褪黑素對爆震傷誘導小鼠肺損傷的保護作用及機制

施琳，趙劍

（沈陽藥科大學生命科學與生物制藥學院藥理教研室，沈陽 110016）

爆震傷是一種較常見的嚴重創(chuàng)傷［1］。肺和胃腸道是最易受爆震傷影響的器官，肺損傷是導致高死亡率的主要原因［2］。足夠的能量暴露會導致毛細血管-肺泡界面的破壞，從而導致實質(zhì)出血和肺泡壁的破壞［3］。急性肺間質(zhì)改變逐漸發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征，嚴重影響患者的生活質(zhì)量和預后。因此，明確肺爆震傷的機制對傷員的救治有重要意義。

肺沖擊傷的早期癥狀嚴重，是造成人員傷亡的重要原因［4］。其早期癥狀體征不明顯，具有“外輕內(nèi)重，發(fā)展迅速”的特點［5］。爆震沖擊波通過胸壁組織擴散到全身，導致肺泡毛細血管破裂、肺內(nèi)出血和水腫，進而導致自由基形成、水腫、炎性細胞因子的積聚和氧化損傷［6］。

褪黑素（N-乙酰基-5-甲氧基色胺）具有抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)和血管舒縮作用［7-9］，可以改善輕度炎癥，并誘導分泌強有力的促炎細胞因子［10］。此外，褪黑素還可以通過抑制肺臟炎性小體的激活來減輕炎癥反應［11］。然而，褪黑素對爆震傷誘導的肺損傷的保護作用及機制仍不清楚。本研究擬探討褪黑素對爆震傷誘導小鼠肺損傷的保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗動物及試劑：雄性C57BL/6小鼠30只，體質(zhì)量20～22 g，6～8周齡，由本溪長生生物科技有限公司提供。所有小鼠在實驗開始前1周安置于標準實驗室條件下，溫度穩(wěn)定（20～24 ℃），濕度穩(wěn)定（55%±5%），光/暗循環(huán)12/12 h，隨意進食和飲水。本研究經(jīng)北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院倫理委員會批準。褪黑素購自美國Sigma公司。實驗所需一抗白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、白細胞介素-17（interleukin-17，IL-17）、白細胞介素-23（interleukin-17，IL-23）、重組人Semaphorin 7a蛋白（Semaphorin 7a，Sema7a）、人胎球蛋白A（fetuin-A，Ahsg）、p38、核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）和磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH），以及相應二抗、酶聯(lián)免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測試劑盒均購自英國Abcam公司。蘇木精、伊紅和Masson染色試劑盒購自珠海貝索公司。

1.2 方法

1.2.1 肺爆震傷模型建立：小鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉（1.5 mL/kg）麻醉。用螺絲釘固定裝置后，將小鼠放在裝置頂部有10個規(guī)則孔的橡膠墊上。壓力泵連接到裝置底部，不斷加壓，直到鋁膜破裂。壓縮空氣迅速從爆破口高速膨脹，形成沖擊波沖擊小鼠的胸部。壓力傳感器檢測到的壓力通過數(shù)據(jù)電纜傳輸并由計算機記錄。采用以下公式獲得壓力波形：壓力（pounds per square inch，PSI）=電壓值×1 000/50.08。瞬時沖擊波超壓為321±24 壓力/平方英尺。

1.2.2 實驗分組：適應環(huán)境7 d后，將30只小鼠隨機分為3組：假手術（Sham）組、爆震傷（Blast）組及爆震傷+褪黑素（Blast+Mel）組，每組10只。爆震傷+褪黑素組于爆震傷前1周腹腔注射30 mg/kg褪黑素，其余組給予生理鹽水，1次/d，連續(xù)7 d。

1.2.3 標本收集及處理：沖擊傷后48 h，用2%戊巴比妥鈉（1.5 mL/kg）腹腔麻醉，俯臥位固定于手術臺上。處死小鼠，采集肺和血液樣本。將左肺浸入10%甲醛緩沖液中固定，用于后續(xù)病理分析。用濾紙干燥右肺上葉，在分析天平上稱重，得到濕質(zhì)量。在60 ℃烘箱中干燥72 h后，記錄右肺上葉的干質(zhì)量。W/D=濕質(zhì)量/干質(zhì)量。將剩余的肺組織置于液氮罐中用于后續(xù)蛋白分析。

1.2.4 ELISA：用ELISA試劑盒測定血清中IL-4和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-a，TNF-α）的含量。具體操作方法見試劑說明書。

1.2.5 組織病理學檢查：對10%中性甲醛固定的肺組織進行脫水、包埋和切片處理。對切片進行HE染色和Masson染色。具體操作方法見試劑說明書。

1.2.6 Western blotting檢測：檢測肺組織促炎因子IL-6、IL-17和IL-23的表達，同時檢測肺組織炎癥相關通路蛋白Sema7a、Ahsg、p38和NF-κB的表達。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以表示。采用t檢驗和單因素方差分析。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 褪黑素減輕爆震傷導致的血清炎癥因子表達

與假手術組相比，爆震傷組小鼠肺W/D比值從4.18±0.15增加至5.23±0.07，而褪黑素顯著降低爆震傷組小鼠肺濕重/干重比值，W/D比值為4.66±0.11，有統(tǒng)計學差異（P＜ 0.05）。此外，與對照組［（54.79±6.03）ng/L和（34.85±2.96 ）ng/L］相比，爆震傷組小鼠血清TNF-α和IL-4的表達分別為（140.12±11.71）ng/L和（64.28±7.46）ng/L，而褪黑素處理顯著抑制血清TNF-α和IL-4的表達，分別為（81.00±9.56）ng/L和（46.76±4.34）ng/L，見圖1。

