• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    基于高通量測序的窖泥原核微生物群落結(jié)構(gòu)及其理化因子相關(guān)性分析

    2021-09-28 03:27:14張明珠吳學(xué)鳳穆冬冬許博陽蔣俊樹閆曉明姜紹通李興江
    食品科學(xué) 2021年18期
    關(guān)鍵詞:池壁池底銨態(tài)氮

    張明珠,吳學(xué)鳳,穆冬冬,許博陽,孫 偉,蔣俊樹,閆曉明,鄭 志,姜紹通,李興江,*

    (1.合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230009;2.安徽文王釀酒股份有限公司,安徽 臨泉 236400;3.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院,安徽 合肥 230001;4.安徽省食品藥品檢驗研究院,安徽 合肥 230051)

    中國白酒是世界六大蒸餾酒之一,因為其獨(dú)特的發(fā)酵工藝和風(fēng)味而享譽(yù)全球[1-2]。我國白酒的釀造歷史悠久,以富含淀粉的糧谷類為主要原料,大曲、小曲或麩曲作為糖化發(fā)酵劑,采用固態(tài)(少數(shù)采用液態(tài)或半固態(tài))進(jìn)行發(fā)酵,經(jīng)蒸餾、貯存和勾調(diào)而成[3-4]。安徽地區(qū)流行喝高度白酒(乙醇體積分?jǐn)?shù)主要在42%~53%之間),口味以濃香型為主[5]。安徽地產(chǎn)白酒以古井、金種子、迎駕和文王為代表,均屬于濃香型白酒[6]。濃香型白酒的釀造過程是環(huán)境微生物、大曲微生物和窖泥微生物等復(fù)雜物質(zhì)能量代謝的過程[7],加入大曲的糧糟在窖池內(nèi)糖化,依賴于窖池中各種微生物群落的功能和作用完成釀造過程[8]。因此,窖泥中的微生物種類、數(shù)量繁多且復(fù)雜[9-10]。窖泥經(jīng)過長期、連續(xù)的生產(chǎn),不斷形成其獨(dú)特優(yōu)質(zhì)的微生物群落,這些微生物菌群代謝產(chǎn)生多種風(fēng)味物質(zhì),例如酯、酸和醇[11-12],并最終形成對酒質(zhì)的提高及穩(wěn)定至關(guān)重要的優(yōu)質(zhì)老窖泥[13],正所謂“千年老窖萬年糟,酒好全憑窖池老”[14]。

    近年來,隨著微生物組學(xué)和高通量測序技術(shù)的發(fā)展,使窖泥中蘊(yùn)含的厭氧微生物科學(xué)奧秘逐步得以剖析。研究發(fā)現(xiàn),這些微生物之間及與環(huán)境因子的相互作用,形成了復(fù)雜的窖泥微生物生態(tài)系統(tǒng)[15]。但具體窖泥中的理化因子與哪些菌群存在怎樣的相互作用關(guān)系,仍鮮有研究報道。目前對安徽產(chǎn)地濃香型白酒方面的研究,對古井貢酒的研究較多,而對其他品牌的濃香型白酒,如文王貢酒的研究較少。本研究通過對安徽文王白酒窖泥的理化特性與其微生物之間的相關(guān)性進(jìn)行研究分析,試圖揭示各種理化指標(biāo)對窖泥微生物群落組成的影響,以期為進(jìn)一步提高白酒風(fēng)味品質(zhì)提供方向。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    樣品取自文王酒廠2、20 a和30 a窖齡窖池窖泥[16]。采樣方法:池底泥采用五點取樣法,從窖池池底4 個角和中心點取樣混合,作為池底窖泥(2 a窖池:BPM_2;20 a窖池:BPM_20;30 a窖池:BPM_30)。池壁窖泥是從窖池的上中下層取樣混合,作為池壁泥樣品(2 a窖池:WPM_2;20 a窖池:WPM_20;30 a窖池:WPM_30),每個樣品取3 份,所取樣品每份約400 g。

    納氏試劑 上海源葉生物科技有限公司;酒石酸鈉鉀、氯化銨、氯化鈉、硫酸、高錳酸鉀、重鉻酸鉀、硫酸亞鐵銨、硫酸亞鐵(均為分析純) 中國醫(yī)藥集團(tuán)上?;瘜W(xué)試劑公司;鄰菲啰啉 天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    T6新世紀(jì)紫外-可見光分光光度計 北京普析通用儀器有限公司;VARIAN AA240原子吸收光譜儀美國瓦里安中國有限公司;MiSeqPE300 美國Illumina公司;DNeasy PowerSoil DNA分離試劑盒美國Qiagen公司。

    1.3 方法

    1.3.1 樣品前處理

    將采集樣品置于無菌袋中充分混勻后分成2 份,分別置于4 ℃冰箱(測定理化指標(biāo))和-80 ℃冰箱(窖泥DNA的提?。?。將新鮮的窖泥樣品平攤在瓷盤中,自然風(fēng)干,風(fēng)干后研磨成粉,通過60 目篩,保存在磨口瓶中。銨態(tài)氮在風(fēng)干過程中易變化,需用新鮮的泥樣測定,同時測定水分,以換算為風(fēng)干樣的含量。

    1.3.2 基因組DNA的提取、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增和高通量測序

    窖泥微生物總基因組DNA利用DNeasy PowerSoil DNA分離試劑盒進(jìn)行提取,提取方法按照試劑公司提供的實驗操作指南進(jìn)行。然后利用1%瓊脂糖電泳對提取的窖泥微生物DNA進(jìn)行質(zhì)量檢測,并保存于-80 ℃超低溫冰箱中。

    16S rDNA擴(kuò)增子測序的引物為338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)與806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’),擴(kuò)增為16S rRNA基因的V3-V4區(qū)。利用AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒(Axygen Biosciences,Union City,CA,USA)純化PCR產(chǎn)物,并通過QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)(Promega,Madison,WI,USA)檢測定量PCR產(chǎn)物濃度,最后在Illumina MiSeq測序平臺對PCR產(chǎn)物序列進(jìn)行雙端測序(2×300 bp;Illumina MiSeq PE300,San Diego,CA,USA),建庫與測序在上海美吉生物技術(shù)有限公司完成。

