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    基于高通量測序的窖泥原核微生物群落結(jié)構(gòu)及其理化因子相關(guān)性分析

    2021-09-28 03:27:14張明珠吳學(xué)鳳穆冬冬許博陽蔣俊樹閆曉明姜紹通李興江
    食品科學(xué) 2021年18期
    關(guān)鍵詞:池壁池底銨態(tài)氮

    張明珠,吳學(xué)鳳,穆冬冬,許博陽,孫 偉,蔣俊樹,閆曉明,鄭 志,姜紹通,李興江,*

    (1.合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230009;2.安徽文王釀酒股份有限公司,安徽 臨泉 236400;3.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院,安徽 合肥 230001;4.安徽省食品藥品檢驗研究院,安徽 合肥 230051)

    中國白酒是世界六大蒸餾酒之一,因為其獨(dú)特的發(fā)酵工藝和風(fēng)味而享譽(yù)全球[1-2]。我國白酒的釀造歷史悠久,以富含淀粉的糧谷類為主要原料,大曲、小曲或麩曲作為糖化發(fā)酵劑,采用固態(tài)(少數(shù)采用液態(tài)或半固態(tài))進(jìn)行發(fā)酵,經(jīng)蒸餾、貯存和勾調(diào)而成[3-4]。安徽地區(qū)流行喝高度白酒(乙醇體積分?jǐn)?shù)主要在42%~53%之間),口味以濃香型為主[5]。安徽地產(chǎn)白酒以古井、金種子、迎駕和文王為代表,均屬于濃香型白酒[6]。濃香型白酒的釀造過程是環(huán)境微生物、大曲微生物和窖泥微生物等復(fù)雜物質(zhì)能量代謝的過程[7],加入大曲的糧糟在窖池內(nèi)糖化,依賴于窖池中各種微生物群落的功能和作用完成釀造過程[8]。因此,窖泥中的微生物種類、數(shù)量繁多且復(fù)雜[9-10]。窖泥經(jīng)過長期、連續(xù)的生產(chǎn),不斷形成其獨(dú)特優(yōu)質(zhì)的微生物群落,這些微生物菌群代謝產(chǎn)生多種風(fēng)味物質(zhì),例如酯、酸和醇[11-12],并最終形成對酒質(zhì)的提高及穩(wěn)定至關(guān)重要的優(yōu)質(zhì)老窖泥[13],正所謂“千年老窖萬年糟,酒好全憑窖池老”[14]。

    近年來,隨著微生物組學(xué)和高通量測序技術(shù)的發(fā)展,使窖泥中蘊(yùn)含的厭氧微生物科學(xué)奧秘逐步得以剖析。研究發(fā)現(xiàn),這些微生物之間及與環(huán)境因子的相互作用,形成了復(fù)雜的窖泥微生物生態(tài)系統(tǒng)[15]。但具體窖泥中的理化因子與哪些菌群存在怎樣的相互作用關(guān)系,仍鮮有研究報道。目前對安徽產(chǎn)地濃香型白酒方面的研究,對古井貢酒的研究較多,而對其他品牌的濃香型白酒,如文王貢酒的研究較少。本研究通過對安徽文王白酒窖泥的理化特性與其微生物之間的相關(guān)性進(jìn)行研究分析,試圖揭示各種理化指標(biāo)對窖泥微生物群落組成的影響,以期為進(jìn)一步提高白酒風(fēng)味品質(zhì)提供方向。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    樣品取自文王酒廠2、20 a和30 a窖齡窖池窖泥[16]。采樣方法:池底泥采用五點取樣法,從窖池池底4 個角和中心點取樣混合,作為池底窖泥(2 a窖池:BPM_2;20 a窖池:BPM_20;30 a窖池:BPM_30)。池壁窖泥是從窖池的上中下層取樣混合,作為池壁泥樣品(2 a窖池:WPM_2;20 a窖池:WPM_20;30 a窖池:WPM_30),每個樣品取3 份,所取樣品每份約400 g。

