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    QuEChERS-UPLC-MS/MS測定果蔬中18 種琥珀酸脫氫酶抑制劑類殺菌劑

    2021-09-28 03:27:30彭青枝黃宗騫
    食品科學 2021年18期
    關鍵詞:酰胺殺菌劑果蔬

    龔 蕾,黃 徽,韓 智,江 豐,彭青枝*,黃宗騫,王 亨

    (湖北省食品質量安全監(jiān)督檢驗研究院,湖北省食品質量安全檢測工程技術研究中心,湖北 武漢 430070)

    琥珀酸脫氫酶抑制劑(succinate dehydrogenase inhibitors,SDHIs)是一類通過抑制病原菌琥珀酸脫氫酶活性,從而干擾其呼吸作用的新型殺菌劑[1],是近年發(fā)展很快且應用前景最廣的一類新型農藥[2],包括麥銹靈、氟酰胺、滅銹胺、甲呋酰胺、萎銹靈、氧化萎銹靈、啶酰菌胺、噻呋酰胺、呋吡菌胺、吡噻菌胺以及近2 a新研發(fā)的氟吡菌酰胺、聯(lián)苯吡菌胺、吡唑萘菌胺、氟唑環(huán)菌胺和氟唑菌苯胺等[3]。目前,該類殺菌劑主要應用于蔬菜、水果、糧食等經(jīng)濟作物的殺菌和防霉[4]。雖然該類殺菌劑毒性較低,但因其使用日益廣泛,SDHIs殺菌劑及代謝物殘留對農產(chǎn)品質量安全造成嚴重影響。美國、日本和韓國規(guī)定小麥中萎銹靈的最大殘留限量(maximum residue limit,MRL)值均為0.2 mg/kg,中國、國際食品法典委員會(codex alimentarius commission,CAC)和歐盟等均未制定萎銹靈在小麥中的MRL標準[5]。吡噻菌胺、氟唑菌酰胺、氟吡菌酰胺、啶酰菌胺和吡唑萘菌胺的MRLs已經(jīng)確定,蘋果MRL為10 mg/kg,草莓為10 mg/kg,番茄為3 mg/kg,菠菜為60 mg/kg[6-8]。歐盟規(guī)定啶酰菌胺、吡噻菌胺、吡唑萘菌胺、氟唑菌酰胺在西紅柿中的限量為3 mg/kg[9],我國規(guī)定啶酰菌胺在草莓和蘋果中的限量分別為3 mg/kg和2 mg/kg,新版GB 2763—2019《食品中農藥最大殘留限量》增加了吡唑萘菌胺、吡噻菌胺、氟唑環(huán)菌胺、氟唑菌酰胺和苯并烯氟菌唑在大麥、小麥、黃瓜、香蕉、結球甘藍、畜禽肉等食品中的臨時限量[10],其他SDHIs殺菌劑還沒有相應的MRL值。有關此類農藥檢測的標準方法較少,僅見GB 23200.8—2016《水果和蔬菜中500 種農藥及相關化學品殘留量的測定 氣相色譜-質譜法》[11]和GB/T 20769—2006《水果和蔬菜中405 種農藥及相關化學品殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質譜法》[12]中涉及了麥銹靈、氟酰胺、滅銹胺等幾種,其他SDHIs殺菌劑也沒有相應的國標檢驗方法。因此有必要開展快速分析SDHIs殺菌劑方法的研究,為該類殺菌劑的使用、監(jiān)管提供技術依據(jù)。

