 延伸引物、延伸產(chǎn)物序列和相對分子質(zhì)量

續(xù)表2

1.8 RT-PCR MassARRAY法檢測呼吸道病原體的臨床應用評價

提取207份鼻咽拭子樣本核酸，然后分別進行RT-PCR MassARRAY檢測和RT-PCR檢測、熒光定量檢測試劑主要為上海之江生物科技有限公司產(chǎn)品和本實驗室自行合成的檢測試劑，腸道病毒、博卡病毒、冠狀病毒、卡他莫拉菌、人鼻病毒、流感嗜血桿菌、H3N2季節(jié)性流感病毒檢測引物和探針由本實驗室委托上海百力格生物技術有限公司合成，引物和探針序列見表3。比較2種方法的陽性檢出情況和一致性。

表3 7種病原體引物及探針序列

1.9 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以例或率表示。對2種檢測方法進行一致性分析，以kappa>0.8為結(jié)果高度一致。

2 結(jié)果

2.1 呼吸道病原體檢測靈敏度和特異性

陰性對照和低于檢出限的病原體質(zhì)粒僅有延伸引物峰，無延伸產(chǎn)物峰；而濃度高于檢出限的質(zhì)粒延伸引物峰被消耗，可以看到特定的延伸產(chǎn)物峰。27種病原體質(zhì)粒檢出峰分析結(jié)果顯示，每種病原體僅出現(xiàn)單一的延伸產(chǎn)物峰，特異性良好。卡他莫拉菌、人鼻病毒、肺炎支原體、冠狀病毒、甲型流感病毒、人偏肺病毒、百日咳桿菌、流感嗜血桿菌、A群鏈球菌、肺炎鏈球菌、H1N1型甲型流感、副流感病毒3型、副流感病毒2型、腺病毒、H-3型甲型流感病毒、嗜肺軍團菌、H3N2季節(jié)性流感病毒的檢出限為1×102拷貝/μL，乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒的檢出限為1×103拷貝/μL，肺炎衣原體、H-5型甲型流感病毒、副流感病毒4型、B群鏈球菌、副流感病毒1型、腸道病毒、H-7型甲型流感病毒、博卡病毒的檢出限為1×101拷貝/μL。以肺炎支原體為例，檢測結(jié)果見圖1。

圖1 肺炎支原體靈敏度檢測質(zhì)譜圖

2.2 臨床樣本檢測結(jié)果

用建立的反應體系對207份鼻咽拭子樣本進行檢測，檢出陽性57份，陽性檢出率為27.54%。其中感染1種病原體的樣本33份，感染2種病原體的樣本19份，有5份樣本感染3～4種病原體。在所有病原體中，肺炎鏈球菌檢出率最高（9.66%），其次為卡他莫拉菌（5.80%），肺炎支原體和流感嗜血桿菌檢出率均為5.31%。有21份樣本病毒檢測陽性，2份樣本存在3種病毒混合感染。病毒檢出率居前3位的分別為副流感病毒（1～4型）（10份，4.83%）、人偏肺病毒（7份，3.38%）、甲型流感病毒（6份，2.90%）。雙重及多重感染中，與肺炎鏈球菌合并感染所占比例較高，其中肺炎鏈球菌合并卡他莫拉菌感染5例、肺炎鏈球菌合并流感嗜血桿菌感染4例。其他病原體檢出情況見表4。

表4 各病原體檢出情況 例（%）

續(xù)表4

2.3 RT-PCR MassARRAY法與RT-PCR檢測結(jié)果比較

僅有2份樣本2種檢測方法檢測結(jié)果不符，均為RT-PCR MassaARRAY法檢測陽性，而RTPCR檢測陰性，見表5。2種方法陽性符合率為100%，陰性符合率為98.68%，總符合率為99.03%。2種方法檢測結(jié)果具有高度的一致性（kappa=0.98）。