    納氏試劑 上海源葉生物科技有限公司;酒石酸鈉鉀、氯化銨、氯化鈉、硫酸、高錳酸鉀、重鉻酸鉀、硫酸亞鐵銨、硫酸亞鐵(均為分析純) 中國醫(yī)藥集團(tuán)上?;瘜W(xué)試劑公司;鄰菲啰啉 天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    T6新世紀(jì)紫外-可見光分光光度計 北京普析通用儀器有限公司;VARIAN AA240原子吸收光譜儀美國瓦里安中國有限公司;MiSeqPE300 美國Illumina公司;DNeasy PowerSoil DNA分離試劑盒美國Qiagen公司。

    1.3 方法

    1.3.1 樣品前處理

    將采集樣品置于無菌袋中充分混勻后分成2 份,分別置于4 ℃冰箱(測定理化指標(biāo))和-80 ℃冰箱(窖泥DNA的提?。?。將新鮮的窖泥樣品平攤在瓷盤中,自然風(fēng)干,風(fēng)干后研磨成粉,通過60 目篩,保存在磨口瓶中。銨態(tài)氮在風(fēng)干過程中易變化,需用新鮮的泥樣測定,同時測定水分,以換算為風(fēng)干樣的含量。

    1.3.2 基因組DNA的提取、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增和高通量測序

    窖泥微生物總基因組DNA利用DNeasy PowerSoil DNA分離試劑盒進(jìn)行提取,提取方法按照試劑公司提供的實驗操作指南進(jìn)行。然后利用1%瓊脂糖電泳對提取的窖泥微生物DNA進(jìn)行質(zhì)量檢測,并保存于-80 ℃超低溫冰箱中。

    16S rDNA擴(kuò)增子測序的引物為338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)與806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’),擴(kuò)增為16S rRNA基因的V3-V4區(qū)。利用AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒(Axygen Biosciences,Union City,CA,USA)純化PCR產(chǎn)物,并通過QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)(Promega,Madison,WI,USA)檢測定量PCR產(chǎn)物濃度,最后在Illumina MiSeq測序平臺對PCR產(chǎn)物序列進(jìn)行雙端測序(2×300 bp;Illumina MiSeq PE300,San Diego,CA,USA),建庫與測序在上海美吉生物技術(shù)有限公司完成。

    1.3.3 窖泥理化因子分析

    水分含量測定:采用常壓干燥法[17];pH值:參照Tao Yong等[18]的方法,將窖泥經(jīng)水提取后,用pH計測定;銨態(tài)氮含量:采用紫外-可見光分光光度法測定[19];有效磷、速效鉀、腐殖質(zhì)、鈣含量:采用原子吸收光譜法,由安徽國科檢測科技有限公司測定。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    原始測序序列由Flash和Fastp軟件進(jìn)行拼接和質(zhì)控過濾。序列的檢驗標(biāo)準(zhǔn):1)過濾reads尾部質(zhì)量值20以下的堿基,設(shè)置50 bp的窗口,如果窗口內(nèi)的平均質(zhì)量值低于20,從窗口開始截去后端堿基,過濾質(zhì)控后50 bp以下的reads,去除含N堿基的reads。2)根據(jù)PE reads之間的overlap關(guān)系,將成對reads拼接(merge)成一條序列,最小overlap長度為10 bp。3)拼接序列的overlap區(qū)允許的最大錯配比率為0.2,篩選不符合序列。4)根據(jù)序列首尾兩端的barcode和引物區(qū)分樣品,并調(diào)整序列方向,barcode允許的錯配數(shù)為0,最大引物錯配數(shù)為2。使用Uchime軟件除去嵌合序列。使用Usearch(version 7.0,http://drive5.com/uparse/)將序列按照97%的相似性聚類,進(jìn)行操作分類單元(operational taxonomic units,OTU),提取代表序列,并獲得OTU表。細(xì)菌OTU代表序列與Silva(Release132,http://www.arb-silva.de)數(shù)據(jù)庫比對,進(jìn)行分類學(xué)注釋,并計算Shannon指數(shù)、ACE指數(shù)、Chao指數(shù)及文庫覆蓋率。采用Circos-0.67-7(http://circos.ca/)分析窖泥與微生物菌群的關(guān)系,采用R(pheatmap包)分析窖泥環(huán)境因素變化與細(xì)菌群落的相關(guān)性[20-22]。采用Origin 2018 64Bit、SPSS 21和Cytoscape 3.5.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 窖池窖泥理化因子分析

