轉(zhuǎn)錄組測序分析氯化鈉對普魯蘭生物合成的影響

張高川，何超永，王崇龍，王大慧*，衛(wèi)功元*

（蘇州大學基礎(chǔ)醫(yī)學與生物科學學院，江蘇 蘇州 215123）

普魯蘭是一種由出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）合成的水溶性直鏈高分子物質(zhì)[1]。作為一種微生物胞外多糖，普魯蘭本身安全無毒，同時具有良好的可塑性、成膜性和穩(wěn)定性，以及耐熱、耐酸堿、耐鹽等特性，因而可以廣泛地應(yīng)用于食品加工、臨床醫(yī)藥、環(huán)境保護和輕工化工等諸多領(lǐng)域[2-4]。美國食品藥品監(jiān)督管理局已經(jīng)將普魯蘭認證為GRAS（Generally Recognized As Safe）微生物多糖，我國也于2006年將普魯蘭列為新增的4 種食品添加劑之一[5]。此后，普魯蘭在市場上的需求量日益增長。

在普魯蘭的發(fā)酵生產(chǎn)中，普魯蘭產(chǎn)量和分子質(zhì)量是兩個重要的過程參數(shù)，前者決定普魯蘭生產(chǎn)的得率和效率，而后者關(guān)系到普魯蘭的應(yīng)用范圍[6]。影響普魯蘭產(chǎn)量和分子質(zhì)量的因素有很多，既包括培養(yǎng)基中各種營養(yǎng)成分及其配比，又涉及生產(chǎn)菌株培養(yǎng)的環(huán)境條件[7-8]。其中，培養(yǎng)基中無機鹽及其含量在普魯蘭的生產(chǎn)中往往具有重要的作用。Badr-Eldin等[9]發(fā)現(xiàn)發(fā)酵培養(yǎng)基中磷酸鹽水平偏低不利于菌體生長，偏高則抑制普魯蘭合成。Reeslev等[10]發(fā)現(xiàn)當培養(yǎng)基中Zn2+濃度高于0.45 μmol/L時，出芽短梗霉的形態(tài)即從酵母狀細胞向菌絲狀轉(zhuǎn)變，普魯蘭的合成隨之受到不利影響[6]。鞠寶等[11]分析了二價陽離子在普魯蘭和黑色素形成中的作用，結(jié)果表明合適的金屬離子種類和濃度抑制了黑色素的形成，促進了普魯蘭的合成。Gao Wa等[12]在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用正交試驗優(yōu)化了培養(yǎng)基中無機鹽含量，提高了普魯蘭產(chǎn)量。與此同時，還發(fā)現(xiàn)影響出芽短梗霉細胞生長的最顯著因素是磷酸氫二鉀，而氯化鈉（NaCl）則是影響普魯蘭合成的最顯著因素[13]。以上結(jié)果均是基于發(fā)酵過程優(yōu)化而得到的，這些研究并沒有對無機鹽影響普魯蘭生物合成的內(nèi)在機制進行深入分析。

在前期優(yōu)化普魯蘭發(fā)酵培養(yǎng)基的研究中，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中NaCl的存在有利于提高普魯蘭產(chǎn)量，但卻顯著降低了普魯蘭的分子質(zhì)量[6]。通過對普魯蘭合成關(guān)鍵酶（α-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶、葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶）的活性、物質(zhì)和能量代謝進行測定，發(fā)現(xiàn)NaCl同時提高了與普魯蘭生物合成和降解相關(guān)酶的活性，增加了能量物質(zhì)ATP的供給，結(jié)果部分揭示了NaCl在提高普魯蘭產(chǎn)量的同時卻降低了普魯蘭分子質(zhì)量的生理機制[14]。盡管如此，NaCl如何在分子水平影響出芽短梗霉胞內(nèi)相關(guān)基因的表達，并體現(xiàn)在普魯蘭的產(chǎn)量和分子質(zhì)量上，這些問題至今仍然不得而知。

轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-Seq）技術(shù)是通過對細胞轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行測序，統(tǒng)計測得的每條序列，獲得每個特定轉(zhuǎn)錄本的表達量，可更加精確地評估細胞表型，加深對細胞代謝的理解，也有助于對目標基因進行改良[15]。近年來，RNA-Seq因檢測動態(tài)范圍寬、數(shù)據(jù)重復性好等優(yōu)勢，逐漸成為研究基因表達差異、新基因挖掘與功能注釋的重要手段[16]。RNA-Seq技術(shù)和生物信息學分析手段已經(jīng)廣泛運用于微生物過程分析中，為深入理解微生物現(xiàn)象中蘊含的分子機制提供了可信的證據(jù)[17-20]。為此，本實驗研究NaCl對出芽短梗霉細胞轉(zhuǎn)錄組的影響，采用生物信息學方法篩選與分析差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs），并對這些DEGs進行注釋與富集分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

出芽短梗霉CCTCC M 2012259，由蘇州大學微生物生理與代謝調(diào)控研究室保藏。

種子培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，自然pH值；發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖50 g/L，酵母粉3 g/L，(NH4)2SO40.6 g/L，K2HPO45 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，pH 3.8，NaCl質(zhì)量濃度根據(jù)具體實驗設(shè)計而定。

所有試劑均為國產(chǎn)分析純，購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Minifors實驗室臺式5 L發(fā)酵罐 瑞士Infors公司；HZ-2010K恒溫搖瓶柜 太倉市華利達實驗儀器設(shè)備有限公司；J6-MI型冷凍離心機 美國Beckman公司；T6新世紀紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；1836稀釋型烏式毛細管黏度計 浙江臺州市椒江玻璃儀器廠；2100生物分析儀 美國安捷倫科技公司；Qubit 2.0熒光分光光度計 美國Invitrogen公司。

1.3 方法

1.3.1 種子培養(yǎng)

將在-70 ℃超低溫冰箱中保藏的菌種（1 mL）接種至50 mL種子培養(yǎng)基中，于30 ℃、200 r/min搖床中培養(yǎng)24 h。

1.3.2 發(fā)酵培養(yǎng)

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：以10%（V/V）的接種量，將種子液接種至裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，在200 r/min搖床中培養(yǎng)72 h，溫度30 ℃。

分批發(fā)酵培養(yǎng)：以10%（V/V）的接種量，將種子液接種至裝有3 L發(fā)酵培養(yǎng)基的5 L發(fā)酵罐中，溫度30 ℃，攪拌轉(zhuǎn)速400 r/min，通氣量3 L/min。pH值采用梅特勒電極在位監(jiān)測，通過自動流加3 mol/L H2SO4或3 mol/L NaOH溶液控制pH值為3.80±0.02。

1.3.3 指標測定

細胞干質(zhì)量和普魯蘭產(chǎn)量的測定方法參見文獻[5]；普魯蘭分子質(zhì)量的測定采用黏度法[6]；葡萄糖質(zhì)量濃度的測定采用3,5-二硝基水楊酸法[21]；分批發(fā)酵過程參數(shù)的計算方法參見文獻[8]。

1.3.4 出芽短梗霉RNA-Seq

1.3.4.1 RNA提取

將分批發(fā)酵培養(yǎng)至36 h的出芽短梗霉細胞8 000 r/min、4 ℃離心10 min，液氮猝滅2 min；利用TRIzol試劑盒提取總RNA。采用Agilent 2100生物分析儀、NanoDrop和1%瓊脂糖凝膠對總RNA進行品質(zhì)和定量分析。選擇1 μg RNA完整值（RNA integrity number，RIN）大于7的總RNA用于后續(xù)文庫制備。

1.3.4.2 cDNA文庫構(gòu)建

根據(jù)NEBNext?UltraTMRNA文庫制備試劑盒的操作步驟進行測序文庫制備。首先使用NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module從總RNA中分離Poly(A) mRNA，然后利用NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer和NEBNext Random Primers對mRNA進行破碎（約300 bp）和引物配對。以此為模板，利用ProtoScript II逆轉(zhuǎn)錄酶合成第1條cDNA鏈，利用Second Strand Synthesis Enzyme Mix合成第2條cDNA鏈。之后用AxyPrep Mag PCR Clean-up純化雙鏈cDNA產(chǎn)物，使用Agilent 2100生物分析儀評估其品質(zhì)，使用Qubit 2.0熒光分光光度計對其進行定量。最后使用End Prep Enzyme Mix修復純化后的雙鏈cDNA產(chǎn)物，添加dA尾巴，并通過T-A連接在其末端添加接頭。

