“智三針”對Shank3慢病毒干擾的孤獨(dú)癥模型鼠行為學(xué)影響

黃龍生,劉桂華,歐萍,洪鈺,葛品,郭敬民,莊婉玉,王靜蓉,溫曉寒,劉曉冬,康潔

（1.福建省婦幼保健院/福建醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院,福州 350001;2.福建醫(yī)科大學(xué),福州 350108;3.福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)證研究基地,福州 350122）

孤獨(dú)癥譜系障礙（ASD）包括一組以神經(jīng)行為發(fā)育缺陷為核心癥狀的疾病,其特征包括廣泛的社交互動(dòng)障礙,溝通缺陷以及局限的興趣和重復(fù)刻板的行為[1],而對于這些異常行為的有效干預(yù)手段甚少。Shank3突變約占自閉癥譜系障礙特發(fā)性形式的1%,具有Shank3基因突變的患者通常表現(xiàn)出多種共病特征,包括整體發(fā)育遲緩,嚴(yán)重的睡眠障礙,語言缺乏或嚴(yán)重的語言延遲以及自閉癥譜系障礙的特征（例如社會(huì)障礙和刻板印象）[2]。Shank3是一種突觸后蛋白,其在基因水平上的破壞被認(rèn)為是22q13缺失綜合征（Phelan-McDermid綜合征）和其他非綜合征性ASD發(fā)生的原因。小鼠模型中Shank3基因的破壞導(dǎo)致孤獨(dú)癥樣行為,包括自我傷害、運(yùn)動(dòng)困難、焦慮水平增加、社交互動(dòng)缺陷和重復(fù)性行為[3-6]。近年來臨床使用“智三針”治療兒童自閉癥的研究取得了滿意的效果,“智三針”可以提高注意力,刺激部位位居大腦額葉,又是情感智力調(diào)控所在,因此針刺“智三針”能治療情感、智能障礙疾病,有醒神開竅之功效[7-9]。本項(xiàng)目以 Shank3慢病毒干擾建立ASD模型鼠,研究針刺對ASD鼠行為學(xué)的改變,有助于解釋針刺對ASD患者的臨床療效機(jī)制及病理機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)Wistar孕鼠8只,體質(zhì)量230～250 g,其中用于Shank3干擾慢病毒孕鼠6只,用于注射空載慢病毒孕鼠 2只,購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司[SCXK（滬）2017-0005]。動(dòng)物飼養(yǎng)于福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,動(dòng)物飼養(yǎng)在可調(diào)控環(huán)境中[充足的食物和水,溫度（21±1） ℃,濕度60%,7:00AM―7:00PM開燈]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)符合國家醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理標(biāo)準(zhǔn),本實(shí)驗(yàn)已經(jīng)獲得福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 造模與分組

1.2.1 側(cè)腦室Shank3慢病毒感染

參照參考文獻(xiàn)[10-11]進(jìn)行胚胎鼠側(cè)腦室慢病毒注射,Shank3慢病毒組,將混合有熒光劑的Shank3干擾慢病毒通過毛細(xì)玻璃針注射到胚胎日第 15.5天的胚胎鼠右側(cè)側(cè)腦室,劑量為每只 1 μL;空載病毒組,將混合有熒光劑的空載慢病毒參照慢病毒組進(jìn)行干預(yù)。根據(jù)大鼠腦立體定位圖譜,選取注射進(jìn)針點(diǎn)和進(jìn)針深度為前囟向后1 mm,矢狀縫向右 1.5 mm,垂直進(jìn)針 3 mm。于出生后第 1天,將仔鼠置于熒光顯微鏡下觀察到側(cè)腦室熒光表達(dá)。詳見圖1。

圖1 Shank3慢病毒側(cè)腦室注射

1.2.2 分組

Shank3慢病毒干擾Wistar孕鼠,出生后仔鼠隨機(jī)分為模型組、針刺組及假針刺組;空載慢病毒干擾Wistar孕鼠,出生后仔鼠為對照組;以上4組,每組10只進(jìn)行行為學(xué)檢測。實(shí)驗(yàn)流程圖見圖2。