    2.1.1 不同年份窖池窖泥樣品中理化因子含量差異

    從表1可以看出,BPM_20和WPM_20的水分含量((44.68±0.60)%和(46.55±0.05)%)稍高于BPM_30、WPM_30和BPM_2、WPM_2,且差異顯著。BPM_30、WPM_30和BPM_2、WPM_2之間無顯著性差異。但一般認(rèn)為成熟窖泥的水分含量介于40%~50%之間,并且其含量會直接影響窖泥的pH值、腐殖質(zhì)、微生物區(qū)系及其生長狀況[23-24]。由此可見,窖泥樣品的水分含量均屬正常范圍。BPM_2、WPM_2、BPM_20、WPM_20、BPM_30和WPM_30的pH值均有顯著性差異(P<0.05),其中池壁窖泥的pH值普遍低于池底窖泥,酸性更強(qiáng),與任道群[25]和孟雅靜[26]等研究的池底泥pH值大于池壁泥pH值結(jié)果一致。并且不同年份窖池的窖泥之間pH值差距也較大,整體階段的pH值呈現(xiàn)出逐漸升高后又緩慢降低,最后趨于穩(wěn)定(5.67±0.03和4.92±0.05)。廖昶等[27]發(fā)現(xiàn)適當(dāng)?shù)膒H值不但能促進(jìn)乙醇發(fā)酵,而且還有利于產(chǎn)香前體物質(zhì)的形成,提高原酒質(zhì)量。銨態(tài)氮是微生物自身繁殖、合成各種蛋白質(zhì)以及酶類所必需的物質(zhì),適量的銨態(tài)氮對維持窖泥生境,提高酒質(zhì)有著重要作用[28]。由表1發(fā)現(xiàn),銨態(tài)氮含量與不同年份窖池窖泥pH值變化呈現(xiàn)出類似規(guī)律,池底窖泥的銨態(tài)氮含量普遍高于池壁窖泥,差異顯著(P<0.05)。但BPM_20和BPM_30差異不顯著。此外,在對有效磷和速效鉀的分析中發(fā)現(xiàn),BPM_2和WPM_2中有效磷的含量顯著低于BPM_20、WPM_20、BPM_30和WPM_30。BPM_20和WPM_20之間也存在著一定的差異。速效鉀的含量變化趨勢和窖泥中有效磷的含量變化趨勢基本一致,都呈現(xiàn)出逐漸上升,然后緩慢下降,最后趨于穩(wěn)定的趨勢。并且不同階段窖池的各窖泥樣品之間都存在顯著性差異(P<0.05)。這可能是因為有效磷是細(xì)菌與真菌分泌分解植酸酶作用后生成[29],并且與有效磷含量與土壤中微生物生物量及代謝呈正相關(guān)[30]。窖泥中的速效鉀主要是指水溶性鉀,是微生物可以利用的鉀元素[31],窖泥中適量速效鉀有利于窖泥微生物的生長繁殖。這也與窖泥樣品與菌群關(guān)系的結(jié)果一致,20 a和30 a窖泥樣品中微生物多樣性顯著高于2 a的窖泥樣品。窖泥的鈣含量與其他理化因子含量存在很大不同,BPM_2和WPM_2中鈣含量最高與其他窖泥樣品具有顯著性差異,在窖泥老熟過程中鈣含量逐漸降低并趨于穩(wěn)定。這可能是因為新的發(fā)酵窖泥中鈣含量較高,隨著窖池的老熟,窖池窖泥中己酸菌得到富集,窖泥中的鈣不斷被利用最后達(dá)到動態(tài)平衡[28]。窖泥中腐殖質(zhì)含量的變化沒有呈現(xiàn)出與不同年份之間的規(guī)律性,BPM_2和WPM_2的腐殖質(zhì)含量差異顯著,但BPM_30和WPM_30中腐殖質(zhì)含量無顯著性差異,含量趨于穩(wěn)定值。劉梅等[32]也發(fā)現(xiàn)雖然在窖泥當(dāng)中腐殖質(zhì)需要達(dá)到一定質(zhì)量分?jǐn)?shù),但是其與窖泥品質(zhì)的變化并不存在規(guī)律性。

