Xpert MTB/RIF技術(shù)在不同類型淋巴結(jié)結(jié)核中的診斷價(jià)值

張國(guó)英， 何 芳， 夏 廈， 郭一迪， 徐衛(wèi)平， 黃子慧

（南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 南京 210014）

淋巴結(jié)結(jié)核是因淋巴結(jié)被結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染所引起的一類肺外結(jié)核病[1]，在肺外結(jié)核中最為多見，占30%～40%[2-3]。臨床上按其病變部位分為頸部淋巴結(jié)結(jié)核、腋窩淋巴結(jié)結(jié)核和腹股溝淋巴結(jié)結(jié)核，其中最為多見的是頸部淋巴結(jié)結(jié)核，占淋巴結(jié)結(jié)核的80%～90%[4]；按病理學(xué)分型，淋巴結(jié)結(jié)核分為干酪樣型、增殖型和混合型[5]。日常診斷中，常因其受累部位較廣與其他淋巴系統(tǒng)疾病相混淆[6]，導(dǎo)致誤診或漏診，也給淋巴結(jié)結(jié)核的早期診斷帶來了一定困難。

Xpert MTB/RIF技術(shù)是由美國(guó)Cepheid公司研發(fā)的一項(xiàng)基于MTB核酸擴(kuò)增的全自動(dòng)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)，可同時(shí)快速檢測(cè)樣本中的MTB，及其是否對(duì)利福平耐藥，所需時(shí)間僅約2 h，且臨床樣本不需進(jìn)行核酸提取等預(yù)處理，生物安全性高。目前，該技術(shù)已被廣泛用于肺結(jié)核的診斷[7-8]，但在淋巴結(jié)結(jié)核這類肺外結(jié)核中的應(yīng)用較少，針對(duì)不同類型淋巴結(jié)結(jié)核的研究則更罕見。本研究應(yīng)用Xpert MTB/RIF技術(shù)對(duì)臨床已確診的不同類型淋巴結(jié)結(jié)核患者的樣本進(jìn)行檢測(cè)，并與抗酸染色和γ干擾素釋放試驗(yàn)（gammainterferon release assay，IGRA）等MTB常用實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行比較，以評(píng)價(jià)其在不同類型淋巴結(jié)結(jié)核中的診斷價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2017年1月—2018年12月南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院淋巴結(jié)結(jié)核患者235例（淋巴結(jié)結(jié)核組），其中男92例、女143例，年齡（44.6±17.6）歲，均經(jīng)細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)或?qū)κ中g(shù)切除的病理組織進(jìn)行病理學(xué)檢查后確診；按病變部位分為頸部淋巴結(jié)結(jié)核（172例）、腋窩淋巴結(jié)結(jié)核（51例）、腹股溝淋巴結(jié)結(jié)核（12例）；按病理學(xué)分型分為干酪樣型（36例）、增殖型（41例）、混合型（158例）。另選取南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院非結(jié)核性淋巴結(jié)病變患者81例（對(duì)照組），其中男29例、女52例，年齡（39.6±16.5）歲，包括結(jié)節(jié)病患者13例、非結(jié)核淋巴結(jié)炎患者37例、惡性淋巴瘤患者21例、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌患者10例，均經(jīng)相關(guān)檢查排除結(jié)核病。

1.2 儀器和試劑

Xpert MTB/RIF熒光定量PCR儀（美國(guó)Cepheid公司）及配套試劑。EVOLIS全自動(dòng)酶免疫分析儀（美國(guó)伯樂公司）。IGRA定量檢測(cè)試劑盒（北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)有限公司）。BSZGT116型全自動(dòng)染色儀及其配套試劑（珠海貝索生物技術(shù)有限公司）。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 樣本處理 （1）淋巴結(jié)組織樣本。取患者手術(shù)時(shí)切除的淋巴結(jié)組織2～3枚，每枚黃豆大小，加入2.0 mL磷酸鹽緩沖液，于無(wú)菌研缽中研磨后，獲得均質(zhì)混懸液，取0.7 mL混懸液置于無(wú)菌前處理管中，再加入1.4 mL樣本處理液。（2）膿液。取1.0 mL膿液加入2.0 mL樣本處理液，漩渦震蕩獲得混懸液。

1.3.2 抗酸染色鏡檢 取患者膿液或痰樣本中干酪樣、膿樣等可疑部分約0.05 mL，于載玻片上均勻涂抹成10 mm×20 mm的卵圓形薄膜，自然干燥，染色前加熱固定。亦可取5～10 μm厚、石蠟包埋的淋巴結(jié)組織切片進(jìn)行染色。染色時(shí)，按儀器操作指導(dǎo)書要求將預(yù)處理好的玻片放置于染色儀上進(jìn)行萋尼二氏染色，約10 min后染色完畢。以肉眼觀察到樣本區(qū)為亮藍(lán)色、無(wú)紅色斑塊染色為合格。鏡檢時(shí)，于100×油鏡下觀察，淡藍(lán)色背景下可見染成紅色的細(xì)長(zhǎng)或略帶彎曲的桿菌，有分枝生長(zhǎng)趨向，即為抗酸陽(yáng)性桿菌；其他細(xì)菌或細(xì)胞被染成藍(lán)色。