圖2 實(shí)驗(yàn)操作流程圖

1.3 干預(yù)方法

針刺組,根據(jù)《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》取“智三針”穴位,神庭穴（GV24,前正中線上,雙側(cè)目內(nèi)呲連線直上 0.5寸）,雙側(cè)本神穴（GB13,雙側(cè)頭維與神庭連線的內(nèi) 2/3與外1/3的交點(diǎn)處,神庭旁開3寸）。詳見圖3。采用0.25 mm×13 mm華佗牌一次性不銹鋼毫針,針刺深度約1 mm,共留針40 min,每穴每間隔10 min予手法刺激（快速捻轉(zhuǎn)10次）,每日1次,持續(xù)14 d。

圖3 針刺穴位圖

假針刺組,取右脅下固定非經(jīng)非穴點(diǎn)[12]（此處具體指髂后上棘上2 cm,脊柱旁開5 cm處）。假針刺組針刺方法與針刺組相同。

模型組和空載對照組給予同等條件下飼養(yǎng),每日正常抓取。

1.4 主要試劑及儀器

Shank3干擾慢病毒（GeneID59312,基因大小5223kb,病毒滴度1.0E＋8,GFP熒光標(biāo)記）和空載體元件pLKD-CMV-eGFP-U6-shRNA（編號(hào)GL404）購自上海和元生物技術(shù)股份有限公司;曠場實(shí)驗(yàn)設(shè)備、Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)設(shè)備、三箱實(shí)驗(yàn)設(shè)備、攝像記錄系統(tǒng)和動(dòng)物行為分析軟件購自TopScanLite（CleveSys.,lnc）;一次性針灸針具購自蘇州華佗醫(yī)療器械有限公司（0.25 mm×13 mm）。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 體質(zhì)量

各組仔鼠分別在P7（出生后7）、P14、P21日齡稱重,每次測量重復(fù) 3次,取平均值,并對各時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行體質(zhì)量分析。

1.5.2 負(fù)向趨地反應(yīng)檢測

將各組仔鼠于P8―P12日齡沿30°斜面向下放置,頭部朝向接近底部的一側(cè),在實(shí)驗(yàn)溫度的環(huán)境中測試其負(fù)向地性。人工計(jì)算仔鼠整體身體轉(zhuǎn)動(dòng) 180°具有向上爬趨勢所花費(fèi)的時(shí)間,每次試驗(yàn)最長為60 s,超過時(shí)間未完成轉(zhuǎn)向則15 min后重新測試[13]。負(fù)向趨地反應(yīng)通過檢測仔鼠在斜坡上轉(zhuǎn)身 180°所用時(shí)間長短的不同,來體現(xiàn)各組仔鼠前庭運(yùn)動(dòng)功能以及感覺機(jī)能的發(fā)育狀況差異。

1.5.3 游泳

將P9、P11和P13日齡仔鼠依次逐個(gè)單獨(dú)放入恒溫水槽（28 ℃）中,觀察5～10 s,據(jù)仔鼠頭頂、鼻子及耳部與水位線關(guān)系進(jìn)行分值評定,得分越髙說明游泳行為能力越強(qiáng),游泳能力的高低代表子鼠運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力。評定標(biāo)準(zhǔn)為0分,頭頂沒于水位線上;1分,鼻子沒于水位線下;2分,鼻子大部分處于水位線或平齊;3分,水位線在耳朵中間;4分,水位線在耳朵以下。

1.5.4 曠場實(shí)驗(yàn)

曠場實(shí)驗(yàn)廣泛用于嚙齒類動(dòng)物行為研究,尤其在評價(jià)動(dòng)物焦慮情緒引起的行為改變方面,是藥理和腦功能疾病研究常用的行為學(xué)方法[14]。參照文獻(xiàn)[5]進(jìn)行曠場實(shí)驗(yàn)。將 P37日齡各組仔鼠置于 100 cm×100 cm×100 cm的敞箱中,自由探索5 min,箱子的四周和底部均是黑色不透明的（圖 4）,使用跟蹤軟件TopScanLite對其位置進(jìn)行持續(xù)錄像監(jiān)測。整個(gè)曠場箱底部被劃分為周邊區(qū)域和中心區(qū)域,面積比為 16:9。通過分析軟件系統(tǒng)自動(dòng)采集行走距離、周邊地區(qū)逗留時(shí)間、中心地區(qū)逗留時(shí)間、平均速度和周邊區(qū)域進(jìn)入中心區(qū)域的次數(shù)。每次測試后,曠場箱用70%的乙醇清洗,兩次測試間隔至少5 min,使乙醇蒸發(fā)和氣味消散。