    目前,國內外報道的關于食品中部分SDHIs類殺菌劑的分析方法主要有免疫分析法[13-15]、氣相色譜(gas chromatography,GC)法[16-17]、氣相色譜-質譜(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)法[18-20]、液相色譜(liquid chromatography,LC)法[21]和液相色譜-串聯(lián)質譜(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)法[22-26]。LC-MS/MS法分離能力強,可同時定性定量測定多組分,研究者采用較多。Abad-Fuentes等[27]建立了LC-MS/MS法測定果蔬中吡唑萘菌胺等7 種SDHIs殺菌劑;孫亞米等[28]采用LC-MS/MS法快速測定果蔬中啶酰菌胺、呋吡菌胺、噻唑菌胺、氟吡菌酰胺、聯(lián)苯吡菌胺和吡噻菌胺等16 種新型酰胺類殺菌劑;楊歡等[29]利用LC-MS/MS法測定果蔬中8 種新型SDHIs殺菌劑;Han Lijun等[30]采用了GC-MS/MS和UHPLC-MS/MS分別測定鯰魚肌肉組織中219 種和128 種農藥,涵蓋部分SDHIs殺菌劑;還有研究者[31-32]采用超高效液相色譜-串聯(lián)質譜(ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)法檢測柑橘、土豆、大豆及水果加工產(chǎn)品等不同基質中上百種農藥或其代謝物的殘留,包括啶酰菌胺、氧化萎銹靈、滅銹胺、吡噻菌胺等,而有關異丙噻菌胺、氟唑菌酰胺、苯并烯氟菌唑等新一代SDHIs殺菌劑在果蔬中殘留的檢測方法至今鮮見報道。

    考慮到不同SDHIs殺菌劑限量范圍較寬以及樣品基質的復雜性,為滿足樣品實際測定需要,本研究采用經(jīng)濟、簡便、易操作的QuEChERS(quick, easy, cheap,effective, rugged and safe)前處理方法與UPLC-MS/MS技術結合,建立了能同時分析果蔬中18 種SDHIs殺菌劑的UPLCMS/MS方法。本方法快速、操作簡便、分析時間短、靈敏度高,可滿足果蔬中SDHIs殺菌劑的定量檢測需要。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    76 份果蔬樣品購自湖北武漢中百倉儲超市、沃爾瑪超市、武商超市3 家超市。

    標準品:麥銹靈、氟酰胺、滅銹胺、氟吡菌酰胺、甲呋酰胺、萎銹靈、氧化萎銹靈、聯(lián)苯吡菌胺、呋吡菌胺、吡唑萘菌胺、氟唑菌苯胺、吡噻菌胺、氟唑環(huán)菌胺、氟唑菌酰胺、苯并烯氟菌唑、異丙噻菌胺、啶酰菌胺、噻呋酰胺(均為液態(tài)標準物質,質量濃度均為100 μg/mL) 阿爾塔科技有限公司。

    乙腈(色譜純) 德國Merck公司;甲酸(色譜純)美國Thermo Fisher公司;醋酸鈉、無水硫酸鎂(均為分析純) 國藥集團化學試劑有限公司;N-丙基乙二胺(primary secondary amine,PSA)(40~60 μm)上海安譜科學儀器有限公司;超純水由Millipore系統(tǒng)制備。

    1.2 儀器與設備

    AB SCIEX Triple QuadTM4500液相色譜-質譜聯(lián)用儀美國AB SCIEX公司;ME204電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司;MS3 digital渦旋儀 德國IKA公司;Centrifuge 5810離心機 艾本德中國有限公司;0.22 μm有機相濾膜 天津津騰公司;Milli-Q超純水系統(tǒng)美國Millipore公司。

    1.3 方法

    1.3.1 UPLC條件

    色譜柱:ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μm);進樣量2 μL;柱溫35 ℃;流動相:A相為0.1%甲酸溶液,B相為乙腈,流速0.3 mL/min;梯度洗脫條件如表1所示。

    表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

    1.3.2 質譜條件

    離子源:電噴霧電離源(electrospray ionization,ESI);掃描方式:正負離子模式同時掃描;檢測方式:多反應監(jiān)測,ESI+電壓5 500 V,ESI-電壓-4 500 V;離子源溫度500 ℃;氣簾氣壓力35 psi;碰撞氣壓力9 psi;霧化器壓力50 psi;輔助氣壓力50 psi;入口電壓10.0 V;碰撞室出口電壓6 V。各殺菌劑的質譜條件見表2。