1.3.3 IGRA 采集患者清晨空腹靜脈血5.0 mL，肝素抗凝，充分混勻后，分裝于本底對(duì)照、陰性對(duì)照和測(cè)試管中，每管1.0 mL，37 ℃恒溫培養(yǎng)（2 2±2）h后，2 0 9 5×g離心10 min，取上清液進(jìn)行檢測(cè)。嚴(yán)格按照說明書要求進(jìn)行操作。

1.3.4 Xpert MTB/RIF檢測(cè) 在樣本處理管中分別加入0.7 mL處理后的淋巴結(jié)組織混懸液和1.4 mL樣本處理液或1.0 mL膿液+2.0 mL樣本處理液，旋緊蓋子，渦旋振蕩10 s，室溫孵育10 min，再渦旋振蕩10 s，室溫孵育5 min，用移液管吸取2.0 mL處理后的樣本，加入試劑盒中，再置于檢測(cè)模塊中進(jìn)行檢測(cè)，2 h后系統(tǒng)可自動(dòng)讀出檢測(cè)結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以率表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 淋巴結(jié)結(jié)核組和對(duì)照組Xpert MTB/RIF檢測(cè)的陽(yáng)性檢出率比較

235例淋巴結(jié)結(jié)核患者中，Xpert MTB/RIF檢出199例，陽(yáng)性檢出率為84.7%；對(duì)照組陽(yáng)性檢出率為0。2組陽(yáng)性檢出率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。

2.2 Xpert MTB/RIF、抗酸染色、IGRA檢測(cè)效能比較

235例淋巴結(jié)結(jié)核患者中，Xpert MTB/RIF檢出199例，敏感性為84.7%；IGRA檢出215例，敏感性為91.5%；抗酸染色僅檢出18例，敏感性為7.7%。Xpert MTB/RIF的敏感性高于抗酸染色（P<0.001），但低于IGRA（P<0.001）。81例非淋巴結(jié)結(jié)核患者中，Xpert MTB/RIF和抗酸染色均未檢出陽(yáng)性病例，特異性均為100%；IGRA檢出16例陽(yáng)性病例，特異性為80.2%，低于Xpert MTB/RIF和抗酸染色（P<0.001）。見表1。

表1 3種方法檢測(cè)淋巴結(jié)結(jié)核的敏感性、特異性和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值 %（例/例）

2.3 Xpert MTB/RIF在不同類型淋巴結(jié)結(jié)核患者中的陽(yáng)性檢出率比較

Xpert MTB/RIF在頸部淋巴結(jié)結(jié)核、腋窩淋巴結(jié)結(jié)核和腹股溝淋巴結(jié)結(jié)核患者中的陽(yáng)性檢出率分別為83.7%（144/172）、90.2%（46/51）和75.0%（9/12），但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。Xpert MTB/RIF在干酪樣型、增殖型和混合型淋巴結(jié)結(jié)核患者中的陽(yáng)性檢出率分別為91.7%（33/36）、78.0%（32/41）和84.8%（134/158），差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

3 討論

目前，淋巴結(jié)結(jié)核的實(shí)驗(yàn)室診斷方法主要有傳統(tǒng)的涂片抗酸染色、結(jié)核抗體檢測(cè)和分枝桿菌培養(yǎng)等。但因淋巴結(jié)結(jié)核的組織樣本和患者痰液中帶菌量少[9]，而膿液樣本不易獲取，導(dǎo)致抗酸染色陽(yáng)性率不高，限制了其在臨床上的應(yīng)用。本研究中，抗酸染色鏡檢的陽(yáng)性檢出率（敏感性）僅為7.7%。培養(yǎng)法雖是金標(biāo)準(zhǔn)，但也因所需時(shí)間長(zhǎng)，陽(yáng)性率低等原因，無(wú)法滿足臨床診療的需求。近年來，基于細(xì)胞免疫反應(yīng)的IGRA逐漸被推廣使用，該方法主要是將待檢患者的全血樣本和MTB特異性抗原EAST-6、CFP10在體外進(jìn)行共培養(yǎng)，患者樣本中結(jié)核抗原特異性T細(xì)胞被EAST-6和CFP10刺激后產(chǎn)生免疫應(yīng)答，分泌γ干擾素，通過測(cè)定γ干擾素的濃度來判斷患者體內(nèi)是否有針對(duì)MTB的T細(xì)胞免疫反應(yīng)，從而判斷患者是否感染[1]。IGRA的特異性和敏感性均較高[6，10]。本研究中，IGRA的敏感性和特異性分別為91.5%和80.2%，也證實(shí)了這一點(diǎn)。但其不足之處在于，IGRA需24 h才能出結(jié)果，且難以區(qū)分活動(dòng)性結(jié)核和潛伏性結(jié)核，并存在一定的假陽(yáng)性。