    1.3.3 窖泥理化因子分析

    水分含量測定:采用常壓干燥法[17];pH值:參照Tao Yong等[18]的方法,將窖泥經(jīng)水提取后,用pH計測定;銨態(tài)氮含量:采用紫外-可見光分光光度法測定[19];有效磷、速效鉀、腐殖質(zhì)、鈣含量:采用原子吸收光譜法,由安徽國科檢測科技有限公司測定。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    原始測序序列由Flash和Fastp軟件進(jìn)行拼接和質(zhì)控過濾。序列的檢驗標(biāo)準(zhǔn):1)過濾reads尾部質(zhì)量值20以下的堿基,設(shè)置50 bp的窗口,如果窗口內(nèi)的平均質(zhì)量值低于20,從窗口開始截去后端堿基,過濾質(zhì)控后50 bp以下的reads,去除含N堿基的reads。2)根據(jù)PE reads之間的overlap關(guān)系,將成對reads拼接(merge)成一條序列,最小overlap長度為10 bp。3)拼接序列的overlap區(qū)允許的最大錯配比率為0.2,篩選不符合序列。4)根據(jù)序列首尾兩端的barcode和引物區(qū)分樣品,并調(diào)整序列方向,barcode允許的錯配數(shù)為0,最大引物錯配數(shù)為2。使用Uchime軟件除去嵌合序列。使用Usearch(version 7.0,http://drive5.com/uparse/)將序列按照97%的相似性聚類,進(jìn)行操作分類單元(operational taxonomic units,OTU),提取代表序列,并獲得OTU表。細(xì)菌OTU代表序列與Silva(Release132,http://www.arb-silva.de)數(shù)據(jù)庫比對,進(jìn)行分類學(xué)注釋,并計算Shannon指數(shù)、ACE指數(shù)、Chao指數(shù)及文庫覆蓋率。采用Circos-0.67-7(http://circos.ca/)分析窖泥與微生物菌群的關(guān)系,采用R(pheatmap包)分析窖泥環(huán)境因素變化與細(xì)菌群落的相關(guān)性[20-22]。采用Origin 2018 64Bit、SPSS 21和Cytoscape 3.5.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 窖池窖泥理化因子分析

    2.1.1 不同年份窖池窖泥樣品中理化因子含量差異

    從表1可以看出,BPM_20和WPM_20的水分含量((44.68±0.60)%和(46.55±0.05)%)稍高于BPM_30、WPM_30和BPM_2、WPM_2,且差異顯著。BPM_30、WPM_30和BPM_2、WPM_2之間無顯著性差異。但一般認(rèn)為成熟窖泥的水分含量介于40%~50%之間,并且其含量會直接影響窖泥的pH值、腐殖質(zhì)、微生物區(qū)系及其生長狀況[23-24]。由此可見,窖泥樣品的水分含量均屬正常范圍。BPM_2、WPM_2、BPM_20、WPM_20、BPM_30和WPM_30的pH值均有顯著性差異(P<0.05),其中池壁窖泥的pH值普遍低于池底窖泥,酸性更強(qiáng),與任道群[25]和孟雅靜[26]等研究的池底泥pH值大于池壁泥pH值結(jié)果一致。并且不同年份窖池的窖泥之間pH值差距也較大,整體階段的pH值呈現(xiàn)出逐漸升高后又緩慢降低,最后趨于穩(wěn)定(5.67±0.03和4.92±0.05)。廖昶等[27]發(fā)現(xiàn)適當(dāng)?shù)膒H值不但能促進(jìn)乙醇發(fā)酵,而且還有利于產(chǎn)香前體物質(zhì)的形成,提高原酒質(zhì)量。銨態(tài)氮是微生物自身繁殖、合成各種蛋白質(zhì)以及酶類所必需的物質(zhì),適量的銨態(tài)氮對維持窖泥生境,提高酒質(zhì)有著重要作用[28]。由表1發(fā)現(xiàn),銨態(tài)氮含量與不同年份窖池窖泥pH值變化呈現(xiàn)出類似規(guī)律,池底窖泥的銨態(tài)氮含量普遍高于池壁窖泥,差異顯著(P<0.05)。但BPM_20和BPM_30差異不顯著。此外,在對有效磷和速效鉀的分析中發(fā)現(xiàn),BPM_2和WPM_2中有效磷的含量顯著低于BPM_20、WPM_20、BPM_30和WPM_30。BPM_20和WPM_20之間也存在著一定的差異。速效鉀的含量變化趨勢和窖泥中有效磷的含量變化趨勢基本一致,都呈現(xiàn)出逐漸上升,然后緩慢下降,最后趨于穩(wěn)定的趨勢。并且不同階段窖池的各窖泥樣品之間都存在顯著性差異(P<0.05)。這可能是因為有效磷是細(xì)菌與真菌分泌分解植酸酶作用后生成[29],并且與有效磷含量與土壤中微生物生物量及代謝呈正相關(guān)[30]。窖泥中的速效鉀主要是指水溶性鉀,是微生物可以利用的鉀元素[31],窖泥中適量速效鉀有利于窖泥微生物的生長繁殖。這也與窖泥樣品與菌群關(guān)系的結(jié)果一致,20 a和30 a窖泥樣品中微生物多樣性顯著高于2 a的窖泥樣品。窖泥的鈣含量與其他理化因子含量存在很大不同,BPM_2和WPM_2中鈣含量最高與其他窖泥樣品具有顯著性差異,在窖泥老熟過程中鈣含量逐漸降低并趨于穩(wěn)定。這可能是因為新的發(fā)酵窖泥中鈣含量較高,隨著窖池的老熟,窖池窖泥中己酸菌得到富集,窖泥中的鈣不斷被利用最后達(dá)到動態(tài)平衡[28]。窖泥中腐殖質(zhì)含量的變化沒有呈現(xiàn)出與不同年份之間的規(guī)律性,BPM_2和WPM_2的腐殖質(zhì)含量差異顯著,但BPM_30和WPM_30中腐殖質(zhì)含量無顯著性差異,含量趨于穩(wěn)定值。劉梅等[32]也發(fā)現(xiàn)雖然在窖泥當(dāng)中腐殖質(zhì)需要達(dá)到一定質(zhì)量分?jǐn)?shù),但是其與窖泥品質(zhì)的變化并不存在規(guī)律性。