圖4 曠場實(shí)驗(yàn)

1.5.5 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

參照文獻(xiàn)[15],Morris迷宮的直徑為160 cm,迷宮內(nèi)部被漆成黑色。目標(biāo)圓形平臺(tái)直徑10 cm,淹沒于水面以下1～2 cm處。實(shí)驗(yàn)前1 d,每只動(dòng)物在水迷宮中經(jīng)歷1 min的適應(yīng)期。水迷宮實(shí)驗(yàn)包含兩階段實(shí)驗(yàn),定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)。在定位航行實(shí)驗(yàn)中,每日對每只動(dòng)物進(jìn)行4次測試,連續(xù)5 d。動(dòng)物行為分析軟件將迷宮分割成4個(gè)象限,并在迷宮外部做好相應(yīng)標(biāo)記,東（E）、西（W）、南（S）、北（N）、西北（NW）、東南（SE）。在每次實(shí)驗(yàn)中,動(dòng)物按照以下順序面對泳池壁放入迷宮,第 1天,N-E-SE-NW;第 2天,SE-N-NW-E;第 3天,NW-SE-E-N;第 4天,E-NW-N-SE;第 5天,N-SE-E-NW。尋航時(shí)間設(shè)置為60 s,每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),若動(dòng)物找到目標(biāo)平臺(tái),令其在目標(biāo)平臺(tái)上停留3 s。若60 s內(nèi),動(dòng)物沒有找到平臺(tái),將其引導(dǎo)到平臺(tái)上停留15 s。最后,記錄各大鼠尋找平臺(tái)的平均潛伏期、在目標(biāo)平臺(tái)區(qū)域所花費(fèi)的時(shí)間、總游泳距離和平均速度。數(shù)據(jù)采集5 d后,于第 6天取下目標(biāo)平臺(tái)進(jìn)行第二階段空間探索實(shí)驗(yàn),動(dòng)物放入迷宮的起始位置為目標(biāo)平臺(tái)象限的對側(cè)象限,每只動(dòng)物在迷宮中測試1次,時(shí)間為60 s。記錄動(dòng)物在目標(biāo)象限內(nèi)的平均時(shí)間、穿過平臺(tái)的平均次數(shù)和游泳總距離。

1.5.6 三箱社交實(shí)驗(yàn)

社會(huì)交往缺陷是人類孤獨(dú)癥最可識(shí)別的核心表現(xiàn)。采用三箱實(shí)驗(yàn)以探究動(dòng)物是否有社交互動(dòng)以及是否具有辨別社交新穎性的能力。在 60 cm×40 cm×22 cm的儀器中測試社交行為,由兩道橫隔隔成三室,橫隔中間是可伸縮的門以允許動(dòng)物從中間室進(jìn)入兩側(cè)室（圖5a）。在測試前一天,被測試的大鼠和陌生鼠都在三箱內(nèi)適應(yīng) 15 min。三箱社交行為測試包括兩個(gè)階段,每一階段持續(xù) 10 min。每只動(dòng)物均從中央室放入,可以自由出入左右側(cè)室。兩側(cè)室的角落各放置一個(gè)倒扣的空鐵絲網(wǎng)杯,在三箱中呈對角位置放置。階段a（圖5b）,相同日齡和性別的陌生鼠 1（stranger1）放置一個(gè)杯子內(nèi),另外一個(gè)杯子放置物品1（object1）。階段b（圖5c）,用陌生鼠2（stranger2）替換物品1,陌生鼠1保持不變,并記錄它們接觸陌生鼠或物品的時(shí)間。在下一只動(dòng)物測試之前先用 75%的乙醇和水清洗儀器,兩次測試之間間隔5 min。

圖5 三箱實(shí)驗(yàn)

