Listr1遺傳位點(diǎn)對小鼠非酒精性脂肪性肝病易感性的影響

吳靈霞，韓雪，高康寧，祁贊梅

（中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，沈陽 110122）

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是慢性肝病（如肝癌和肝硬化）常見的原因，包括單純性脂肪肝和非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH），后者伴有不同程度的纖維化［1］。固有免疫反應(yīng)的活化及肝內(nèi)炎癥對NAFLD的病理機(jī)制具有重大影響，并且導(dǎo)致單純性脂肪肝進(jìn)展為NASH［2-4］。巨噬細(xì)胞是固有免疫的關(guān)鍵細(xì)胞組分，肝臟內(nèi)巨噬細(xì)胞包括枯否細(xì)胞和單核來源巨噬細(xì)胞。研究［4-7］表明，枯否細(xì)胞最早對肝細(xì)胞損傷作出反應(yīng)。肝內(nèi)巨噬細(xì)胞分泌炎癥介質(zhì)如白細(xì)胞介素（interleukine，IL）-1β和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），刺激肝細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞誘導(dǎo)肝脂肪變性和纖維化；同時(shí)，研究［8-9］發(fā)現(xiàn)去除枯否細(xì)胞或者體內(nèi)單核細(xì)胞顯著抑制NAFLD的進(jìn)展。

此前的研究［10-11］提示Listr1遺傳位點(diǎn)可能通過影響穩(wěn)態(tài)下肝內(nèi)巨噬細(xì)胞亞群數(shù)量調(diào)控小鼠肝內(nèi)天然抗感染免疫，由于肝內(nèi)巨噬細(xì)胞在NAFLD的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，因此推測Listr1遺傳位點(diǎn)可能控制小鼠對NAFLD的易感性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

C.B6By-Listr1是以BALB/c小鼠為基因的背景鼠，通過雜交和回交方式引入C57BL/6小鼠的Listr1等位基因而得到的同系類小鼠，由美國麻省大學(xué)醫(yī)學(xué)院Victor Boyartchuk實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送。C.B6By-Listr1實(shí)驗(yàn)組及BALB/c對照組小鼠為6～8周齡、雄性。通過喂養(yǎng)小鼠45%的高脂高糖飲食誘導(dǎo)NAFLD模型［12］，高脂飼料購自北京華阜康生物技術(shù)有限公司［飼料編號(hào)：H10045，許可證號(hào)：SCXK（京）2014-2008］。果糖添加于飲用水中（終濃度為42.0 g/L）。

1.2 檢測小鼠各項(xiàng)生理指標(biāo)

每周稱量小鼠體質(zhì)量，監(jiān)測并分析體質(zhì)量變化情況。于第4、8、12、16、20周取小鼠眼球靜脈血，檢測丙谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT），動(dòng)態(tài)監(jiān)測小鼠肝功能變化。

1.3 肝臟病理檢查

喂養(yǎng)高脂高果糖飲食4、8、12、16、20周后，脫頸處死小鼠，通過門靜脈灌流30 mL PBS，取肝臟放入4%多聚甲醛中固定，常規(guī)制備石蠟切片進(jìn)行HE染色及天狼猩紅染色，觀測肝內(nèi)脂肪變性、氣球樣變性及纖維化程度?？咕奘杉?xì)胞半乳糖特異性凝集素（macrophage galactose specific lectin，Mac-2）抗體免疫組化染色，觀察巨噬細(xì)胞活化。肝臟組織進(jìn)行OCT包埋，冰凍切片后進(jìn)行油紅O染色，觀察肝臟脂肪變性。圖像用ImageJ軟件定量分析。

1.4 實(shí)時(shí)PCR檢測肝內(nèi)細(xì)胞因子及趨化因子表達(dá)水平

取少量肝臟組織，使用TRIzol試劑提取總RNA，按PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明書進(jìn)行擴(kuò)增（美國 Applied Biosystems Quant Studio公司），檢測小鼠肝臟單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）、IL-1β、TNF-α和IL-6mRNA表達(dá)水平。β-actin作為內(nèi)參基因，引物序列見表1。

表1 引物序列 Tab.1 Sequences of the primers

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Graphad Prism統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，組間比較采用配對樣本t檢驗(yàn)，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 C57BL/6來源的Listr1遺傳位點(diǎn)抑制高脂高糖飲食誘導(dǎo)的肝脂肪變性