    表1 不同年份窖池池底泥和池壁泥的理化性質(zhì)Table 1 Physicochemical properties of bottom pit mud and wall pit mud from pits of different ages

    窖泥質(zhì)量的優(yōu)劣對濃香型白酒的質(zhì)量起著至關(guān)重要的作用,并且窖泥質(zhì)量的優(yōu)劣與窖池窖齡的相關(guān)性是一個動態(tài)變化的過程,首先新窖泥逐步老熟,形成優(yōu)質(zhì)窖泥,再從優(yōu)質(zhì)窖泥逐漸退化。先前的研究發(fā)現(xiàn)新窖泥和退化窖泥與優(yōu)質(zhì)窖泥相比,具有低含水量、低pH值和低有效磷的特征[26,33],因此,可以通過窖泥的理化指標(biāo)合理判斷窖泥的質(zhì)量優(yōu)劣??傮w來看,20 a窖泥的水分含量、pH值、銨態(tài)氮、有效磷和速效鉀含量都顯著高于2 a窖泥(P<0.05),但2 a窖泥中的鈣含量卻是20 a窖泥的2.17~2.32 倍,由此也可以合理推斷,窖泥在2~20 a是一個從新窖泥逐漸老熟到優(yōu)質(zhì)窖泥的過程,窖泥的水分含量、pH值、銨態(tài)氮、有效磷和速效鉀含量都與窖齡呈正相關(guān),但窖泥的鈣含量則與窖齡呈負(fù)相關(guān)。王春艷等[34]比較分析了6 a和16 a窖泥的理化指標(biāo)時發(fā)現(xiàn),隨著窖齡的增加,窖泥的pH值、水分、銨態(tài)氮和有效磷等含量均呈現(xiàn)增長的趨勢,與本研究結(jié)果一致。而從20~30 a,窖泥開始退化,但退化的速度較為緩慢,因此僅有水分含量、pH值和銨態(tài)氮含量具有顯著性差異(P<0.05),而其他理化指標(biāo)均無顯著性差異(P>0.05),此時窖泥的水分含量、pH值和銨態(tài)氮含量則與窖齡呈負(fù)相關(guān),而其他的理化指標(biāo)則無明顯相關(guān)性。綜合比較30 a窖泥和2 a窖泥發(fā)現(xiàn),其pH值、銨態(tài)氮和有效磷含量均顯著高于2 a窖泥(P<0.05),但其鈣含量僅為2 a窖泥的0.57~0.61 倍。

    2.1.2 窖泥理化指標(biāo)主成分分析(principal component analysis,PCA)

    窖泥樣品理化指標(biāo)提取到的PC1和PC2特征值分別是4.72和1.13,均大于1,累計方差貢獻(xiàn)率為83.43%,說明成分劃分合理。如圖1所示,按照PC1和PC2的劃分,水分含量、銨態(tài)氮和pH值、有效磷、速效鉀和腐殖質(zhì)集中在同一區(qū)域,鈣含量單獨(dú)占據(jù)一區(qū)域。這些理化因子能夠為微生物提供營養(yǎng)物質(zhì)和其生長代謝必不可少的元素,與微生物的生長密切相關(guān)。因此,在同一區(qū)域的理化因子含量變化的基本趨勢一致,僅有鈣含量與其他理化因子不同,這與之前對理化指標(biāo)含量差異的分析結(jié)果一致。因此按照PC1和PC2劃分出的理化指標(biāo)具有一定的科學(xué)性。

    圖1 窖泥樣品理化指標(biāo)PCA圖Fig.1 Principal component analysis plot of PC1 versus PC2 for physicochemical indexes

    2.2 窖泥理化因子與窖泥菌群相關(guān)性研究

    2.2.1 窖泥樣品原核微生物α多樣性指數(shù)與OTU數(shù)目比較分析

    如表2所示,每個窖泥樣品序列數(shù)介于32 029~44 916 條,其中20 a和30 a窖泥的序列數(shù)量顯著高于2 a窖泥,但其在不同位置窖泥之間無顯著差異(P>0.05)。從窖泥樣品物種豐富度(Sob指數(shù)、ACE指數(shù)和Chao指數(shù))、多樣性(Shannon指數(shù))、均勻度(Simpson指數(shù))及覆蓋率可以看出,老窖泥當(dāng)中的微生物群落更豐富,多樣性更高,這表明窖泥原核微生物群落的α多樣性存在顯著的時間異質(zhì)性,并且在20~30 a這個過程當(dāng)中,窖泥質(zhì)量開始呈現(xiàn)退化趨勢。有研究發(fā)現(xiàn)Shannon指數(shù)與窖泥質(zhì)量呈正相關(guān),能很好地反映窖泥老熟和退化程度[10,35],20 a窖泥的Shannon指數(shù)顯著高于2 a窖泥,30 a窖泥的微生物多樣性與其相比也有降低的趨勢,這也很好地反映了窖泥老熟和退化的過程。

    表2 不同年份窖泥樣品原核微生物群落α多樣性指數(shù)Table 2 α-Diversity index of prokaryotic community in pit mud samples of different ages

    如圖2a所示,BPM_20中的OTU數(shù)目最多,并且不同窖泥樣品中特有OTU及其總含量分別為28和9.52%(BPM_2)、26和14.20%(WPM_2)、28和21.15%(BPM_20)、30和19.13%(WPM_20)、5和15.23%(BPM_30)、23和20.76%(WPM_30)。2 a的30 a的窖泥樣品中,池壁窖泥的OTU數(shù)目均高于池底窖泥,但是在20 a窖泥當(dāng)中,其池底窖泥的微生物多樣性更高,這表明在優(yōu)質(zhì)窖泥當(dāng)中,池底窖泥的微生物種類更加豐富。并且由圖2b可知,池壁窖泥的OTU種類和數(shù)目均高于池底窖泥,并且其特有OTU含量也更高(113,14.66%),這主要來源于2 a和30 a池壁窖泥樣品較高的相對含量比,這也表明在新窖泥和即將退化的池壁窖泥當(dāng)中存在一些影響窖泥質(zhì)量的微生物菌群,而這些菌群具體是哪些,還需要進(jìn)一步的分析研究。