表5 RT-PCR MassARRAY法與RT-PCR檢出結(jié)果比較

3 討論

近年來，呼吸道感染在全球呈現(xiàn)高發(fā)態(tài)勢，是威脅人類健康的重大的感染性疾病，對體弱多病的老年人和免疫力低下的兒童危害尤為突出。有研究發(fā)現(xiàn)，某院12歲以下死亡病例中，有36.7%死于呼吸道感染引起的肺炎[9]。呼吸道感染病原體種類繁多，臨床癥狀相似，給臨床診斷和治療帶來了極大的困難。分離培養(yǎng)是病原體診斷的金標準，但其操作繁瑣、耗時長，陽性檢出率偏低；有些微生物（如支原體、衣原體和病毒）體外培養(yǎng)成功率偏低。血清免疫學檢查存在相應的窗口期，受機體抗體產(chǎn)生能力的影響，對病原體早期診斷意義不大。多重PCR技術操作簡單、快速，且靈敏度高，在臨床中逐漸被應用于呼吸道病原體檢測。受熒光通道限制，多重實時熒光PCR單孔只能檢測3～4種病原體，如果病原體種類偏多，勢必需要多孔檢測，使操作更加復雜，對核酸樣本的需求也相應增加，同時也使單次檢測的通量大大降低。多重PCR技術與質(zhì)譜相結(jié)合的MassARRAY技術可實現(xiàn)單管最高40重的基因檢測，同時借助其芯片技術，單次可進行96/384個樣本的檢測，檢測通量極高。

本研究同時對27種病原體進行檢測，檢測靈敏度為1×101～1×103拷貝/μL，其中僅有2種病原體（乙型流感病毒和呼吸道合胞病毒）檢測靈敏度為1×103拷貝/μL，對其他病原菌的檢測靈敏度≤1×102拷貝/μL。由此可見，本研究建立的RT-PCR MassARRAY方法具有較高的檢測靈敏度，207例鼻咽拭子樣本的陽性檢出率為27.54%。肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、肺炎支原體和卡他莫拉菌是社區(qū)獲得性肺炎和急性細菌感染的主要病原體。本研究中，這4種病原體的檢出率高于百日咳桿菌、嗜肺軍團菌等其他細菌。本研究還發(fā)現(xiàn)，在20例肺炎鏈球菌感染病例中，單重感染只有9例，僅占肺炎鏈球菌陽性病例的45%；在11例雙重和多重感染病例中，與卡他莫拉菌合并感染的有5例，和流感嗜血桿菌合并感染的有4例，從另一方面證明細菌之間的合并感染是比較常見的，且這3種細菌的耐藥情況也不一樣[10]。全面、詳盡的病原體診斷對指導抗菌藥物的合理使用意義重大。本研究207份樣本中有21份病毒檢測呈陽性（有2份存在3種病毒合并感染），病毒陽性檢出率為10.14%；副流感病毒（10份）、人偏肺病毒（7份）、甲型流感病毒（6份）是檢出率居前3位的病原體。有研究發(fā)現(xiàn)，我國病毒感染高發(fā)于秋冬季，春夏季病毒感染率相對較低[11]。本研究采集的樣本來自于4～7月的患者，這可能是導致病毒陽性率不高的原因之一。本研究中，有10份樣本檢出副流感病毒，1型、2型、3型、4型分別為2、3、2、3份，各亞型檢出數(shù)并無差異，與王春等[12]報道的上海地區(qū)副流感病毒1型、2型、3型、4型陽性檢出率分別為2.74%、0.62%、8.59%和3.40%有所不同，可能與王春等[12]的研究人群主要以兒童為主，而副流感病毒3型是導致嬰幼兒以及免疫功能低下人群下呼吸道感染的主要病因之一[13]有關。本研究中，人偏肺病毒陽性檢出率為3.38%，與鐘家禹等[14]2018年廣州地區(qū)人偏肺病毒陽性檢出率為3.53%的研究結(jié)果較為接近。本研究中，甲型流感病毒陽性檢出率為2.90%，且全部為H1N1型，另外還檢出呼吸道合胞病毒（2份）、腺病毒和冠狀病毒（各1份）。受限于樣本數(shù)量及樣本類型不夠豐富，博卡病毒、腸道病毒、乙型流感病毒、甲型流感病毒的一些亞型（H3、H3N2季節(jié)性、H5型和H7型）在本研究中并未檢出。

本研究建立的RT-PCR MassARRAY法可以對27種呼吸道病原體同時進行檢測，其靈敏度和特異性與熒光實時RT-PCR相仿，但相較于實時熒光定量PCR，其優(yōu)勢主要體現(xiàn)在核酸質(zhì)譜擴增的重數(shù)更高，本研究采用的是1個23重和1個4重2孔擴增的模式，4重的擴增孔可以隨著新病原體的發(fā)現(xiàn)進行相應擴增。MassARRAY采用的是96/384芯片，單次通量最多可進行384個樣本的檢測，通量較高?；谶@個特點，RT-PCR MassARRAY法非常適合臨床病原體早期篩查和地區(qū)性呼吸道病原體流行病學調(diào)查。