Raf激酶抑制蛋白表達(dá)水平與非小細(xì)胞肺癌放射敏感性的關(guān)系

韓沖，于洋洋，黨軍，姚雷，李光

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院放射治療科，沈陽 110001）

肺癌是目前全世界發(fā)病率最高的惡性腫瘤，其中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）約占肺癌總數(shù)的85%～90%［1］。放射治療是局部進(jìn)展期NSCLC的主要治療手段［2］，但局部進(jìn)展期NSCLC的5年生存率不足15%［3］，局部未控率高達(dá)70%，放射抗拒是影響放射治療效果的主要生物學(xué)因素［4］。深入了解細(xì)胞放射敏感性的影響因素，找出特異性的分子靶點(diǎn)，在放射治療前準(zhǔn)確預(yù)測(cè)NSCLC的放射敏感性是實(shí)現(xiàn)NSCLC個(gè)體化、高效治療的關(guān)鍵。

Raf激酶抑制蛋白（Raf kinase inhibitor protein，RKIP）在乳腺癌、前列腺癌、肺癌等多種惡性腫瘤中表達(dá)減少［5］，與Raf-1/MEK/ERK、G蛋白耦聯(lián)受體、核因子κB（nuclear factor-kappa B）、Wnt等多種信號(hào)通路的調(diào)節(jié)有關(guān)，導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展及治療抵抗［6］。本研究通過檢測(cè)放射治療前NSCLC組織中RKIP的表達(dá)，分析RKIP蛋白表達(dá)與放射敏感性的相關(guān)關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇2012年至2014年在我院行根治性放射治療的NSCLC患者，共106例，卡氏（Karnofsky，KPS）評(píng)分均≥80分。其中，男76例，女30例；年齡40～83歲（中位年齡61歲）；鱗狀細(xì)胞癌72例，腺癌34例。參考國際抗癌聯(lián)盟第八版肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)分期，T112例，T249例，T338例，T47例，N0～1期52例，N2～3期54例；臨床分期Ⅱ期59例，Ⅲ期47例。所有病例入組時(shí)均無手術(shù)適應(yīng)證，均未行同期化學(xué)治療。

1.2 放射治療

用真空墊及熱塑體模固定患者，行C4～L2椎體下緣范圍5 mm層厚CT增強(qiáng)定位；將CT掃描信息傳輸至Pinnacle9.0（美國ADAC公司）放射治療計(jì)劃系統(tǒng)，由2名臨床醫(yī)師勾畫大體腫瘤區(qū)（gross target volume，GTV）和危及器官（organ at risk，OAR）；原發(fā)病灶為GTV，縱隔區(qū)腫大淋巴結(jié)（短徑＞1 cm）為GTVnd。GTV外放6～8 mm為臨床靶區(qū)（clinical target volume，CTV），不做縱隔淋巴引流區(qū)預(yù)防性照射。計(jì)劃靶區(qū)（planning target volume，PTV）在CTV的基礎(chǔ)上前后左右外放5 mm，上下外放10 mm。采用適形調(diào)強(qiáng)放射治療技術(shù)，6 MV-X線照射，2 Gy/次，1次/d，5次/周。初治劑量達(dá)到40 Gy時(shí)再次行CT定位，根據(jù)瘤體變化情況修改腫瘤靶區(qū)繼續(xù)放射治療，總劑量達(dá)到60～66 Gy/30～33次。

1.3 放射敏感性及近期療效評(píng)價(jià)

放射治療至40 Gy時(shí)再次行CT定位，并將圖像與放射治療前圖像融合，利用TPS系統(tǒng)的體積計(jì)算模塊計(jì)算原發(fā)病灶GTV縮小百分率，應(yīng)用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線截點(diǎn)值區(qū)分以GTV縮小百分率為評(píng)價(jià)指標(biāo)的放射敏感性。