    圖2 不同窖泥樣品(a)和池壁窖泥和池底窖泥中OTU水平Venn圖(b)Fig.2 Venn diagram of OTUs in pit mud samples of different ages (a) and those in bottom vs.wall pit muds (b)

    2.2.2 窖泥樣本與菌群組成關(guān)系分析

    從圖3a可以看出,共有6 個門,分別為厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、互養(yǎng)菌門(Synergistetes)、放線菌門(Actinobacteria)、Patescibacteria和軟壁菌門(Tenericutes)。在2 a的窖泥樣品中僅發(fā)現(xiàn)1 個優(yōu)勢菌門Firmicutes(BPM_2和WPM_2中平均相對豐度大于0.1%),在20 a和30 a的窖泥中發(fā)現(xiàn)4 個優(yōu)勢菌門(Firmicutes、Bacteroidetes、Synergistetes、Actinobacteria;BPM_20、WPM_20和BPM_30、WPM_30中平均相對豐度大于0.1%)。同時發(fā)現(xiàn)Firmicutes在不同窖齡的窖泥當(dāng)中含量存在很大差異,由高到低依次為Firmicutes(BPM_2,99.49%;WPM_2,99.75%)>Firmicutes(BPM_30,77.30%;WPM_30,84.88%)>Firmicutes(BPM_20,54.26%;WPM_20,65.67%)。Firmicutes的相對豐度在窖泥逐漸老熟到開始退化的過程中呈現(xiàn)出一種先降低后增加的趨勢,Tao Yong等[18]的研究也與本實驗結(jié)果一致。另外在屬水平上,共發(fā)現(xiàn)25 個菌屬(圖3b),其中在2 a的窖泥樣品中仍是僅有1 個優(yōu)勢菌屬乳酸桿菌屬(Lactobacillus)(BPM_2和WPM_2中平均豐度含量大于0.1%),并且2 a窖泥的Lactobacillus的相對豐度顯著高于20 a和30 a的老窖泥,因此可以看出Lactobacillus含量與窖泥質(zhì)量呈一定負(fù)相關(guān),而2 a窖泥中較低的pH值,也為Lactobacillus創(chuàng)造了更為有利的生長條件。分別在20 a和30 a的窖泥中發(fā)現(xiàn)15 個和17 個優(yōu)勢菌屬(BPM_20、WPM_20、BPM_30和WPM_30中平均相對豐度大于0.1%)。由此可見,BPM_2和WPM_2中Lactobacillus占據(jù)絕對優(yōu)勢地位,菌群種類單一,BPM_20、WPM_20、BPM_30和WPM_30中各種菌群分布均勻且種類豐富。由此可見,不同的窖泥樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)仍存在較大差異,胡曉龍[16]研究發(fā)現(xiàn)也證實了本實驗結(jié)果。

    圖3 不同年份窖泥樣品與菌群關(guān)系門水平(a)和屬水平(b)Circos圖Fig.3 Circos diagram for microflora structure in pit mud samples of different years at phylum (a) and genus level (b)

    2.2.3 窖泥理化因子與菌群的相關(guān)性分析

    由圖4可知,水分含量、pH值、銨態(tài)氮含量與Lactobacillus呈極顯著負(fù)相關(guān)。并且pH值與瘤胃梭菌屬(Ruminiclostridium)、Fermentimonas和Caldicoprobacter等17 個菌屬呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。水分含量與Petrimonas、互養(yǎng)單胞菌屬(Syntrophomonas)和Sedimentibacter等11 個菌屬顯著正相關(guān)(P<0.05)。銨態(tài)氮含量與Fermentimonas、Ruminiclostridium和Petrimonas等9 個菌屬顯著正相關(guān)(P<0.05)。而腐殖質(zhì)含量與Petrimonas、Syntrophomonas和Hydrogenispora等5 個菌屬呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。有效磷和速效鉀均與Anaerocella呈顯著性正相關(guān),與其他少數(shù)菌屬呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05),因此有效磷和速效鉀聚集為一簇。鈣含量與其他理化指標(biāo)不同,它僅與熱微菌屬(Tepidimicrobium)等4 個菌屬顯著正相關(guān),與其他菌屬均無顯著相關(guān),這也是其單獨(dú)聚為一簇的原因。這也與圖4中理化指標(biāo)的PCA結(jié)果一致。另外根據(jù)圖4也可以直觀地看出pH值、水分含量和銨態(tài)氮分別與屬水平總豐度前30物種當(dāng)中的18、12、10 個菌屬具有顯著相關(guān)性,因此這3 個環(huán)境因子對菌群的影響最大。劉梅等[32]也發(fā)現(xiàn)pH值和銨態(tài)氮對窖泥微生物群落的影響較大,銨態(tài)氮可以被窖泥微生物直接利用,其含量在一定程度上體現(xiàn)了窖泥對微生物生長代謝所需氮源的供給能力[36],但是其含量并不是越多越好,窖泥當(dāng)中不同的微生物菌群對養(yǎng)分的響應(yīng)程度不同,因此酒廠需要合理的工藝方法調(diào)整營養(yǎng)物質(zhì)的含量,平衡微生物的群落結(jié)構(gòu)。弱酸性環(huán)境是窖泥微生物正常代謝繁殖的必要條件,在發(fā)酵過程中對產(chǎn)酸和產(chǎn)酯具有重要作用[37],因此窖泥的pH值會顯著影響窖泥微生物自身的繁殖及其參與的生化反應(yīng)。

    圖4 窖泥理化因子與菌群相關(guān)性熱圖Fig.4 Heatmap of correlation between pit mud physicochemical indexes and microflora