C.B6By-Listr1小鼠體質(zhì)量明顯低于BALB/c小鼠（圖1A），同時(shí)其肝臟質(zhì)量也低于BALB/c小鼠，第8周和12周差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，C.B6By-Listr1小鼠 和 BALB/c小鼠第8和12周具體肝臟質(zhì)量分別為（1.723±0.109）g vs（2.185±0.082）g，（1.914±0.06）g vs（2.253±0.116）g（圖1B）。隨著高脂高糖飲食喂養(yǎng)時(shí)間的延長，C.B6By-Listr1和BALB/c小鼠的肝臟結(jié)構(gòu)紊亂進(jìn)行性加重（圖1C），第4周和第8周小鼠肝臟病理顯示輕微的氣球樣變，第12周小鼠肝臟出現(xiàn)脂肪樣變性且逐漸加重。油紅O染色評估肝臟脂肪變性發(fā)現(xiàn)C.B6By-Listr1小鼠脂肪變性程度低于BALB/c小鼠（圖1D），第4、8和20周差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1E）。因此，推斷C57BL/6來源的Listr1遺傳位點(diǎn)有抑制飲食誘導(dǎo)肝脂肪變性的作用。

圖1 Listr1遺傳位點(diǎn)對飲食誘導(dǎo)的肝脂肪變性的影響Fig.1 Impact of the Listr1 gene locus on diet-induced hepatic steatosis

2.2 C57BL/6來源的Listr1遺傳位點(diǎn)減輕高脂高糖飲食誘導(dǎo)的肝炎

慢性肝損傷通常誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞活化以及細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)。在疾病早期，2種小鼠炎癥因子表達(dá)水平無明顯差異，但是12周后C.B6By-Listr1小鼠肝內(nèi)IL-1β、MCP-1和TNF-αmRNA表達(dá)水平明顯低于BALB/c小鼠（圖2A～2C，表2）。高脂高糖飲食誘導(dǎo)20周，C.B6By-Listr1小鼠肝內(nèi)IL-6表達(dá)水平明顯低于BALB/c小鼠（0.139±0.017 vs 0.837±0.167），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2D）。Mac-2是一種巨噬細(xì)胞活化標(biāo)志［13］。第16周和第20周C.B6By-Listr1小鼠巨噬細(xì)胞活化少于BALB/c小鼠（分別為0.603±0.086 vs 1.667±0.471；0.833±0.236 vs 3±0.816）（圖2E、2F）。以上結(jié)果表明C.B6By-Listr1小鼠肝內(nèi)炎癥更輕，C57BL/6來源的Listr1遺傳位點(diǎn)可能抑制飲食誘導(dǎo)的肝炎的形成。

表2 實(shí)時(shí)PCR檢測不同時(shí)間IL-1β、MCP-1、TNF-α mRNA表達(dá)結(jié)果Tab.2 mRNA expression of IL-1β，MCP-1，and TNF-α at different time points as determined by RT-qPCR

圖2 Listr1遺傳位點(diǎn)對飲食誘導(dǎo)的肝炎的影響Fig.2 Impact of the Listr1 gene locus on diet-induced hepatic inflammation

2.3 C57BL/6來源的Listr1遺傳位點(diǎn)緩解高脂高糖飲食誘導(dǎo)的肝纖維化

對不同時(shí)期肝臟切片進(jìn)行天狼星紅染色，結(jié)果顯示，誘導(dǎo)16周的小鼠肝臟出現(xiàn)纖維化，并且C.B6By-Listr1小鼠纖維化程度低于BALB/c小鼠（圖3A），纖維化陽性表面積定量分析展示第16和20周差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（1.833±0.236 vs 3.833±0.850；2.333±0.471 vs 5.472±0.579）（圖3B）。通過ALT評價(jià)肝功能發(fā)現(xiàn)第12、16和20周C.B6By-Listr1小鼠ALT水平明顯低于BALB/c小鼠，分別為（54.0±2.0）U/L vs（85.5±3.5）U/L、（61.5±5.5）U/L vs（113.5±8.5）U/L和（53.5±0.5）U/L vs（183.5±22.5）U/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3C）。因此，推測Listr1遺傳位點(diǎn)具有緩解肝纖維化和肝損傷的作用。

圖3 Listr1遺傳位點(diǎn)對飲食誘導(dǎo)的肝纖維化的影響Fig.3 Impact of the Listr1 gene locus on diet-induced hepatic fibrosis

3 討論

Listr1遺傳位點(diǎn)是控制小鼠對單核細(xì)胞增生性李斯特菌易感性的數(shù)量性狀位點(diǎn)，此前的研究［10-11］提示該位點(diǎn)可能通過影響肝內(nèi)固有免疫發(fā)揮作用。本研究進(jìn)一步探討了Listr1遺傳位點(diǎn)對小鼠NAFLD易感性的影響。