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 8統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及制圖。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析,組間比較采用Tukey’s檢驗(yàn);重復(fù)測量資料比較采用重復(fù)測量方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 Shank3慢病毒干擾對各組仔鼠體質(zhì)量的影響

各組仔鼠在P7、P21的體質(zhì)量比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)學(xué)意義（P＞0.05）;假針刺組在P14日齡體質(zhì)量較其他3組低（P＜0.05）。詳見表1。

表1 各組仔鼠體質(zhì)量數(shù)據(jù) （±s,g）

表1 各組仔鼠體質(zhì)量數(shù)據(jù) （±s,g）

注:與假針刺組比較1）P＜0.05

組別 n P7 P14 P21對照組 10 15.63±0.99 34.18±1.361） 46.28±1.89模型組 10 16.06±2.78 32.44±2.441） 46.62±5.09針刺組 10 16.41±0.51 32.30±1.961） 46.83±2.89假針刺組 10 15.69±1.69 30.86±2.34 44.51±4.54 F - 0.44 4.30 0.77 P - 0.72 0.01 0.51

2.2 Shank3慢病毒干擾對各組仔鼠負(fù)向趨地反應(yīng)的影響

經(jīng) Shank3慢病毒干擾后各組仔鼠表現(xiàn)出與空載對照組相似的重定向時(shí)間。由圖5可見,從P8到P12,隨著日齡的增大,各組仔鼠轉(zhuǎn)身的時(shí)間明顯縮短（F＝21.68,P＜0.01）,各組仔鼠轉(zhuǎn)身重新定向的時(shí)間比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝1.55,P＞0.05）。時(shí)間與組別無交互作用（F＝1.55,P＝0.11）。

圖6 各組仔鼠負(fù)向趨地反應(yīng)時(shí)間比較

2.3 Shank3慢病毒干擾對各組仔鼠運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力的影響

在游泳實(shí)驗(yàn)中,所有的仔鼠四肢、尾巴活動(dòng)正常。由圖7可見,模型組P11日齡游泳分值較其他3組分值更高（P＜0.01）;在P9和P13日齡,各組仔鼠比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）,說明各組幼鼠運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力相當(dāng),Shank3慢病毒干擾后,仔鼠并未表現(xiàn)運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)障礙。

圖7 各組仔鼠游泳分值統(tǒng)計(jì)圖

2.4 針刺對Shank3慢病毒干擾模型鼠焦慮和空間探索行為的影響

模型組和假針刺組在運(yùn)動(dòng)總距離低于對照組（P＜0.05）。模型組大鼠更多活動(dòng)于曠場的周圍和角落,更多的反復(fù)攀爬于墻壁,表現(xiàn)出一定的焦慮性行為。模型組在探索行為（中間區(qū)域的探索頻次及逗留時(shí)間）比對照組明顯減少（P＜0.01,圖 8b和 8c）,說明 P37日齡Shank3模型鼠出現(xiàn)了運(yùn)動(dòng)減少,焦慮樣行為和空間探索行為的缺乏。經(jīng)過14 d針刺干預(yù)后的Shank3模型鼠雖然未表現(xiàn)出更多中間探索頻次（P＞0.05,圖 8c）,但其中間逗留時(shí)間較模型組和假針刺組增加（P＜0.05,圖8b）,說明針刺提高了Shank3模型鼠的探索能力,增強(qiáng)了其水平活動(dòng)能力,表現(xiàn)出更好的趨軸性。