    表1 不同年份窖池池底泥和池壁泥的理化性質(zhì)Table 1 Physicochemical properties of bottom pit mud and wall pit mud from pits of different ages

    窖泥質(zhì)量的優(yōu)劣對濃香型白酒的質(zhì)量起著至關(guān)重要的作用,并且窖泥質(zhì)量的優(yōu)劣與窖池窖齡的相關(guān)性是一個動態(tài)變化的過程,首先新窖泥逐步老熟,形成優(yōu)質(zhì)窖泥,再從優(yōu)質(zhì)窖泥逐漸退化。先前的研究發(fā)現(xiàn)新窖泥和退化窖泥與優(yōu)質(zhì)窖泥相比,具有低含水量、低pH值和低有效磷的特征[26,33],因此,可以通過窖泥的理化指標(biāo)合理判斷窖泥的質(zhì)量優(yōu)劣??傮w來看,20 a窖泥的水分含量、pH值、銨態(tài)氮、有效磷和速效鉀含量都顯著高于2 a窖泥(P<0.05),但2 a窖泥中的鈣含量卻是20 a窖泥的2.17~2.32 倍,由此也可以合理推斷,窖泥在2~20 a是一個從新窖泥逐漸老熟到優(yōu)質(zhì)窖泥的過程,窖泥的水分含量、pH值、銨態(tài)氮、有效磷和速效鉀含量都與窖齡呈正相關(guān),但窖泥的鈣含量則與窖齡呈負(fù)相關(guān)。王春艷等[34]比較分析了6 a和16 a窖泥的理化指標(biāo)時發(fā)現(xiàn),隨著窖齡的增加,窖泥的pH值、水分、銨態(tài)氮和有效磷等含量均呈現(xiàn)增長的趨勢,與本研究結(jié)果一致。而從20~30 a,窖泥開始退化,但退化的速度較為緩慢,因此僅有水分含量、pH值和銨態(tài)氮含量具有顯著性差異(P<0.05),而其他理化指標(biāo)均無顯著性差異(P>0.05),此時窖泥的水分含量、pH值和銨態(tài)氮含量則與窖齡呈負(fù)相關(guān),而其他的理化指標(biāo)則無明顯相關(guān)性。綜合比較30 a窖泥和2 a窖泥發(fā)現(xiàn),其pH值、銨態(tài)氮和有效磷含量均顯著高于2 a窖泥(P<0.05),但其鈣含量僅為2 a窖泥的0.57~0.61 倍。

    2.1.2 窖泥理化指標(biāo)主成分分析(principal component analysis,PCA)

    窖泥樣品理化指標(biāo)提取到的PC1和PC2特征值分別是4.72和1.13,均大于1,累計方差貢獻(xiàn)率為83.43%,說明成分劃分合理。如圖1所示,按照PC1和PC2的劃分,水分含量、銨態(tài)氮和pH值、有效磷、速效鉀和腐殖質(zhì)集中在同一區(qū)域,鈣含量單獨(dú)占據(jù)一區(qū)域。這些理化因子能夠為微生物提供營養(yǎng)物質(zhì)和其生長代謝必不可少的元素,與微生物的生長密切相關(guān)。因此,在同一區(qū)域的理化因子含量變化的基本趨勢一致,僅有鈣含量與其他理化因子不同,這與之前對理化指標(biāo)含量差異的分析結(jié)果一致。因此按照PC1和PC2劃分出的理化指標(biāo)具有一定的科學(xué)性。