1.3.4.3 RNA-Seq數(shù)據(jù)分析

利用Illumina HiSeqTM2000對上述構(gòu)建的cDNA文庫進行150 bp讀長的雙末端測序，獲得的RNA-Seq數(shù)據(jù)經(jīng)FASTQC（http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/）質(zhì)控分析后，使用Trimmomatic（v0.30）軟件刪除測序質(zhì)量偏低的末端序列片段[22]，處理后的干凈讀段（clean reads）用于后續(xù)分析。將RNA-Seq數(shù)據(jù)上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫，登記號為PRJNA350822（https://dataview.ncbi.nlm.nih.gov/object/PRJNA350822）。

雖然已經(jīng)對出芽短梗霉全基因組進行測序[23]，但缺少完善的注釋信息，所以RNA-Seq數(shù)據(jù)分析采用基于Trinity（v2.6.6）從頭組裝的無參分析流程[24]。利用Trinity軟件對RNA-Seq數(shù)據(jù)進行從頭組裝，利用BLASTX（2.7.1+）程序[25]，將Trinity組裝獲得的所有轉(zhuǎn)錄本與來自UniprotKB數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）的34 084 個真菌已知蛋白進行比對（截止日期2019-05-14），鑒別這些組裝轉(zhuǎn)錄本可能編碼的蛋白（統(tǒng)計期望閾值為1×10-5）。

使用RSEM（v1.3.1）軟件的RSEM-prepare-reference程序，根據(jù)Trinity組裝結(jié)果創(chuàng)建參考轉(zhuǎn)錄組；使用RSEM-calculate-expression工具計算Trinity組裝轉(zhuǎn)錄本在每個樣本中的表達水平；利用RSEM-generate-datamatrix程序，將所有樣本的基因表達數(shù)據(jù)合并為一個數(shù)據(jù)矩陣[26]，用于DEGs分析。

1.3.4.4 DEGs的鑒別

利用R語言包edgeR（v3.20.9）對上述基因表達水平數(shù)據(jù)矩陣進行計算分析[27]，鑒別因培養(yǎng)基中添加NaCl而產(chǎn)生的DEGs。將基因差異表達倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）閾值設(shè)為2 倍，統(tǒng)計顯著性閾值設(shè)為0.05，作為DEGs的篩選標準[28]。對篩選結(jié)果進行可視化分析，繪制火山圖。利用R語言包pheatmap（v1.0）對DEGs進行聚類和可視化分析，用來評估平行樣本的一致性。

1.3.4.5 DEGs的功能注釋與富集分析

利用UniProt Retrieve/ID mapping tool（http://www.uniprot.org/uploadlists）在線工具，從Uniprot數(shù)據(jù)庫中獲取所有DEGs對應(yīng)蛋白質(zhì)的基因本體論（Gene Ontology，GO）注釋信息和序列信息。利用WEGO（http://wego.genomics.org.cn/）對其進行GO注釋的富集分析[29]，使用R語言包ggplot2對富集結(jié)果進行可視化。利用京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome，KEGG）數(shù)據(jù)庫的Blast-KOALA工具（https://www.kegg.jp/blastkoala），分別對上調(diào)和下調(diào)的DEGs進行通路富集分析[30]，并利用KEGG mapper工具對其中的通路模塊進行深入挖掘。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

RNA-Seq設(shè)置2 個平行樣品，其他所有實驗數(shù)據(jù)均來自于3 組平行樣品，應(yīng)用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行t檢驗分析，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaCl對普魯蘭生物合成的影響

在搖瓶發(fā)酵條件下，考察發(fā)酵培養(yǎng)基中NaCl質(zhì)量濃度對出芽短梗霉細胞生長和普魯蘭合成的影響，結(jié)果見圖1。可以看出，與對照（0 g/L NaCl）相比，NaCl的添加提高了普魯蘭產(chǎn)量，但降低了細胞干質(zhì)量和普魯蘭分子質(zhì)量。當NaCl質(zhì)量濃度為3 g/L時，普魯蘭產(chǎn)量達到最大值23.17 g/L，比對照提高了22.9%；而細胞干質(zhì)量和普魯蘭分子質(zhì)量在此質(zhì)量濃度下均處于最低水平，分別比對照降低了12.7%和44.9%。以上結(jié)果表明，培養(yǎng)基中NaCl的存在有利于普魯蘭產(chǎn)量的提高，但不利于將普魯蘭分子質(zhì)量維持在較高的水平。