圖8 針刺對Shank3模型鼠焦慮及空間探索行為的影響

2.5 針刺對Shank3慢病毒干擾模型鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

在定位航行階段,4組仔鼠探索平臺(tái)的潛伏期和平均總距離均持續(xù)穩(wěn)定下降（F＝72.2,P＜0.01;F＝40.78,P＜0.01）,說明在學(xué)習(xí)尋找平臺(tái)的過程中,各組仔鼠記憶能力和運(yùn)動(dòng)能力均得到增強(qiáng)。模型組探索平臺(tái)的潛伏期和平均距離多于對照組和針刺組（F＝72.20,P＜0.01,圖9a和9b）。探索平臺(tái)潛伏期時(shí)間與組別無交互作用（F＝1.45,P＝0.13）,探索平臺(tái)平均距離與組別無交互作用（F＝1.70,P＝0.05）。模型組和假針刺組鼠進(jìn)入目標(biāo)象限的探索時(shí)間明顯少于對照組和針刺組（P＜0.05,圖9c）。盡管針刺組和模型組在相同時(shí)間的游泳距離相似（圖 9d）,然而針刺組穿越目標(biāo)平臺(tái)的頻次仍多于模型組和假針刺組（P＜0.05,圖 9e）。由圖10可見,在第1天時(shí),各組仔鼠多巡航于迷宮壁周圍;在第 5天時(shí),對照組與針刺組探索路線更清晰,而模型組與假針刺組路線顯示雜亂和復(fù)雜;在第6天時(shí),對照組和針刺組更多巡航于目標(biāo)平臺(tái)和目標(biāo)象限區(qū)域,而模型組與假針刺組仍顯示巡航于放入迷宮的起始位置和迷宮壁周圍。

圖9 針刺對Shank3模型鼠尋找平臺(tái)潛伏期及空間探索能力的影響

圖10 各組水迷宮游泳軌跡圖

2.6 針刺對Shank3慢病毒干擾模型鼠社會(huì)交往行為的影響

由圖11a可見,Shank3鼠存在一定的社交互動(dòng)缺陷。在階段a中,Shank3模型組和假針刺組探索物品（物體1）或互動(dòng)社交伙伴（陌生鼠1）的時(shí)間比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。針刺組用于社交伙伴互動(dòng)（陌生鼠 1）的時(shí)間多于探索物品（P＜0.05）,但其主動(dòng)社交功能要低于對照組（P＜0.01）。說明Shank3鼠的社交互動(dòng)功能出現(xiàn)了失調(diào),而針刺干預(yù)促進(jìn)了社交互動(dòng)功能的恢復(fù)。

在階段b中（圖11b）,采用新動(dòng)物（陌生鼠2）替換了在階段a中放置物品的籠子里,Shank3模型鼠在中間室的角落逗留了較多的時(shí)間,并未表現(xiàn)出對新動(dòng)物（陌生鼠 2）的偏愛（P＞0.05）,假針刺組的表現(xiàn)與模型組相似。而針刺組對新舊動(dòng)物的社交偏愛并未表現(xiàn)出差異（P＞0.05）,說明其社交新穎性的紊亂仍未得到改善。而對照組則表現(xiàn)出正常的社交互動(dòng)活動(dòng),相比舊動(dòng)物（陌生鼠1）,其對新動(dòng)物（陌生鼠2）表現(xiàn)出更多的偏好（P＜0.01）。

圖11 針刺對Shank3慢病毒干擾模型鼠社會(huì)交往行為的影響

在階段a中,各組仔鼠與物品的接觸時(shí)間比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。而在階段b中,各組仔鼠與陌生鼠 2的接觸時(shí)間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;對照組和針刺組接觸新動(dòng)物（陌生鼠 2）的時(shí)間明顯多于模型組和假針刺組（P＜0.05）,說明針刺促進(jìn)了Shank3模型鼠主動(dòng)社交功能。