1.4 免疫組化染色及判定

放射治療前病理活檢組織標(biāo)本均以10%甲醛固定，石蠟包埋封存，并經(jīng)HE染色病理確診。采用兔抗人RKIP多克隆抗體（sc-28837，美國Santa Cruz生物工程公司）。切片微波抗原修復(fù)后，行SP法免疫組化染色，DAB顯色，RKIP定位于細(xì)胞質(zhì)。判定標(biāo)準(zhǔn)：高倍鏡下（×400）每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野，計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞/視野，輔以計(jì)算機(jī)圖像分析結(jié)果，以細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞。RKIP蛋白表達(dá)無陽性細(xì)胞為0分，陽性細(xì)胞簇≤25%為1分，＞25%～50%為2分，＞50%～75%為3分，＞75%為4分。著色強(qiáng)度無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細(xì)胞積分與著色強(qiáng)度積分分別相加：0～2為低表達(dá)（-），3～5分為中表達(dá)（+），6～7分為高表達(dá)（++），其中（+）和（++）判定為陽性［7］。所有結(jié)果均由2名病理醫(yī)師采用盲法單獨(dú)判定。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。評(píng)分截點(diǎn)值采用ROC曲線分析，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，放射敏感性相關(guān)的多因素分析應(yīng)用logistic回歸分析，指標(biāo)間相關(guān)性分析應(yīng)用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RKIP表達(dá)水平及其與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系

免疫組化染色結(jié)果顯示，RKIP蛋白陽性表達(dá)率為65.1%（69/106），見圖1。無縱膈淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（N0～1）的NSCLC患者RKIP陽性表達(dá)率［84.6%（44/52）］高于有縱膈淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（N2～3）的患者［46.3%（25/54）］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。臨床分期Ⅱ期的NSCLC患者RKIP陽性表達(dá)率為［79.7%（47/59）］高于Ⅲ期患者［46.8%（22/47）］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。

圖1 NSCLC中RKIP的表達(dá) SP法 ×400Fig.1 Expression of RKIP in NSCLC SP ×400

RKIP表達(dá)與患者的性別、年齡、病理類型及原發(fā)腫瘤T分期之間無相關(guān)性（P＞ 0.05），見表1。

表1 NSCLC組織中RKIP的表達(dá)結(jié)果及其與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系Tab.1 Expression of RKIP proteins in NSCLC and relationship with clinicopathological factors

2.2 NSCLC放射敏感性與臨床分期及RKIP表達(dá)水平的Spearman相關(guān)性分析

對(duì)106例NSCLC患者GTV縮小百分率進(jìn)行ROC曲線分析，截點(diǎn)值為33.6%，特異度84.1%，靈敏度81.4%，見圖2。將＜33.6%定義為低放射敏感，≥33.6%定義為高放射敏感，低放射敏感者37例，高放射敏感者69例。Spearman相關(guān)分析顯示，臨床分期及RKIP表達(dá)水平與NSCLC的放射敏感性具有相關(guān)性（r=-0.235，P＜ 0.05；r=0.257，P＜ 0.05），臨床分期早、RKIP表達(dá)水平高的NSCLC患者放射敏感性高。而性別、年齡、病理類型及原發(fā)腫瘤T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移N分期與NSCLC患者放射敏感性無明顯相關(guān)性（r分別為-0.072、-0.091、0.003、0.166、-0.040，P＞ 0.05），見表2。

表2 影響NSCLC放射敏感性的臨床因素Spearman分析Tab.2 Spearman analysis of clinicopathological factors affecting radiosensitivity of NSCLC

圖2 NSCLC 患者GTV縮小ROC曲線Fig.2 GTV reduces ROC curve in NSCLC

2.3 影響NSCLC放射敏感性的logistic多因素分析

將上述P＜ 0.05的因素（臨床分期以及RKIP表達(dá)情況）納入logistic回歸模型中，分析結(jié)果顯示，RKIP表達(dá)水平是NSCLC放射敏感性的獨(dú)立相關(guān)因素（Wald=4.041，P=0.044），見表3。

表3 影響NSCLC放射敏感性的logistic多因素分析結(jié)果Tab.3 Multivariate logistic analysis of factors affecting the radiosensitivity of NSCLC