    表2 18 種SDHIs的定性離子、定量離子、去簇電壓和碰撞能量Table 2 Qualitative ions, quantitative ions, cone voltages and collision energies for eighteen compounds

    1.3.3 標準溶液配制

    分別準確移取質量濃度為100 μg/mL的麥銹靈、氟酰胺、滅銹胺、氟吡菌酰胺、甲呋酰胺、萎銹靈、氧化萎銹靈、聯(lián)苯吡菌胺、呋吡菌胺、吡唑萘菌胺、氟唑菌苯胺、吡噻菌胺、氟唑環(huán)菌胺、氟唑菌酰胺、苯并烯氟菌唑、異丙噻菌胺、啶酰菌胺、噻呋酰胺標準品各1.0 mL至10 mL容量瓶,用乙腈定容到10.00 mL,18 種SDHIs的標準品母液質量濃度均為10.0 μg/mL,于-18 ℃保存。

    標準品混合中間液:準確移取18 種SDHIs的標準品母液各1.0 mL于20 mL容量瓶,用乙腈定容到20.00 mL,各化合物質量濃度均為0.5 μg/mL,于4 ℃保存。

    標準曲線工作液:用乙腈稀釋混合中間液,配制系列標準曲線為0.5、5、20、50、100、200 ng/mL。

    1.3.4 樣品前處理

    取新鮮果蔬樣品,用粉碎機粉碎混勻,于-18 ℃冷凍保存。

    準確稱取10.00 g(準確至0.01 g)試樣于50 mL離心管中,加10.0 mL乙腈,振蕩混勻2 min,再加入5 g無水硫酸鎂和1 g醋酸鈉,混勻,4 000 r/min離心5 min。取3 mL上清液于15 mL離心管中,加入100 mg無水硫酸鎂、50 mg PSA,渦旋3 min后,于4 000 r/min離心3 min,過0.22 μm有機濾膜,供UPLC-MS/MS待測。

    1.3.5 實際樣品檢測

    采集湖北武漢中百倉儲超市、沃爾瑪超市、武商超市共3 家超市76 份蔬菜及水果,采用本研究建立的前處理方法和液相色譜-質譜法測定18 種農藥的殘留量。

    1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及圖表繪制

    本研究所有數(shù)據(jù)均在AB SCIEX公司的Analyst Software軟件下采集,采用MultiQuant3.0.2軟件進行定性定量分析,采用Origin 9.0進行圖像處理。

    2 結果與分析

    2.1 質譜條件與色譜條件的優(yōu)化

    為獲得18 種SDHIs最佳靈敏度和分離效果,對質量濃度為0.5 mg/L的18 種SDHIs單標溶液依次采取蠕動泵注射的方式進行一級質譜掃描。結果顯示:在正離子模式下,噻呋酰胺難以形成穩(wěn)定的[M+H]+峰,其他17 種殺菌劑在正離子模式下均有較好響應;在負離子模式下,噻呋酰胺能形成穩(wěn)定的[M-H]-峰。因此本實驗采取正負離子同時掃描,噻呋酰胺為負離子掃描,其他17 種SDHIs正離子掃描。為了得到響應值高,穩(wěn)定性好的子離子,優(yōu)化了質譜和液相色譜參數(shù),圖1為優(yōu)化后18 種殺菌劑的多反應監(jiān)測離子色譜圖。

    圖1 18 種化合物定量離子流圖Fig.1 Total ion current chromatograms for quantitative analysis of 18 compounds