    從圖5可以看出,樣品理化指標(biāo)中pH值、水分含量、銨態(tài)氮含量對微生物群落的影響較為相似,并且影響程度較大,其次是有效磷含量、腐殖質(zhì)含量和鈣含量。在總豐度排名前5的物種中,發(fā)現(xiàn)瘤胃菌科(Ruminococcaceae),與30 a窖池的窖泥有很強(qiáng)的正相關(guān)。鞭毛科(Dysgonomonadaceae)、梭菌科(Clostridiaceae_1)和互養(yǎng)菌科(Synergistaceae)與20 a窖池的窖泥樣本有較高相關(guān)性,而乳酸桿菌科(Lactobacillaceae)則主要存在于2 a窖池的窖泥樣本中。并且20 a和30 a的老窖泥樣本聚集在一簇,而2 a的新窖泥單獨(dú)聚集于一簇。與此同時,發(fā)現(xiàn)BPM_2和WPM_2樣本分布幾乎重合,而BPM_20、BPM_30和WPM_20、WPM_30分布范圍較廣,這也進(jìn)一步說明老窖泥當(dāng)中的微生物多樣性更高,新窖泥當(dāng)中的微生物組成更為單一。對于Dysgonomonadaceae、Clostridiaceae_1和Synergistaceae,可以看出水分含量、pH值、銨態(tài)氮含量和腐殖質(zhì)含量與其呈正相關(guān);對于Ruminococcaceae,可以看出鈣含量與其呈正相關(guān),而有效磷、速效鉀含量與其呈負(fù)相關(guān)。更為明顯的是水分含量、pH值、銨態(tài)氮含量和腐殖質(zhì)含量均與Lactobacillaceae呈負(fù)相關(guān)。冗余分析(redundancy analysis,RDA)的實驗結(jié)果印證了理化指標(biāo)中的水分含量、pH值、銨態(tài)氮含量對細(xì)菌存在較大的相關(guān)性,反映了不同年份窖泥樣品中細(xì)菌微生物群落的差異性。

    圖5 窖泥理化指標(biāo)和微生物群落冗余分析結(jié)果(科水平)Fig.5 Redundancy analysis of physicochemical indexes and microbial community in pit mud at family level

    從圖6a可以看出,銨態(tài)氮、有效磷、速效鉀和鈣含量這4 項理化指標(biāo)都僅與1 個微生物菌屬存在高度相關(guān)性(P<0.01)。而水分含量與Lactobacillus呈高度負(fù)相關(guān),與其他Aminobacterium、Sedimentibacter和Syntrophomonas等5 個屬的菌群均為高度正相關(guān);pH值與Lactobacillus呈高度負(fù)相關(guān),與其他Ruminiclostridium、Proteiniphilum和Caldicoprobacter等8 個屬的菌群呈高度正相關(guān);腐殖質(zhì)與Petrimonas和Syntrophomonas均呈高度正相關(guān)。由圖6b可知,共線性網(wǎng)絡(luò)共有12 個節(jié)點(2 對負(fù)相關(guān),10 對正相關(guān)),其中pH值對50.00%的菌門都具有高度相關(guān),水分含量和銨態(tài)氮含量對16.67%的菌門具有顯著相關(guān),而速效鉀僅與1 個菌門具有高度相關(guān)。綜合來看,pH值對微生物菌群的影響最大,范圍最廣。Belenguer等[38]也發(fā)現(xiàn)乳酸和丁酸水平與pH值密切相關(guān),土壤pH值降低往往會降低微生物整體多樣性并改變原核生物群落的組成。此外,窖泥中呈負(fù)相關(guān)的微生物主要發(fā)生在Lactobacillus屬和Firmicutes門,2 a窖泥中Lactobacillus屬產(chǎn)生大量乳酸,乳酸積累使窖泥的pH值下降,因此Lactobacillus和pH值可以作為衡量窖泥質(zhì)量的重要指標(biāo)。

    圖6 窖泥理化指標(biāo)和微生物菌群高度相關(guān)性分析屬水平(a)和門水平(b)共現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)圖Fig.6 Co-occurrence network diagram showing high correlation between pit mud physicochemical indexes and microbial flora at genus (a) and phylum (b) level

    3 結(jié) 論

    本研究通過分析2、20 a和30 a窖池池壁泥與池底泥的理化性質(zhì)和原核菌群結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn):1)2 a窖池的窖泥均具有顯著的低pH值(4.28、3.99)、低有效磷(13.96、16.95 mg/kg)和高鈣含量(1.76、1.67 g/kg)的特征。2)20 a和30 a的老窖泥當(dāng)中微生物群落更豐富,多樣性更高。在門水平上,老窖泥中發(fā)現(xiàn)6 個優(yōu)勢菌門,而2 a窖泥中僅Firmicutes一個優(yōu)勢菌門。在屬水平上,2 a窖泥中Lactobacillus屬占絕對的優(yōu)勢低位,菌屬種類單一,20 a和30 a的老窖池中分別有15 個和17 個優(yōu)勢菌屬,菌屬多樣性程度高。3)RDA發(fā)現(xiàn)新窖池的池壁窖泥與池底窖泥聚類較為集中,而老窖池當(dāng)中的聚類較為分散,進(jìn)一步說明了老窖泥原核菌群的豐度和多樣性要高于新窖泥。4)理化因子與菌群的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),pH值、水分含量和銨態(tài)氮分別與屬水平總豐度前30物種當(dāng)中的18、12 個和10 個菌屬具有顯著相關(guān)性,通過RDA也發(fā)現(xiàn)水分含量(60.77%)和pH值(49.62%)對相關(guān)性的解釋度最高,具有極顯著貢獻(xiàn)(P<0.01),銨態(tài)氮的解釋度為33.91%,具有顯著貢獻(xiàn)(P<0.05),因此這3 個環(huán)境因子對菌群的影響最大。

    綜上,本實驗系統(tǒng)地研究了部分不同品質(zhì)窖泥主要理化指標(biāo)的差異并進(jìn)行PCA,結(jié)合窖泥原核微生物群落多樣性在窖泥老熟及退化過程中的變化趨勢,以及窖泥理化指標(biāo)與微生物菌群的相關(guān)性分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨著窖泥年份的增加,窖泥老熟,在長期的往復(fù)發(fā)酵過程中,微生物不斷富集,進(jìn)化,并衍生出更多的種群。窖泥的理化因子和微生物多樣性指數(shù)均可以作為判斷窖泥優(yōu)劣的重要標(biāo)準(zhǔn),本研究借助微生物和理化因子之間的相關(guān)性分析,為窖池的養(yǎng)護(hù)機(jī)制及優(yōu)質(zhì)窖泥的制作提供一定了的理論支撐,可以作為生產(chǎn)和提高產(chǎn)品質(zhì)量的數(shù)據(jù)參考。