    圖1 窖泥樣品理化指標(biāo)PCA圖Fig.1 Principal component analysis plot of PC1 versus PC2 for physicochemical indexes

    2.2 窖泥理化因子與窖泥菌群相關(guān)性研究

    2.2.1 窖泥樣品原核微生物α多樣性指數(shù)與OTU數(shù)目比較分析

    如表2所示,每個窖泥樣品序列數(shù)介于32 029~44 916 條,其中20 a和30 a窖泥的序列數(shù)量顯著高于2 a窖泥,但其在不同位置窖泥之間無顯著差異(P>0.05)。從窖泥樣品物種豐富度(Sob指數(shù)、ACE指數(shù)和Chao指數(shù))、多樣性(Shannon指數(shù))、均勻度(Simpson指數(shù))及覆蓋率可以看出,老窖泥當(dāng)中的微生物群落更豐富,多樣性更高,這表明窖泥原核微生物群落的α多樣性存在顯著的時間異質(zhì)性,并且在20~30 a這個過程當(dāng)中,窖泥質(zhì)量開始呈現(xiàn)退化趨勢。有研究發(fā)現(xiàn)Shannon指數(shù)與窖泥質(zhì)量呈正相關(guān),能很好地反映窖泥老熟和退化程度[10,35],20 a窖泥的Shannon指數(shù)顯著高于2 a窖泥,30 a窖泥的微生物多樣性與其相比也有降低的趨勢,這也很好地反映了窖泥老熟和退化的過程。

    表2 不同年份窖泥樣品原核微生物群落α多樣性指數(shù)Table 2 α-Diversity index of prokaryotic community in pit mud samples of different ages

    如圖2a所示,BPM_20中的OTU數(shù)目最多,并且不同窖泥樣品中特有OTU及其總含量分別為28和9.52%(BPM_2)、26和14.20%(WPM_2)、28和21.15%(BPM_20)、30和19.13%(WPM_20)、5和15.23%(BPM_30)、23和20.76%(WPM_30)。2 a的30 a的窖泥樣品中,池壁窖泥的OTU數(shù)目均高于池底窖泥,但是在20 a窖泥當(dāng)中,其池底窖泥的微生物多樣性更高,這表明在優(yōu)質(zhì)窖泥當(dāng)中,池底窖泥的微生物種類更加豐富。并且由圖2b可知,池壁窖泥的OTU種類和數(shù)目均高于池底窖泥,并且其特有OTU含量也更高(113,14.66%),這主要來源于2 a和30 a池壁窖泥樣品較高的相對含量比,這也表明在新窖泥和即將退化的池壁窖泥當(dāng)中存在一些影響窖泥質(zhì)量的微生物菌群,而這些菌群具體是哪些,還需要進(jìn)一步的分析研究。

    圖2 不同窖泥樣品(a)和池壁窖泥和池底窖泥中OTU水平Venn圖(b)Fig.2 Venn diagram of OTUs in pit mud samples of different ages (a) and those in bottom vs.wall pit muds (b)