    2.2 樣品前處理方法的優(yōu)化

    2.2.1 提取

    QuEChERS法是經(jīng)典的果蔬農藥殘留檢測方法,包含原始QuEChERS法、AOAC的QuEChERS法和歐盟的QuEChERS法。鹽析法也是農殘檢測中常用的前處理方法[33]。本實驗選擇毛白菜為實驗對象,通過加標回收,考察QuEChERS及鹽析法對SDHIs的提取效率。5 種前處理方法分別為:1)原始QuEChERS法,10 g樣品+10 mL乙腈+4 g無水MgSO4+1 g NaCl;2)歐盟的QuEChERS法,10 g樣品+10 mL乙腈+4 g無水MgSO4+1 g NaCl+1 g檸檬酸三鈉+0.5 g檸檬酸氫二鈉;3)AOAC的QuEChERS法(未酸化),10 g樣品+10 mL乙腈+4 g無水MgSO4+1 g醋酸鈉;4)AOAC的QuEChERS法,10 g樣品+10 mL乙腈+4 g無水MgSO4+1 g醋酸鈉+0.1%乙酸;5)NY/T 761—2008《蔬菜和水果中有機磷、有機氯、擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類農藥多殘留的測定》的提取方法,10 g樣品+10 mL乙腈+7 g NaCl。

    考察不同前處理對提取效果的影響,具體操作步驟如下:取均質的10 g毛白菜樣品(每個樣品3 個平行),加入100 μL質量濃度為1 μg/mL的混合標準溶液,靜置30 min后,用以上5 種方法進行提取,渦旋3 min,取上清液,過0.22 μm濾膜檢測,通過計算18 種化合物的回收率計算提取方式。

    表3顯示,采取方法3)整體提取效果較好,總體回收率好。方法1)中整體回收率較低,氧化萎銹靈回收率僅65.7%,方法5)中超過一半樣品的回收率高于100%,有明顯的基質增強效應,方法2)平均回收率不及方法3)和方法4),方法3)和方法4)的回收率差別不大,區(qū)別在于噻呋酰胺在酸化條件下回收率高于120%,綜合考慮,本實驗選擇方法3)提取,即稱取10 g樣品,加入10 mL乙腈,渦旋振蕩,加入4 g無水MgSO4和1 g醋酸鈉混勻。

    表3 不同提取方法的18 種化合物總體回收率Table 3 Effects of different extraction methods on recoveries of eighteen compounds

    2.2.2 凈化與基質效應

    QuEChERS法常用到凈化劑C18、N-丙基乙二胺(primary secondary amine,PSA)和石墨化碳黑(graphitized carbon black,GCB)。C18可用來除脂,PSA可用來消除各種果蔬的有機酸、色素及一些糖和脂肪酸,GCB可用來去除甾體、葉綠素等色素,但對含苯官能團的化合物有較強吸附作用。楊歡等[29]在研究8 種新型SDHIs殺菌劑快速測定中,對凈化試劑進行比較和優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)C18的加入對氟唑環(huán)菌胺、聯(lián)苯吡菌胺等化合物有吸附作用,本實驗參考其研究結果,使用PSA粉末進行凈化。并考察不同質量PSA(0、20、40、50、80、100、200、500 mg)與200 mg無水MgSO4的凈化效果,選取基質為毛白菜、芹菜、梨、橙4 種。

    分別用乙腈和空白基質溶液配制相同質量濃度的標準溶液,在相同色譜條件下測定,按照基質效應/%=B/A×100計算樣品基質溶液的基質效應,其中B為目標化合物在空白基質溶液中的響應值,A為目標化合物在乙腈中的響應值。通過基質效應強弱評價方法的凈化效果。結果表明,PSA的加入能有效達到凈化效果,并發(fā)現(xiàn)在取上清液3 mL的條件下,使用50 mg PSA即能有效降低基質增強效應,加大PSA量對凈化效果無顯著性影響,與楊歡等[29]的研究相同。