圖1 NaCl質(zhì)量濃度對普魯蘭生物合成的影響Fig.1 Effect of NaCl at different concentrations on pullulan biosynthesis

2.2 普魯蘭分批發(fā)酵過程參數(shù)比較

在5 L發(fā)酵罐中對出芽短梗霉CCTCC M 2012259進行分批培養(yǎng)，檢測了3 g/L NaCl和對照條件下的葡萄糖消耗、細胞生長和普魯蘭合成情況，結(jié)果見圖2和表1。通過對各個發(fā)酵過程參數(shù)進行比較可以發(fā)現(xiàn)，NaCl加快了葡萄糖的消耗速率，但卻降低了細胞生長的速率。因此，當培養(yǎng)基中含有NaCl時，細胞并沒有將多消耗的葡萄糖用于細胞生長，而是用于普魯蘭的合成，最終細胞干質(zhì)量比對照降低了16.5%，普魯蘭產(chǎn)量卻比對照提高17.6%。需要特別指出的是，在NaCl存在的情況下，普魯蘭最終分子質(zhì)量顯著下降55.8%。綜合表1中分批發(fā)酵其他過程參數(shù)，可以得出結(jié)論，與對照相比，3 g/L NaCl顯著提高了普魯蘭產(chǎn)量，卻同時顯著降低了細胞干質(zhì)量和普魯蘭分子質(zhì)量。以下將采用RNA-Seq技術(shù)和生物信息學分析手段對NaCl影響普魯蘭生物合成的分子機制進行解析。

圖2 不同NaCl質(zhì)量濃度下的普魯蘭分批發(fā)酵過程Fig.2 Time-course curve of pullulan production in batch fermentation at different concentrations of NaCl

表1 普魯蘭分批發(fā)酵過程參數(shù)比較Table 1 Comparison of cell growth and pullulan production in batch fermentation in the presence and absence of NaCl

2.3 RNA-Seq分析

2.3.1 RNA-Seq數(shù)據(jù)分析

對來自0 g/L和3 g/L NaCl培養(yǎng)條件下的出芽短梗霉細胞樣本進行RNA-Seq，共獲得近9 240萬 條讀段（reads），總長度約27.72 G堿基。4 個轉(zhuǎn)錄組樣本的Q30（0.1%堿基識別錯誤率）均在93%左右（表2），表明這些RNA-Seq數(shù)據(jù)具有較高的質(zhì)量，能夠滿足后續(xù)生物信息學分析的要求。通過FASTQC質(zhì)控分析和trimmomatic處理后，使用Trinity（v2.6.6）對這些測序結(jié)果進行從頭組裝，共獲得16 204 個基因和29 523 條轉(zhuǎn)錄本。通過與真菌已知蛋白進行比對，BLASTX程序成功鑒別出其中的16 130 條轉(zhuǎn)錄本。

表2 RNA-Seq數(shù)據(jù)Table 2 Overview of RNA-Seq data for A.pullulans

2.3.2 DEGs分析

利用edgeR對RSEM軟件計算獲得的Trinity組裝轉(zhuǎn)錄本表達水平數(shù)據(jù)矩陣進行篩選，除去低表達基因后，在剩下的14 098 個轉(zhuǎn)錄本中鑒別DEGs。將統(tǒng)計顯著性閾值（P值）設(shè)為0.05，則有659 個DEGs被鑒別出，DEGs分析的火山圖見圖3A，其中227 個DEGs表達水平在NaCl存在時顯著上調(diào)，432 個DEGs表達水平顯著下調(diào)，表明培養(yǎng)基中的NaCl對出芽短梗霉的基因轉(zhuǎn)錄水平產(chǎn)生了顯著影響。利用pheatmap對這些DEGs進行聚類分析（圖3B），結(jié)果顯示，該RNA-Seq數(shù)據(jù)分析結(jié)果可用于后續(xù)的基因功能注釋和代謝通路分析。

圖3 NaCl存在時DEGs分析可視化圖譜Fig.3 Volcano map and heatmap of DEGs in the presence of NaCl