    2.2.2 窖泥樣本與菌群組成關(guān)系分析

    從圖3a可以看出,共有6 個門,分別為厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、互養(yǎng)菌門(Synergistetes)、放線菌門(Actinobacteria)、Patescibacteria和軟壁菌門(Tenericutes)。在2 a的窖泥樣品中僅發(fā)現(xiàn)1 個優(yōu)勢菌門Firmicutes(BPM_2和WPM_2中平均相對豐度大于0.1%),在20 a和30 a的窖泥中發(fā)現(xiàn)4 個優(yōu)勢菌門(Firmicutes、Bacteroidetes、Synergistetes、Actinobacteria;BPM_20、WPM_20和BPM_30、WPM_30中平均相對豐度大于0.1%)。同時發(fā)現(xiàn)Firmicutes在不同窖齡的窖泥當(dāng)中含量存在很大差異,由高到低依次為Firmicutes(BPM_2,99.49%;WPM_2,99.75%)>Firmicutes(BPM_30,77.30%;WPM_30,84.88%)>Firmicutes(BPM_20,54.26%;WPM_20,65.67%)。Firmicutes的相對豐度在窖泥逐漸老熟到開始退化的過程中呈現(xiàn)出一種先降低后增加的趨勢,Tao Yong等[18]的研究也與本實驗結(jié)果一致。另外在屬水平上,共發(fā)現(xiàn)25 個菌屬(圖3b),其中在2 a的窖泥樣品中仍是僅有1 個優(yōu)勢菌屬乳酸桿菌屬(Lactobacillus)(BPM_2和WPM_2中平均豐度含量大于0.1%),并且2 a窖泥的Lactobacillus的相對豐度顯著高于20 a和30 a的老窖泥,因此可以看出Lactobacillus含量與窖泥質(zhì)量呈一定負(fù)相關(guān),而2 a窖泥中較低的pH值,也為Lactobacillus創(chuàng)造了更為有利的生長條件。分別在20 a和30 a的窖泥中發(fā)現(xiàn)15 個和17 個優(yōu)勢菌屬(BPM_20、WPM_20、BPM_30和WPM_30中平均相對豐度大于0.1%)。由此可見,BPM_2和WPM_2中Lactobacillus占據(jù)絕對優(yōu)勢地位,菌群種類單一,BPM_20、WPM_20、BPM_30和WPM_30中各種菌群分布均勻且種類豐富。由此可見,不同的窖泥樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)仍存在較大差異,胡曉龍[16]研究發(fā)現(xiàn)也證實了本實驗結(jié)果。

    圖3 不同年份窖泥樣品與菌群關(guān)系門水平(a)和屬水平(b)Circos圖Fig.3 Circos diagram for microflora structure in pit mud samples of different years at phylum (a) and genus level (b)

    2.2.3 窖泥理化因子與菌群的相關(guān)性分析

    由圖4可知,水分含量、pH值、銨態(tài)氮含量與Lactobacillus呈極顯著負(fù)相關(guān)。并且pH值與瘤胃梭菌屬(Ruminiclostridium)、Fermentimonas和Caldicoprobacter等17 個菌屬呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。水分含量與Petrimonas、互養(yǎng)單胞菌屬(Syntrophomonas)和Sedimentibacter等11 個菌屬顯著正相關(guān)(P<0.05)。銨態(tài)氮含量與Fermentimonas、Ruminiclostridium和Petrimonas等9 個菌屬顯著正相關(guān)(P<0.05)。而腐殖質(zhì)含量與Petrimonas、Syntrophomonas和Hydrogenispora等5 個菌屬呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。有效磷和速效鉀均與Anaerocella呈顯著性正相關(guān),與其他少數(shù)菌屬呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05),因此有效磷和速效鉀聚集為一簇。鈣含量與其他理化指標(biāo)不同,它僅與熱微菌屬(Tepidimicrobium)等4 個菌屬顯著正相關(guān),與其他菌屬均無顯著相關(guān),這也是其單獨(dú)聚為一簇的原因。這也與圖4中理化指標(biāo)的PCA結(jié)果一致。另外根據(jù)圖4也可以直觀地看出pH值、水分含量和銨態(tài)氮分別與屬水平總豐度前30物種當(dāng)中的18、12、10 個菌屬具有顯著相關(guān)性,因此這3 個環(huán)境因子對菌群的影響最大。劉梅等[32]也發(fā)現(xiàn)pH值和銨態(tài)氮對窖泥微生物群落的影響較大,銨態(tài)氮可以被窖泥微生物直接利用,其含量在一定程度上體現(xiàn)了窖泥對微生物生長代謝所需氮源的供給能力[36],但是其含量并不是越多越好,窖泥當(dāng)中不同的微生物菌群對養(yǎng)分的響應(yīng)程度不同,因此酒廠需要合理的工藝方法調(diào)整營養(yǎng)物質(zhì)的含量,平衡微生物的群落結(jié)構(gòu)。弱酸性環(huán)境是窖泥微生物正常代謝繁殖的必要條件,在發(fā)酵過程中對產(chǎn)酸和產(chǎn)酯具有重要作用[37],因此窖泥的pH值會顯著影響窖泥微生物自身的繁殖及其參與的生化反應(yīng)。