喂養(yǎng)高脂高糖飲食誘導(dǎo)的小鼠NAFLD模型與人類NAFLD高度相似，主要表現(xiàn)具有相同的炎癥細(xì)胞活化、肝臟脂肪變性、纖維化和代謝綜合征［4，12］。給予高脂高糖飲食后，C.B6By-Listr1小鼠體質(zhì)量和肝臟質(zhì)量低于BALB/c小鼠，同時(shí)C.B6By-Listr1小鼠脂肪變性的發(fā)生晚于BALB/c小鼠，且程度更輕。目前尚不清楚導(dǎo)致這些差異的直接原因，但是第12周開始，研究檢測到C.B6By-Listr1小鼠炎性細(xì)胞因子IL-1β、MCP-1、TNF-α和IL-6水平明顯低于BALB/c小鼠。有文獻(xiàn)［14-15］報(bào)道肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)聚積和脂滴形成激活枯否細(xì)胞釋放促炎因子，炎性細(xì)胞因子促進(jìn)脂肪酸合成，導(dǎo)致甘油三酯向肝臟聚集加重肝脂肪變性；MCP-1也可以通過減少M(fèi)2巨噬細(xì)胞極化，降低能量消耗［16］。據(jù)此推測BALB/c小鼠脂肪變性更嚴(yán)重可能與肝臟高水平炎性細(xì)胞因子密切相關(guān)，兩者相互促進(jìn)，導(dǎo)致NAFLD的形成和進(jìn)展。

慢性炎癥是肝纖維化的主要原因，C.B6By-Listr1小鼠纖維化和肝細(xì)胞損傷程度輕于BALB/c小鼠，與肝臟炎癥、脂肪變性結(jié)果相一致，進(jìn)一步證實(shí)高脂高糖飲食在BALB/c小鼠肝臟中誘發(fā)更加強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)。肝內(nèi)巨噬細(xì)胞是誘導(dǎo)肝臟炎癥和肝星型細(xì)胞活化的關(guān)鍵細(xì)胞，C.B6By-Listr1小鼠肝內(nèi)巨噬細(xì)胞活化少于BALB/c小鼠，此前在李斯特菌感染的小鼠模型中也觀察到Listr1位點(diǎn)影響巨噬細(xì)胞亞群的數(shù)量與功能［10］。故此推測Listr1遺傳位點(diǎn)可能通過相似的機(jī)制控制小鼠對肝內(nèi)感染性疾病和非感染性疾病的易感性，C57BL/6來源的Listr1遺傳位點(diǎn)具有減少巨噬細(xì)胞活化，抑制IL-1β、MCP-1、TNF-α和IL-6表達(dá)的作用。

本課題組的前期研究［10-11］提示，Listr1遺傳位點(diǎn)中候選易感基因是趨化因子CXCL11編碼基因，BALB/c小鼠的CXCL11編碼基因?yàn)楣δ苄曰?，而C57BL/6小鼠攜帶缺陷等位基因。CXCL11與CXCL9、CXCL10共用同一受體CXCR3，具有趨化活化的T細(xì)胞和多種固有免疫細(xì)胞的作用。有研究［13］顯示CXCR3及其配體在慢性肝炎的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。慢性肝病患者CXCL9、CXCL10、CXCL11水平明顯升高，并且CXCL9、CXCL10與肝纖維化嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。CXCR3-/-小鼠與野生型小鼠相比，對飲食誘導(dǎo)的NAFLD具有更強(qiáng)的抵抗性，這主要是由于CXCR3-/-小鼠顯著減少促炎因子的表達(dá)。在CXCL10-/-和野生型NAFLD小鼠模型中，CXCL10-/-小鼠可以通過減少肝臟巨噬細(xì)胞浸潤、緩解炎癥水平和纖維化程度，從而改善肝功能［13］。這些研究以及本文中的發(fā)現(xiàn)都提示CXCR3及其配體在NAFLD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，但是這一通路的具體作用機(jī)制仍不清楚。

Listr1遺傳位點(diǎn)不僅控制小鼠對李斯特菌的易感性，也控制小鼠對NAFLD的易感性，深入研究其調(diào)控肝內(nèi)免疫應(yīng)答的機(jī)制特別是對巨噬細(xì)胞數(shù)量和亞群的調(diào)控機(jī)制具有重要意義。