    猜你喜歡
    池壁池底銨態(tài)氮
    筏板基礎(chǔ)-敞口水池池壁豎向最大彎矩影響因素分析
    池壁冷卻風(fēng)在玻璃纖維窯爐中的應(yīng)用
    江蘇建材(2023年5期)2023-06-06 20:31:44
    超長水池溫度應(yīng)力分析及探討
    不同質(zhì)地土壤銨態(tài)氮吸附/解吸特征
    高溫天氣水產(chǎn)養(yǎng)殖池塘如何防“底熱”
    不同鹽堿化土壤對NH+4吸附特性研究
    游白沙坡溫泉
    含笑花(2018年1期)2018-01-24 15:28:06
    有機(jī)質(zhì)對城市污染河道沉積物銨態(tài)氮吸附-解吸的影響*
    壁面溫差對鋼筋混凝土圓形水池池壁結(jié)構(gòu)的影響
    半地下式圓形貯液池結(jié)構(gòu)分析
    中文资源天堂在线| 一级毛片 在线播放| 丰满饥渴人妻一区二区三| 国产免费福利视频在线观看| 男男h啪啪无遮挡| 国产伦在线观看视频一区| 一级片'在线观看视频| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 深夜a级毛片| 久久综合国产亚洲精品| 亚洲三级黄色毛片| 99视频精品全部免费 在线| 欧美bdsm另类| 亚洲精品456在线播放app| 蜜臀久久99精品久久宅男| 久久精品夜色国产| 在线观看av片永久免费下载| 老司机影院成人| 精品国产露脸久久av麻豆| 51国产日韩欧美| 亚洲精品成人av观看孕妇| 欧美日韩亚洲高清精品| 伊人久久国产一区二区| 日韩欧美一区视频在线观看 | 欧美精品一区二区大全| 久久免费观看电影| 久久精品国产自在天天线| 成人亚洲精品一区在线观看| 久久久久久久久久久免费av| 91成人精品电影| 久久久久精品性色| 黑人猛操日本美女一级片| 一区在线观看完整版| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 五月玫瑰六月丁香| 在线观看免费视频网站a站| 久久午夜综合久久蜜桃| 欧美人与善性xxx| 久久国产亚洲av麻豆专区| 成人亚洲欧美一区二区av| 热99国产精品久久久久久7| 成人毛片60女人毛片免费| 午夜视频国产福利| 久久这里有精品视频免费| 国产亚洲一区二区精品| 免费观看无遮挡的男女| 桃花免费在线播放| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 久久久久久久久久成人| 午夜福利,免费看| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 久久99一区二区三区| 99热6这里只有精品| 日本av免费视频播放| 久久精品国产亚洲av天美| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 亚洲丝袜综合中文字幕| 国产精品女同一区二区软件| av有码第一页| 美女cb高潮喷水在线观看| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 亚洲成人一二三区av| 草草在线视频免费看| 男人添女人高潮全过程视频| 国产视频首页在线观看| 日本黄色日本黄色录像| 亚洲国产最新在线播放| 午夜福利网站1000一区二区三区| 秋霞在线观看毛片| 午夜av观看不卡| av天堂久久9| 亚洲精品456在线播放app| 十分钟在线观看高清视频www | 国产精品人妻久久久久久| 日本av手机在线免费观看| 黑丝袜美女国产一区| a 毛片基地| 国产精品偷伦视频观看了| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 视频区图区小说| 久久久久网色| 69精品国产乱码久久久| 一个人免费看片子| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| av有码第一页| 国产精品一区www在线观看| 少妇丰满av| 国产高清三级在线| 久久午夜综合久久蜜桃| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 精品人妻熟女av久视频| 97超碰精品成人国产| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 欧美日韩综合久久久久久| 国产乱来视频区| 亚洲av男天堂| 中国美白少妇内射xxxbb| 国模一区二区三区四区视频| 精品人妻偷拍中文字幕| 国产爽快片一区二区三区| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 日韩 亚洲 欧美在线| 午夜av观看不卡| h视频一区二区三区| 热re99久久国产66热| 久久久亚洲精品成人影院| 熟妇人妻不卡中文字幕| 男女国产视频网站| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 天堂俺去俺来也www色官网| 久久久久视频综合| 免费看光身美女| 人妻少妇偷人精品九色| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 免费看不卡的av| 亚洲va在线va天堂va国产| 亚洲熟女精品中文字幕| 久热这里只有精品99| 午夜91福利影院| 日韩中字成人| 国产伦精品一区二区三区四那| 亚洲高清免费不卡视频| 日韩av在线免费看完整版不卡| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 国产欧美日韩综合在线一区二区 | 在线观看三级黄色| av免费观看日本| 日韩三级伦理在线观看| 高清午夜精品一区二区三区| 内地一区二区视频在线| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 久久久午夜欧美精品| 在线观看一区二区三区激情| 美女福利国产在线| 少妇人妻一区二区三区视频| 国产成人午夜福利电影在线观看| av女优亚洲男人天堂| 我的女老师完整版在线观看| 夫妻性生交免费视频一级片| 最黄视频免费看| 久久久久人妻精品一区果冻| 日韩 亚洲 欧美在线| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| av福利片在线观看| 人人妻人人澡人人看| 视频中文字幕在线观看| 秋霞在线观看毛片| 蜜桃在线观看..| 伊人亚洲综合成人网| www.色视频.com| 日韩成人av中文字幕在线观看| 久久精品国产亚洲网站| 午夜视频国产福利| 国产免费一级a男人的天堂| 国产一区二区在线观看日韩| 综合色丁香网| 女性被躁到高潮视频| 91精品国产九色| 精品少妇黑人巨大在线播放| 2022亚洲国产成人精品| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 色视频在线一区二区三区| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 老司机影院毛片| 亚洲美女黄色视频免费看| 成人特级av手机在线观看| 国产免费视频播放在线视频| 亚洲av综合色区一区| 人妻一区二区av| 婷婷色麻豆天堂久久| 久久久精品94久久精品| 熟女人妻精品中文字幕| 99热这里只有是精品50| 日韩一区二区视频免费看| 我的老师免费观看完整版| 观看av在线不卡| 校园人妻丝袜中文字幕| 国产日韩欧美在线精品| 久久热精品热| 观看美女的网站| 久久久久久人妻| 国产黄片美女视频| 桃花免费在线播放| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| av在线老鸭窝| 天堂中文最新版在线下载| 爱豆传媒免费全集在线观看| 我要看黄色一级片免费的| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 高清毛片免费看| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 亚洲熟女精品中文字幕| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 免费看日本二区| 国产精品.