3 討論

在 DSM-5（精神疾病診斷和統(tǒng)計(jì)手冊,第五版）[16]中的ASD診斷的定義是社會(huì)溝通和社會(huì)互動(dòng)的缺陷和狹隘興趣,重復(fù)刻板的行為。這些癥狀開始于兒童早期,并影響其的日常生活活動(dòng)。盡管在對ASD遺傳學(xué)的理解方面取得了最新進(jìn)展,但與這些障礙有關(guān)的潛在神經(jīng)生物學(xué)標(biāo)志物和神經(jīng)回路仍然未知。Shank3基因已成為人們研究ASD的熱點(diǎn),Shank3突變在ASD患者的基因篩查中被發(fā)現(xiàn),Shank3在神經(jīng)生長及突觸可塑性中起重要作用,并且可能與學(xué)習(xí)記憶能力有關(guān),Shank3的破壞可能是導(dǎo)致ASD核心表型的原因[17-18]。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為孤獨(dú)癥譜系障礙是腦髓不足或失養(yǎng)所致,而經(jīng)絡(luò)是人體運(yùn)行全身氣血,聯(lián)絡(luò)臟腑形體官竅、溝通上下內(nèi)外的通道,與腦的聯(lián)系密切相關(guān)[19]。針刺特別是“靳三針”在臨床上已廣泛用于改善ASD的核心癥狀[20-21]。“智三針”屬于“靳三針”,智三針”位居額葉[21],該部位正與社會(huì)認(rèn)知及情緒調(diào)節(jié)密切相關(guān)[22],可能通過對大腦皮質(zhì)相應(yīng)功能區(qū)域的刺激改善ASD行為。研究[23]表明,ASD患者大腦皮質(zhì)額葉和顳葉存在局部血流灌注或/和細(xì)胞功能障礙,以左側(cè)額葉最明顯;而 Yuan Q等[8,24]通過單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描（SPECT）發(fā)現(xiàn),靳三針能改善ASD患者額葉、顳葉、頂葉局部血流,對提高ASD患者的語言交流、視覺、感知覺及動(dòng)作技能方面有較好的療效。Zhou Y等[25]發(fā)現(xiàn)Shank3變異獼猴孤獨(dú)癥模型表現(xiàn)的運(yùn)動(dòng)缺陷、重復(fù)刻板行為以及社交和學(xué)習(xí)記憶障礙行為,與前額葉區(qū)域、運(yùn)動(dòng)區(qū)域的功能障礙及信號(hào)傳導(dǎo)的低連通性密切相關(guān)。因此,筆者以Shank3基因干擾建立ASD動(dòng)物模型,通過“智三針”針刺Shank3孤獨(dú)癥模型鼠額葉區(qū)域,以及進(jìn)行主動(dòng)探索、學(xué)習(xí)記憶、社會(huì)交往等行為學(xué)實(shí)驗(yàn)觀察,可較真實(shí)的模擬“智三針”改善 ASD臨床核心癥狀的實(shí)際情況。

慢病毒干擾作為神經(jīng)系統(tǒng)疾病良好的攜帶基因工具,具有病毒轉(zhuǎn)染效率高,獲得病毒周期短、滴度高的優(yōu)點(diǎn),可實(shí)現(xiàn)在注射點(diǎn)的長期穩(wěn)定表達(dá)[26]。利用慢病毒干擾建立的精神疾病模型,利于筆者研究針灸治療精神類疾病的療效機(jī)制。本研究采用大腦立體定向注射技術(shù)進(jìn)行Shank3基因表達(dá)干擾,建立起了具有社會(huì)交往及學(xué)習(xí)記憶障礙的 ASD大鼠模型,為實(shí)驗(yàn)的研究奠定了基礎(chǔ)。此外,筆者的結(jié)果顯示Shank3模型鼠與對照組體質(zhì)量增長及體格外觀表現(xiàn)并未顯示差異。在負(fù)向趨地性檢測及游泳實(shí)驗(yàn)中,各組Shank3幼鼠的前庭運(yùn)動(dòng)功能、重力感覺機(jī)能及運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)發(fā)育并未落后于對照組,因此體格生長發(fā)育并非導(dǎo)致Shank3鼠行為活動(dòng)異常的主要因素。

曠場實(shí)驗(yàn)廣泛用于嚙齒類動(dòng)物行為研究,尤其在評價(jià)動(dòng)物焦慮情緒引起的行為改變方面更加突出,是許多藥理研究和腦功能疾病研究常用的行為學(xué)方法[14]。本實(shí)驗(yàn)對Shank3模型鼠進(jìn)行“智三針”針刺干預(yù)后,以曠場實(shí)驗(yàn)評估大鼠的水平活動(dòng)度、探索行為和好奇程度。與對照組比較,模型鼠表現(xiàn)活動(dòng)總距離少、中心探索時(shí)間及次數(shù)少,表現(xiàn)更多的反復(fù)站立,攀爬場壁,顯示焦慮樣行為。針刺組則顯示探索行為和焦慮樣行為的改善,主要為總活動(dòng)距離增加,曠場中心區(qū)域逗留時(shí)間增長,探索時(shí)間增多,場壁折返跑動(dòng)和反復(fù)攀爬行為減少。假針刺組則顯示出與模型組相似的活動(dòng)表現(xiàn)。筆者在曠場實(shí)驗(yàn)所顯示的 Shank3模型鼠總活動(dòng)度減低,探索活動(dòng)減少,可能也是導(dǎo)致三箱實(shí)驗(yàn)中社交互動(dòng)活動(dòng)的減低的因素之一。