圖1 肺濕質(zhì)量/干質(zhì)量和血清炎性細胞因子表達Fig.1 Lung wet/dry weight ratio and serum inflammatory factor expression

2.2 褪黑素改善爆震傷導致的肺組織病理學改變

與對照組相比，爆震傷導致肺組織出現(xiàn)明顯的出血、水腫、肺泡隔破裂和炎癥細胞浸潤，經(jīng)過褪黑素處理后明顯改善。同時，爆震傷組小鼠支氣管及血管周圍可見明顯的纖維沉積，而褪黑素組纖維化程度有所改善，見圖2。

圖2 肺組織病理學改變Fig.2 Pathological alterations in lung tissue

2.3 褪黑素減少爆震傷誘導的肺組織炎性細胞因子產(chǎn)生

與對照組相比（0.56±0.23、0.82±0.24、0.15±0.04），爆震傷組小鼠肺組織促炎因子IL-6、IL-17和IL-23表達顯著增加，分別為1.01±0.05、0.98±0.17和1.10±0.11，有統(tǒng)計學差異（P＜ 0.05），而褪黑素處理則顯著降低促炎因子IL-6、IL-17和IL-23表達，分別為0.71±0.20、0.62±0.14、0.23±0.02，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05），見圖3。

圖3 各組肺組織IL-6、IL-17和IL-23表達情況Fig.3 Expression of IL-6，IL-17，and IL-23 in lung tissues of the different groups

2.4 褪黑素降低爆震傷誘導的肺組織炎癥相關通路蛋白表達

與對照組相比（0.77±0.06、0.76±0.03），爆震傷組小鼠肺組織促炎因子Sema7a和Ahsg蛋白表達顯著增加，分別為1.12±0.13和1.02±0.06，有統(tǒng)計學差異（P＜ 0.05），而褪黑素處理則顯著降低促炎因子Sema7a和Ahsg表達，分別為0.80±0.13和0.77±0.24。此外，與對照組（0.44±0.05和0.61±0.13）相比，爆震傷組小鼠肺組織p38和NF-κB蛋白表達顯著增加，分別為1.15±0.30和0.85±0.13，而褪黑素處理后肺組織p38和NF-κB蛋白表達水平顯著降低，分別為0.40±0.06和0.59±0.14，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05），見圖4。

圖4 各組肺組織Ahsg、Sema7a、p38和NF-κB蛋白表達情況Fig.4 Expression of Ahsg，Sema7a，p38，and NF-κB proteins in lung tissues of different groups

3 討論

本研究結(jié)果顯示，褪黑素可顯著抑制爆震傷誘導的肺W/D比值，降低血清炎性細胞因子表達，改善爆震傷導致的肺組織病理改變。此外，褪黑素還可顯著降低p38和NF-κB蛋白表達。褪黑素對肺爆震傷的保護作用可能與其抗炎活性有關，其機制可能與p38/NF-κB信號通路密切相關。

作為一種抗炎和抗氧化藥物，褪黑素可抑制脂多糖誘導的促炎介質(zhì)（細胞因子和趨化因子）和活性氧的釋放［12］。本研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素顯著抑制爆震傷誘導的肺濕重/干重比值，降低血清炎性細胞因子表達，降低肺組織IL-6、IL-17和IL-23表達。據(jù)文獻［13］報道，褪黑素預處理對缺血再灌注肺損傷有保護作用，其作用可能與褪黑素的抗炎和抗氧化作用有關。同時，褪黑素被報道可以部分通過抗炎作用防止四氯化碳暴露造成的組織損傷［14］。此外，褪黑素還可以通過減輕組織水腫、中性粒細胞浸潤，降低支氣管灌注液中TNF-α、IL-1β和IL-6等炎性細胞因子，對熱射病造成的急性肺損傷發(fā)揮保護作用［15］。

本研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素明顯抑制爆震傷導致的小鼠Sema7a和Ahsg蛋白表達，顯著降低p38和NF-κB蛋白表達。研究［16］發(fā)現(xiàn)，褪黑素能抑制炎癥體基因NLRP3、Asc、Caspase1和IL-1β的表達，而NF-κB可以與TLR4和NLRP3啟動子區(qū)域結(jié)合，提示NF-κB對TLR4和NLRP3及其下游靶點的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。同時，有研究［17］發(fā)現(xiàn)NF-κB信號是一種胞質(zhì)感受器，激活并促進其核轉(zhuǎn)位和DNA結(jié)合而褪黑素在不同細胞中的促炎作用與NF-κB密切相關介。此外，褪黑素還能通過調(diào)節(jié)核κα途徑來抑制NF-κB/NLRP3的激活，有效減少NF-RRPB的磷酸化［18］。NF-κB信號是褪黑素發(fā)揮抗炎功能的中心，褪黑素還可以通過促進NF-κB/p65從細胞質(zhì)向胞核轉(zhuǎn)位［19］。

綜上所述，褪黑素可能通過抑制p38/NF-κB信號通路發(fā)揮抗炎活性，進而對爆震傷誘導的肺損傷進行保護。