久久久| freevideosex欧美| 嫩草影院新地址| 国产视频内射| 久久久久久久久久成人| 日本午夜av视频| 一级毛片久久久久久久久女| 日本黄色片子视频| 国产成人一区二区在线| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 一级黄片播放器| 国产免费又黄又爽又色| 大陆偷拍与自拍| 国产一区二区在线观看av| 成人影院久久| 妹子高潮喷水视频| 久久久欧美国产精品| 日韩一本色道免费dvd| 九色成人免费人妻av| 一区二区三区四区激情视频| 51国产日韩欧美| kizo精华| 亚洲精品aⅴ在线观看| 国产成人精品婷婷| av国产久精品久网站免费入址| 亚洲精品国产av蜜桃| 99热全是精品| 国产淫语在线视频| kizo精华| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 三级国产精品片| 国产精品人妻久久久久久| 男的添女的下面高潮视频| 久久精品国产自在天天线| 嫩草影院入口| 欧美精品亚洲一区二区| 丝袜喷水一区| 精品国产露脸久久av麻豆| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 黄色怎么调成土黄色| 老司机影院成人| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 亚洲精品一二三| 成人黄色视频免费在线看| 好男人视频免费观看在线| 中文在线观看免费www的网站| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 国产伦精品一区二区三区视频9| 黄色怎么调成土黄色| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 国内揄拍国产精品人妻在线| 久久6这里有精品| videos熟女内射| 国产精品一区二区在线观看99| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 亚洲精品成人av观看孕妇| 日本免费在线观看一区| 久久午夜福利片| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 大陆偷拍与自拍| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 国产成人午夜福利电影在线观看| 一级a做视频免费观看| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 一级黄片播放器| 欧美xxⅹ黑人| 国产在视频线精品| 老司机影院毛片| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 国产在线男女| 国产成人精品婷婷| 亚洲av成人精品一区久久| av免费观看日本| 下体分泌物呈黄色| 高清黄色对白视频在线免费看 | 女人久久www免费人成看片| 99久久中文字幕三级久久日本| 一区二区三区免费毛片| 久久精品久久久久久久性| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 最近2019中文字幕mv第一页| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 国产又色又爽无遮挡免| 欧美精品一区二区免费开放| 亚洲,一卡二卡三卡| 一个人免费看片子| 插逼视频在线观看| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 免费少妇av软件| 久久99精品国语久久久| 欧美性感艳星| 成年av动漫网址| 久久人妻熟女aⅴ| 国产免费视频播放在线视频| 99国产精品免费福利视频| 日韩av免费高清视频| 亚洲精品一区蜜桃| 国产伦精品一区二区三区视频9| 成人二区视频| 日韩av不卡免费在线播放| 亚洲四区av| 久久女婷五月综合色啪小说| 午夜福利视频精品| 黄色一级大片看看| 国产综合精华液| 人人妻人人看人人澡| 日韩三级伦理在线观看| 精品亚洲成a人片在线观看| 亚洲欧美精品专区久久| 熟女人妻精品中文字幕| 伊人亚洲综合成人网| 春色校园在线视频观看| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 嫩草影院入口| 夫妻性生交免费视频一级片| videossex国产| 在线精品无人区一区二区三| 国产视频首页在线观看| 亚洲精品一二三| 国产精品欧美亚洲77777| 精品人妻一区二区三区麻豆| 99热网站在线观看| 精品亚洲成国产av| 国产成人免费观看mmmm| 丁香六月天网| 99热网站在线观看| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 国产伦精品一区二区三区视频9| 欧美 日韩 精品 国产| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| a 毛片基地| 成人毛片60女人毛片免费| 2021少妇久久久久久久久久久| 黄色日韩在线| 美女内射精品一级片tv| 久久久久久久久久人人人人人人| 国产成人免费无遮挡视频| 日本黄色日本黄色录像| 日日爽夜夜爽网站| h日本视频在线播放| 黄色毛片三级朝国网站 | 好男人视频免费观看在线| av有码第一页| 美女内射精品一级片tv| 九九在线视频观看精品| 春色校园在线视频观看| 日本黄大片高清| 人妻人人澡人人爽人人| 日本-黄色视频高清免费观看| 性色avwww在线观看| 国产在线免费精品| 99久久综合免费| 看十八女毛片水多多多| 男男h啪啪无遮挡| 性高湖久久久久久久久免费观看| 观看美女的网站| 麻豆成人av视频| 国产视频首页在线观看| 亚洲无线观看免费| 嫩草影院新地址| 十八禁网站网址无遮挡 | 亚洲电影在线观看av| 国产免费一区二区三区四区乱码| 插逼视频在线观看| 老司机亚洲免费影院| 老司机影院毛片| 国模一区二区三区四区视频| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 男人和女人高潮做爰伦理| 精品熟女少妇av免费看| 国产淫片久久久久久久久| 大话2 男鬼变身卡| 国产美女午夜福利| 最新的欧美精品一区二区| 最近2019中文字幕mv第一页| av在线观看视频网站免费| 国产精品99久久99久久久不卡 | 国产男女内射视频| 国产又色又爽无遮挡免| 人人澡人人妻人| 中文资源天堂在线| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 人妻 亚洲 视频| av一本久久久久| 日韩在线高清观看一区二区三区| 色视频在线一区二区三区| 十八禁网站网址无遮挡 | 国产免费福利视频在线观看| 国产 精品1| 交换朋友夫妻互换小说| 日韩一区二区三区影片| 亚洲欧美精品专区久久| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 日韩制服骚丝袜av| 国产一区有黄有色的免费视频| 爱豆传媒免费全集在线观看| 日韩电影二区| 国产日韩一区二区三区精品不卡 | 国产精品.