在水迷宮中,連續(xù)5 d的定位航行促使模型鼠運(yùn)動(dòng)能力和學(xué)習(xí)記憶能力提高,但其尋找目標(biāo)平臺(tái)的時(shí)間和距離均較對照組和針刺組更長,空間探索能力及學(xué)習(xí)記憶能力較對照組差。在第 6天的空間探索階段,模型鼠于記憶平臺(tái)象限尋找平臺(tái)的時(shí)間和穿越平臺(tái)區(qū)域的次數(shù)均明顯偏少,筆者觀察到其更多盤旋于放入水迷宮的起始位置（目標(biāo)平臺(tái)的對角象限）、攀爬及往返巡回于迷宮周圍場壁。而針刺組大鼠尋找目標(biāo)平臺(tái)的潛伏期、距離和游泳軌跡則更接近對照組,尋找目標(biāo)平臺(tái)的活動(dòng)軌跡更具針對性,更多巡回于目標(biāo)平臺(tái)象限及平臺(tái)區(qū)域。這與臨床觀察到的“智三針”提高ASD患者理解力、注意力及學(xué)習(xí)記憶水平似乎一致,而假針刺組學(xué)習(xí)記憶未見明顯改善,顯示更多的盲目探索。

ASD核心癥狀之一是社交行為互動(dòng)障礙。因此,筆者使用經(jīng)典的三箱實(shí)驗(yàn)來探索主動(dòng)的社交互動(dòng)[5-6,27]。經(jīng)過14 d的針刺治療,三箱實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Shank3模型鼠顯示接觸動(dòng)物的社交時(shí)長及對新動(dòng)物的社交興趣均較低,顯示出其主動(dòng)社會(huì)交往及辨別社交新穎性能力的缺失。針刺干預(yù)后的Shank3模型鼠,與陌生鼠的接觸交往時(shí)間更長,對物品顯示較低的興趣,主要以更長時(shí)間的嗅觸、圍繞和攀爬陌生鼠所處的網(wǎng)杯為行為表現(xiàn)。既往相關(guān)研究[5,28]顯示Shank3模型鼠的異常行為學(xué)表現(xiàn)包括重復(fù)行為動(dòng)作的增加、社會(huì)交往行為的缺乏和類似焦慮癥狀的出現(xiàn),這些癥狀與人類 ASD的臨床癥狀相似,與本研究結(jié)果所顯示的癥狀表型相符。

“智三針”對ASD行為改善的作用機(jī)制可能與對額葉區(qū)域刺激相關(guān)。大量研究顯示,ASD額葉皮質(zhì)中Shank3低表達(dá)[29],BDNF-Akt-Bcl2抗凋亡信號(hào)通路受損[30],Ras/Raf/ERK1/2信號(hào)活動(dòng)增強(qiáng)[31]等。頭針治療ASD研究[32]顯示,頭針可促進(jìn)ASD大鼠額葉Bcl-2表達(dá),抑制Bax、Ras、MEK1/2、p-ERK1/2表達(dá),降低細(xì)胞凋亡。頭針還可能通過調(diào)控額葉皮層相關(guān)激素水平,如催產(chǎn)素、5-HT、GABA等[33-35],進(jìn)而影響行為學(xué)的改變。因此本實(shí)驗(yàn)結(jié)果所顯示針刺對 Shank3孤獨(dú)癥模型鼠行為學(xué)的改變,是否與Shank3相關(guān)信號(hào)通路或蛋白表達(dá)的改變有關(guān),相關(guān)的作用機(jī)制值得進(jìn)一步深入研究。此外,本研究所深入探討的針刺對動(dòng)物行為學(xué)的影響,將為進(jìn)一步的分子生物學(xué)機(jī)制研究提供前期基礎(chǔ),為中醫(yī)學(xué)“靳三針”改善ASD患者核心癥狀提供理論參考。