3 討論

RKIP屬于磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白家族，是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制因子，在多種人類惡性腫瘤（如肺癌、前列腺癌、肝細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌及鼻咽癌）中，RKIP蛋白的表達(dá)明顯減少［5］，尤其在轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)中RKIP蛋白不表達(dá)或者顯著降低［8-9］，RKIP蛋白表達(dá)下降與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)，增加RKIP的蛋白表達(dá)可以調(diào)控細(xì)胞通路，抑制血管生成，阻止脈管入侵，顯著抑制腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移能力。文獻(xiàn)［6］報(bào)道，RKIP蛋白過表達(dá)可逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的化學(xué)、免疫、放射治療抵抗性，并重啟免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的監(jiān)視及清除作用。胡春杰等［10］發(fā)現(xiàn)，上調(diào)宮頸癌細(xì)胞RKIP基因的表達(dá)能夠抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，是宮頸癌治療的新靶點(diǎn)。劉學(xué)飛等［11］研究發(fā)現(xiàn)RKIP與乳腺癌的惡化程度有關(guān)，RKIP能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲，且其作用機(jī)制可能是通過對(duì)NF-κB的負(fù)調(diào)控而實(shí)現(xiàn)。

NSCLC具有高侵襲性、高轉(zhuǎn)移性及放化療抵抗，與腫瘤細(xì)胞逃逸宿主免疫監(jiān)視及異常免疫應(yīng)答有關(guān)，嚴(yán)重影響肺癌患者的治療效果，是導(dǎo)致患者高死亡率的重要原因。肺癌侵襲與轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制是目前急需研究探討的課題。本研究結(jié)果顯示，隨臨床分期進(jìn)展，NSCLC組織中RKIP蛋白表達(dá)陽性率逐步降低（P＜ 0.05）；RKIP蛋白表達(dá)在有縱隔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC中較無縱隔淋巴轉(zhuǎn)移者明顯降低（P＜ 0.05）；RKIP蛋白表達(dá)與患者的性別、年齡、病理類型及原發(fā)腫瘤T分期無關(guān)，證實(shí)了RKIP蛋白在NSCLC的發(fā)生、發(fā)展和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的機(jī)制中起重要作用，提示RKIP在肺癌中可能是腫瘤抑制因子。其具體機(jī)制可能與參與Raf-1/MEK/ERK、G蛋白耦聯(lián)受體和NF-κB等多種信號(hào)通路的調(diào)節(jié)有關(guān)［12］。RKIP也可通過干擾GSK3β影響細(xì)胞分裂和凋亡［6，13］。

迄今為止的癌癥模型中，RKIP被認(rèn)為具有細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑的作用，并能夠啟動(dòng)抗性腫瘤細(xì)胞對(duì)常規(guī)治療方式的再敏化和對(duì)宿主免疫監(jiān)視的敏感性。RKIP是一種可提高化學(xué)治療效果的增敏劑，已在宮頸癌、肺腺癌、胃癌、前列腺癌和乳腺癌等多種腫瘤中得以證實(shí)［13］。最近，YUAN等［14］發(fā)現(xiàn)RKIP表達(dá)低的鼻咽癌患者臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率均高，且放射敏感性低，預(yù)后不良，是鼻咽癌的獨(dú)立預(yù)后因素。體外培養(yǎng)細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，沉默RKIP表達(dá)后，鼻咽癌細(xì)胞的放射敏感性降低，而上調(diào)鼻咽癌細(xì)胞RKIP表達(dá)則可通過減少Raf-1/MEK/ERK 通路中MEK和ERK的磷酸化作用，提高放射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，從而提高鼻咽癌細(xì)胞的放射敏感性。目前，RKIP蛋白表達(dá)與NSCLC放射敏感性相關(guān)關(guān)系的報(bào)道極少，近年有研究［7］發(fā)現(xiàn)RKIP基因沉默和RKIP蛋白表達(dá)下降可能激活了NSCLC中Shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的表達(dá)，使NSCLC細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞屬性，產(chǎn)生幾乎無限的復(fù)制潛力，將明顯提高腫瘤細(xì)胞的放射抵抗能力。本研究中，Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，臨床分期及RKIP表達(dá)水平與NSCLC的放射敏感性具有相關(guān)性，臨床分期早、RKIP表達(dá)水平高的NSCLC患者放射敏感性高。多因素分析顯示，RKIP表達(dá)水平是NSCLC放射敏感性的獨(dú)立相關(guān)因素。表明RKIP可做為預(yù)測(cè)NSCLC放射敏感性的有效生物學(xué)指標(biāo)，對(duì)實(shí)現(xiàn)NSCLC放射敏感性的基因靶向調(diào)節(jié)、有針對(duì)性地進(jìn)行個(gè)體化治療具有重要意義。