久久久| 大片免费播放器 马上看| 亚洲成人av在线免费| 亚洲欧美清纯卡通| 男的添女的下面高潮视频| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 欧美丝袜亚洲另类| 精品久久久久久久久亚洲| 亚洲国产欧美日韩在线播放 | 观看免费一级毛片| 精品久久国产蜜桃| 免费看不卡的av| 99九九线精品视频在线观看视频| 九草在线视频观看| 国产在视频线精品| 久久热精品热| 国产精品久久久久久精品古装| 国产一区二区在线观看日韩| 涩涩av久久男人的天堂| 黑人高潮一二区| 青春草视频在线免费观看| 七月丁香在线播放| 黄色欧美视频在线观看| 国产精品一区二区在线不卡| 国产成人freesex在线| 卡戴珊不雅视频在线播放| 亚洲中文av在线| 能在线免费看毛片的网站| 久久人妻熟女aⅴ| 黄色视频在线播放观看不卡| 亚洲av中文av极速乱| 韩国高清视频一区二区三区| 亚洲欧洲国产日韩| 日本欧美视频一区| 国产视频首页在线观看| www.av在线官网国产| 卡戴珊不雅视频在线播放| 国产高清不卡午夜福利| 下体分泌物呈黄色| 午夜av观看不卡| 内地一区二区视频在线| 777米奇影视久久| 国产午夜精品一二区理论片| 国产高清有码在线观看视频| 国产黄片美女视频| 热99国产精品久久久久久7| 一级,二级,三级黄色视频| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 美女主播在线视频| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 多毛熟女@视频| 亚洲,欧美,日韩| 国产精品久久久久久av不卡| 亚洲第一区二区三区不卡| 麻豆成人午夜福利视频| 亚洲美女黄色视频免费看| 欧美xxⅹ黑人| 日日爽夜夜爽网站| 亚洲第一区二区三区不卡| 狂野欧美激情性bbbbbb| 在线观看免费高清a一片| 岛国毛片在线播放| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 边亲边吃奶的免费视频| 天堂俺去俺来也www色官网| 国内揄拍国产精品人妻在线| 成人综合一区亚洲| 天堂8中文在线网| .国产精品久久| 成年人午夜在线观看视频| 只有这里有精品99| 乱人伦中国视频| 日本vs欧美在线观看视频 | 亚洲精品自拍成人| 香蕉精品网在线| 99久久精品热视频| 日韩欧美一区视频在线观看 | 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 亚洲人与动物交配视频| 少妇丰满av| 免费少妇av软件| 亚洲国产精品一区三区| 九草在线视频观看| 99九九在线精品视频 | 嘟嘟电影网在线观看| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 美女中出高潮动态图| 久久午夜综合久久蜜桃| 欧美最新免费一区二区三区| 水蜜桃什么品种好| 国产欧美日韩综合在线一区二区 | 精品国产一区二区久久| 欧美97在线视频| 久久影院123| 久久女婷五月综合色啪小说| 乱系列少妇在线播放| 欧美精品一区二区免费开放| 老女人水多毛片| 黑人猛操日本美女一级片| 免费大片黄手机在线观看| av不卡在线播放| 男人舔奶头视频| 免费黄网站久久成人精品| 国产亚洲欧美精品永久| 欧美人与善性xxx| 午夜福利影视在线免费观看| av在线观看视频网站免费| 丝袜在线中文字幕| 亚洲国产欧美在线一区| 久久精品国产亚洲av涩爱| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 久久99精品国语久久久| 乱码一卡2卡4卡精品| 欧美国产精品一级二级三级 | av女优亚洲男人天堂| 日本色播在线视频| 夜夜爽夜夜爽视频| av国产精品久久久久影院| 制服丝袜香蕉在线| 嘟嘟电影网在线观看| 大码成人一级视频| 国产伦在线观看视频一区| 亚洲精品国产av成人精品| 久久99精品国语久久久| 在线观看人妻少妇| 免费大片18禁| 制服丝袜香蕉在线| 如何舔出高潮| 色婷婷av一区二区三区视频| 观看免费一级毛片| 国产亚洲91精品色在线| 国产片特级美女逼逼视频| 久久午夜福利片| 久久人妻熟女aⅴ| 日韩 亚洲 欧美在线| 久久99精品国语久久久| 日韩一区二区三区影片| 国产 一区精品| 自线自在国产av| 各种免费的搞黄视频| a级一级毛片免费在线观看| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| kizo精华| 精品午夜福利在线看| 男女无遮挡免费网站观看| 九色成人免费人妻av| 久久婷婷青草| 国产亚洲最大av| 免费看不卡的av| 色视频在线一区二区三区| 黄色配什么色好看| 成人无遮挡网站| 日本黄大片高清| 久久99热6这里只有精品| 日韩伦理黄色片| 日日啪夜夜爽| 我的女老师完整版在线观看| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 久久久久久伊人网av| 亚洲不卡免费看| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 超碰97精品在线观看| 久久国产乱子免费精品| 熟妇人妻不卡中文字幕| 我的女老师完整版在线观看| 精品久久久噜噜| a级毛片免费高清观看在线播放| 久久毛片免费看一区二区三区| 美女福利国产在线| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 国产深夜福利视频在线观看| 久久久久人妻精品一区果冻| av.在线天堂| 亚洲国产欧美日韩在线播放 | 国产日韩欧美在线精品| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 99久久人妻综合| 成人漫画全彩无遮挡| 国产精品久久久久久久电影| 欧美 日韩 精品 国产| √禁漫天堂资源中文www| 亚洲成人av在线免费| 欧美3d第一页| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 女性生殖器流出的白浆| 亚洲国产精品成人久久小说| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 免费看不卡的av| 六月丁香七月| av网站免费在线观看视频| 麻豆乱淫一区二区| 亚洲欧洲国产日韩| 久久狼人影院| 9色porny在线观看| 国产高清不卡午夜福利| 亚洲国产精品成人久久小说| 国产一区二区三区av在线| 国产日韩欧美亚洲二区| 男女边吃奶边做爰视频| 日本黄色日本黄色录像| 婷婷色综合www| 国产亚洲5aaaaa淫片| 日日啪夜夜爽| a级毛片免费高清观看在线播放| 看免费成人av毛片| 国内精品宾馆在线| a级毛片在线看网站| 香蕉精品网在线| 国产成人免费观看mmmm| 久久婷婷青草| 久久久久久久精品精品| 国产熟女欧美一区二区|