    圖4 窖泥理化因子與菌群相關(guān)性熱圖Fig.4 Heatmap of correlation between pit mud physicochemical indexes and microflora

    從圖5可以看出,樣品理化指標(biāo)中pH值、水分含量、銨態(tài)氮含量對微生物群落的影響較為相似,并且影響程度較大,其次是有效磷含量、腐殖質(zhì)含量和鈣含量。在總豐度排名前5的物種中,發(fā)現(xiàn)瘤胃菌科(Ruminococcaceae),與30 a窖池的窖泥有很強(qiáng)的正相關(guān)。鞭毛科(Dysgonomonadaceae)、梭菌科(Clostridiaceae_1)和互養(yǎng)菌科(Synergistaceae)與20 a窖池的窖泥樣本有較高相關(guān)性,而乳酸桿菌科(Lactobacillaceae)則主要存在于2 a窖池的窖泥樣本中。并且20 a和30 a的老窖泥樣本聚集在一簇,而2 a的新窖泥單獨(dú)聚集于一簇。與此同時,發(fā)現(xiàn)BPM_2和WPM_2樣本分布幾乎重合,而BPM_20、BPM_30和WPM_20、WPM_30分布范圍較廣,這也進(jìn)一步說明老窖泥當(dāng)中的微生物多樣性更高,新窖泥當(dāng)中的微生物組成更為單一。對于Dysgonomonadaceae、Clostridiaceae_1和Synergistaceae,可以看出水分含量、pH值、銨態(tài)氮含量和腐殖質(zhì)含量與其呈正相關(guān);對于Ruminococcaceae,可以看出鈣含量與其呈正相關(guān),而有效磷、速效鉀含量與其呈負(fù)相關(guān)。更為明顯的是水分含量、pH值、銨態(tài)氮含量和腐殖質(zhì)含量均與Lactobacillaceae呈負(fù)相關(guān)。冗余分析(redundancy analysis,RDA)的實驗結(jié)果印證了理化指標(biāo)中的水分含量、pH值、銨態(tài)氮含量對細(xì)菌存在較大的相關(guān)性,反映了不同年份窖泥樣品中細(xì)菌微生物群落的差異性。

    圖5 窖泥理化指標(biāo)和微生物群落冗余分析結(jié)果(科水平)Fig.5 Redundancy analysis of physicochemical indexes and microbial community in pit mud at family level