    2.2.3 線性范圍、檢出限及定量限

    在空白樣品中添加一系列質量濃度的目標化合物,在1.3.4節(jié)的前處理條件下進行檢測,以目標物質量濃度為橫坐標,質譜定量峰面積為縱坐標繪制標準曲線(表4),得出18 種農藥在0.5~200 ng/mL范圍內呈現(xiàn)出良好的線性關系,相關系數(shù)R均大于0.99,以信噪比RSN=3確定檢出限,以RSN=10確定定量限,18 種SDHIs檢出限為0.5~2.0 μg/kg,定量限為1.5~6.0 μg/kg,具體結果見表4。楊歡等[29]研究的8 種SDHIs殺菌劑檢出限為0.2~1.7 μg/kg,本方法檢出限與其水平相當,均滿足檢測需要。

    表4 18 種SDHIs的標準曲線、相關系數(shù)、檢出限和定量限Table 4 Linear ranges, related coefficient, LODs and LOQs for 18 compounds

    在毛白菜、芹菜、梨、橙4 種基質中分別添加標準溶液,按照1.3.4節(jié)進行樣品前處理,按高中低3 水平對空白樣品提取液進行添加,每個添加水平平行測定6 次,計算平均回收率和相對標準偏差(relative standard deviation,RSD),結果見表5。各種目標化合物在4 種基質中3 個添加水平(10、50 μg/kg和150 μg/kg)下的回收率為83.6%~109.4%,RSD為1.2%~8.4%。孫亞米等[28]利用LC-MS/MS建立的16 種SDHIs殺菌劑回收率為85.7%~103.9%;楊歡等[29]建立的8 種SDHIs殺菌劑回收率為71.4%~121.3%,本研究與其相比,均能滿足果蔬中農藥殘留檢測的回收率要求。

    表5 18 種SDHIs的加標回收率及RSDTable 5 Average spiked recoveries and precision of 18 compounds

    續(xù)表5

    2.3 實際樣品檢測結果

    采用優(yōu)化建立UPLC-MS/MS快速分析方法對市售沃柑、橙、梨、黃瓜、番茄、菠菜、辣椒、山藥、上海青、白菜、茄子、芹菜、豇豆、油麥菜等76 份樣品進行測試。結果顯示氟吡菌酰胺檢出樣品2 個,分別為西紅柿和黃瓜,檢出值分別為10.2、22.6 μg/kg;氟唑菌酰胺檢出樣品1 個,為黃瓜,檢出值為7.8 μg/kg;啶菌酰胺在芹菜、黃瓜、番茄、菠菜、上海青、茄子6 種蔬菜共12 個樣品中均有檢出,檢出值為7.4~1 966 μg/kg,其中在2 批次芹菜中檢出值分別高達1 017、1 966 μg/kg。噻呋酰胺檢出樣品1 個,為沃柑,檢出值為47.2 μg/kg。

    3 結 論

    本實驗建立了同時分析果蔬中18 種SDHIs殺菌劑殘留的UPLC-MS/MS檢測方法。該方法靈敏度高、重復性好,經(jīng)過系列方法學驗證,結果表明18 種目標化合物在0.5~200 μg/L范圍內線性關系良好,相關系數(shù)均大于0.99,方法檢出限為0.5~2.0 μg/kg,定量限為1.5~6.0 μg/kg。各種目標化合物在4 種基質中3 個添加水平(10、50 μg/kg和150 μg/kg)下的回收率為83.6%~109.4%,RSD為1.2%~8.4%(n=6)。實際樣品的檢測結果表明氟吡菌酰胺、氟唑菌酰胺、啶酰菌胺和噻呋酰胺均在黃瓜、西紅柿、芹菜、沃柑等果蔬中有殘留,啶菌酰胺殘留現(xiàn)象嚴重。該方法操作簡單、凈化效果好,適用于果蔬中SDHIs殺菌劑的快速檢測,不僅可以滿足當前國際上對果蔬中這18 種SDHIs殺菌劑MRL的檢測要求,也可推進果蔬中SDHIs殺菌劑殘留的食品安全風險評估,為政府監(jiān)管部門數(shù)據(jù)支撐具有重要的實際意義和社會效益。

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