Xpert MTB/RIF采用半巢式熒光定量PCR技術(shù)，通過檢測(cè)MTB所特有的rpo B基因及其耐藥突變，來判斷樣本中是否含有MTB復(fù)合菌DNA，以及利福平耐藥基因是否突變，自2013年被世界衛(wèi)生組織推薦用于結(jié)核病的診斷以來，對(duì)其在結(jié)核病中的應(yīng)用價(jià)值，一直被學(xué)者們所關(guān)注。目前，國(guó)內(nèi)外相關(guān)報(bào)道主要集中在肺結(jié)核領(lǐng)域，多項(xiàng)研究均認(rèn)為其用于肺結(jié)核的快速診斷，有很好的檢測(cè)性能[11-12]，而對(duì)其在肺外結(jié)核病，尤其是淋巴結(jié)結(jié)核病中的作用的報(bào)道相對(duì)較少。TADESSE等[13]以培養(yǎng)或涂片結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)Xpert MTB/RIF在淋巴結(jié)結(jié)核病中的診斷敏感性為 87.8% ，特異性為91.1%。楊澄清等[14]發(fā)現(xiàn)，Xpert MTB/RIF檢測(cè)頸部淋巴結(jié)核病的敏感性為74.38%。周林等[6]發(fā)現(xiàn)Xpert MTB/RIF檢測(cè)淋巴結(jié)核病的敏感性為96.1%，特異性為100%。本研究中，Xpert MTB/RIF技術(shù)的檢測(cè)敏感性為84.7%，與TADESSE等[13]的報(bào)道一致，但稍高于楊澄清等的報(bào)道，略低于周林等[6]的報(bào)道，可能與采樣及所選病例不同有關(guān)。樣本中MTB的帶菌量較少，或納入患者前期經(jīng)過抗結(jié)核治療等，都有可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果。本研究中，Xpert MTB/RIF檢測(cè)的特異性為100%，與周林等[6]的研究結(jié)果一致，略高于TADESSE等[13]的研究結(jié)果，可能與研究時(shí)采用的金標(biāo)準(zhǔn)不同有關(guān)。

本研究中，與抗酸染色和IGRA相比，Xpert MTB/RIF的敏感性顯著高于抗酸染色（P<0.001），略低于IGRA（P<0.001），可能與該技術(shù)只需樣本中存在少量的 MTB DNA，且不需活菌或完整的菌體有關(guān)；特異性雖與抗酸染色一致，但比IGRA高（P<0.001），提示Xpert MTB/RIF檢測(cè)受患者自身的免疫狀況影響較小；Xpert MTB/RIF只需2 h即可出結(jié)果，且操作簡(jiǎn)單，對(duì)實(shí)驗(yàn)室生物防護(hù)要求不高，又不需要特殊的PCR實(shí)驗(yàn)室，便于開展?？梢?，Xpert MTB/RIF是一項(xiàng)比較適合臨床實(shí)驗(yàn)室開展的技術(shù)。

本研究對(duì)Xpert MTB/RIF在不同類型淋巴結(jié)結(jié)核中的診斷價(jià)值的研究結(jié)果顯示，干酪樣型陽(yáng)性檢出率為91.7%，稍高于增殖型和混合型，但3種類型差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；腋窩淋巴結(jié)結(jié)核的陽(yáng)性檢出率稍高，為90.2%，但與頸部淋巴結(jié)結(jié)核和腹股溝淋巴結(jié)結(jié)核相比，差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。淋巴結(jié)結(jié)核可發(fā)生于全身各處淋巴結(jié)，如腸系膜淋巴結(jié)結(jié)核，本研究中，因這類淋巴結(jié)結(jié)核的臨床病例較少，故分析時(shí)暫未納入，其具體差異還有待今后進(jìn)一步探討。

綜上所述，Xpert MTB/RIF技術(shù)對(duì)淋巴結(jié)結(jié)核的診斷具有較高的價(jià)值，敏感性高、特異性好，且操作簡(jiǎn)單、快速，不需單獨(dú)提取核酸，生物危害小，對(duì)臨床常見的不同類型淋巴結(jié)結(jié)核均有較好的診斷價(jià)值。隨著淋巴結(jié)結(jié)核發(fā)病率的不斷上升，臨床宜不斷推廣該技術(shù)的應(yīng)用，以進(jìn)一步提高早診率和確診率。