    從圖6a可以看出,銨態(tài)氮、有效磷、速效鉀和鈣含量這4 項理化指標(biāo)都僅與1 個微生物菌屬存在高度相關(guān)性(P<0.01)。而水分含量與Lactobacillus呈高度負(fù)相關(guān),與其他Aminobacterium、Sedimentibacter和Syntrophomonas等5 個屬的菌群均為高度正相關(guān);pH值與Lactobacillus呈高度負(fù)相關(guān),與其他Ruminiclostridium、Proteiniphilum和Caldicoprobacter等8 個屬的菌群呈高度正相關(guān);腐殖質(zhì)與Petrimonas和Syntrophomonas均呈高度正相關(guān)。由圖6b可知,共線性網(wǎng)絡(luò)共有12 個節(jié)點(2 對負(fù)相關(guān),10 對正相關(guān)),其中pH值對50.00%的菌門都具有高度相關(guān),水分含量和銨態(tài)氮含量對16.67%的菌門具有顯著相關(guān),而速效鉀僅與1 個菌門具有高度相關(guān)。綜合來看,pH值對微生物菌群的影響最大,范圍最廣。Belenguer等[38]也發(fā)現(xiàn)乳酸和丁酸水平與pH值密切相關(guān),土壤pH值降低往往會降低微生物整體多樣性并改變原核生物群落的組成。此外,窖泥中呈負(fù)相關(guān)的微生物主要發(fā)生在Lactobacillus屬和Firmicutes門,2 a窖泥中Lactobacillus屬產(chǎn)生大量乳酸,乳酸積累使窖泥的pH值下降,因此Lactobacillus和pH值可以作為衡量窖泥質(zhì)量的重要指標(biāo)。

    圖6 窖泥理化指標(biāo)和微生物菌群高度相關(guān)性分析屬水平(a)和門水平(b)共現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)圖Fig.6 Co-occurrence network diagram showing high correlation between pit mud physicochemical indexes and microbial flora at genus (a) and phylum (b) level

    3 結(jié) 論

    本研究通過分析2、20 a和30 a窖池池壁泥與池底泥的理化性質(zhì)和原核菌群結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn):1)2 a窖池的窖泥均具有顯著的低pH值(4.28、3.99)、低有效磷(13.96、16.95 mg/kg)和高鈣含量(1.76、1.67 g/kg)的特征。2)20 a和30 a的老窖泥當(dāng)中微生物群落更豐富,多樣性更高。在門水平上,老窖泥中發(fā)現(xiàn)6 個優(yōu)勢菌門,而2 a窖泥中僅Firmicutes一個優(yōu)勢菌門。在屬水平上,2 a窖泥中Lactobacillus屬占絕對的優(yōu)勢低位,菌屬種類單一,20 a和30 a的老窖池中分別有15 個和17 個優(yōu)勢菌屬,菌屬多樣性程度高。3)RDA發(fā)現(xiàn)新窖池的池壁窖泥與池底窖泥聚類較為集中,而老窖池當(dāng)中的聚類較為分散,進(jìn)一步說明了老窖泥原核菌群的豐度和多樣性要高于新窖泥。4)理化因子與菌群的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),pH值、水分含量和銨態(tài)氮分別與屬水平總豐度前30物種當(dāng)中的18、12 個和10 個菌屬具有顯著相關(guān)性,通過RDA也發(fā)現(xiàn)水分含量(60.77%)和pH值(49.62%)對相關(guān)性的解釋度最高,具有極顯著貢獻(xiàn)(P<0.01),銨態(tài)氮的解釋度為33.91%,具有顯著貢獻(xiàn)(P<0.05),因此這3 個環(huán)境因子對菌群的影響最大。

    綜上,本實驗系統(tǒng)地研究了部分不同品質(zhì)窖泥主要理化指標(biāo)的差異并進(jìn)行PCA,結(jié)合窖泥原核微生物群落多樣性在窖泥老熟及退化過程中的變化趨勢,以及窖泥理化指標(biāo)與微生物菌群的相關(guān)性分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨著窖泥年份的增加,窖泥老熟,在長期的往復(fù)發(fā)酵過程中,微生物不斷富集,進(jìn)化,并衍生出更多的種群。窖泥的理化因子和微生物多樣性指數(shù)均可以作為判斷窖泥優(yōu)劣的重要標(biāo)準(zhǔn),本研究借助微生物和理化因子之間的相關(guān)性分析,為窖池的養(yǎng)護(hù)機(jī)制及優(yōu)質(zhì)窖泥的制作提供一定了的理論支撐,可以作為生產(chǎn)和提高產(chǎn)品質(zhì)量的數(shù)據(jù)參考。

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