2.3.3 DEGs功能注釋和富集分析

利用WEGO對在NaCl組中表達水平顯著上調(diào)的227 個基因和顯著下調(diào)的432 個基因分別進行GO功能注釋及富集分析，共有169 個上調(diào)基因和360 個下調(diào)基因獲得GO功能注釋信息。利用R語言包ggplot2對富集結(jié)果進行可視化分析，結(jié)果見圖4。可以看出，在NaCl組中顯著上調(diào)的基因，主要富集在初級代謝、氮化合物代謝、生物合成等生物學過程，具有離子綁定、水解酶活性、小分子綁定等分子功能，且大多在胞內(nèi)細胞器尤其是具有膜結(jié)構(gòu)的細胞器中發(fā)揮作用；在NaCl組中顯著下調(diào)的基因，其富集的生物學過程、分子功能和細胞組分均與上調(diào)基因相似。由此可見，培養(yǎng)基中NaCl的存在，影響了細胞中的一些水解酶，以及具有離子和小分子綁定功能的蛋白編碼基因的表達水平，這些均可能與普魯蘭產(chǎn)量和分子質(zhì)量的改變有關(guān)。

圖4 NaCl存在時DEGs的GO功能注釋及富集分析Fig.4 GO functional annotation and enrichment analysis of DEGs in the presence of NaCl

2.3.4 DEGs的KEGG代謝通路分析

使用KEGG的Blast-KOALA工具對NaCl組中表達水平顯著上調(diào)的227 個基因和下調(diào)的432 個基因進行代謝通路分析，分別有109 個上調(diào)基因和224 個下調(diào)基因被KEGG注釋（表3）。結(jié)果表明，上調(diào)基因主要富集于遺傳信息過程、碳水化合物代謝、氨基酸代謝等相關(guān)通路，而下調(diào)基因則主要富集于碳水化合物代謝、遺傳信息過程、信號與細胞過程等相關(guān)通路。在此基礎(chǔ)上，利用KEGG mapper工具對其中的通路模塊進行深入挖掘，發(fā)現(xiàn)分別有58 個上調(diào)基因和112 個下調(diào)基因編碼各類酶（表4），其中，上調(diào)基因編碼的酶參與的代謝通路主要包括次級代謝物生物合成、抗生素生物合成、不同環(huán)境下的微生物代謝、淀粉和蔗糖代謝、糖酵解/糖異生等代謝過程，而下調(diào)基因編碼的酶參與的代謝過程除了上述通路以外，還參與了碳代謝、氨基酸生物合成、丙酮酸代謝、氧化磷酸化等代謝過程。

表3 DEGs的KEGG通路富集分析Table 3 KEGG pathway enrichment analysis of DEGs

表4 DEGs的KEGG通路功能挖掘Table 4 KEGG pathway functional annotation of DEGs

需要特別說明的是，直接參與普魯蘭生物合成的關(guān)鍵酶基因（pgm1、pgm2、ugp、fks）和降解酶基因（amy1）在本研究中均能被注釋到，其表達水平與前期研究[14]中real-time PCR所得到的結(jié)果一致。雖然這些基因的轉(zhuǎn)錄水平在NaCl存在時均有所上調(diào)，但基因FC均小于2，因此不在鑒別出的659 個DEGs范圍之內(nèi)。盡管如此，針對RNA-Seq數(shù)據(jù)的分析結(jié)果，仍然可以為今后出芽短梗霉的遺傳改造提供可信的理論依據(jù)。

3 結(jié) 論

本研究考察NaCl在普魯蘭生物合成中的作用，發(fā)現(xiàn)3 g/L NaCl最有利于普魯蘭的過量合成，但培養(yǎng)基中NaCl的存在顯著降低了普魯蘭的分子質(zhì)量。在分批發(fā)酵的基礎(chǔ)上，采用生物信息學方法對出芽短梗霉RNA-Seq數(shù)據(jù)進行分析，共鑒別出659 個DEGs，其中NaCl組中有227 個基因表達上調(diào)，432 個基因表達下調(diào)。通過對這些DEGs進行GO功能注釋和KEGG通路富集分析，發(fā)現(xiàn)NaCl影響了參與碳水化合物代謝、淀粉和蔗糖代謝、糖酵解/糖異生等代謝過程的基因的表達水平，最終在提高了普魯蘭產(chǎn)量的同時降低了普魯蘭分子質(zhì)量。研究結(jié)果有助于深入理解NaCl在普魯蘭生物合成中的作用機制，同時也為出芽短梗霉遺傳改造以實現(xiàn)高分子質(zhì)量普魯蘭的高效合成提供理論依據(jù)。