ERRα通過調(diào)控肌鈣蛋白I表達促進心肌細胞成熟的機制*

陳聰 楊月星 黃安芳 付虎

(1.成都市第一人民醫(yī)院,四川 成都 610016;2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院,四川 瀘州 646000)

心臟是有脊椎動物最早發(fā)育的器官[1]，過去學(xué)者多關(guān)注心臟在胚胎發(fā)育期間諸多基因在時間、空間上的有序表達[2]，然而近些年研究提示，在出生后，心臟將經(jīng)歷最后的成熟階段，這個階段對于最終完美心臟功能的實現(xiàn)至關(guān)重要[3]。心肌細胞成熟(cardiomyocytes maturation)主要包括心肌細胞能量代謝方式的轉(zhuǎn)換，即糖酵解為主要供能方式轉(zhuǎn)換成脂肪酸氧化(FAO)；心肌細胞肌絲蛋白亞型轉(zhuǎn)換，如由胚胎型肌鈣蛋白I(ssTnI)逐漸向心肌肌鈣蛋白(cTnI)轉(zhuǎn)換，胚胎型肌球蛋白重鏈(βMHC)向成熟型肌球蛋白(αMHC)轉(zhuǎn)換以及離子通道相關(guān)基因表達水平的變更[3-4]。近幾年有研究提示雌激素受體α(ERRα)在心肌細胞成熟過程中對能量代謝相關(guān)基因具有直接調(diào)控作用[5-6]。如文獻提示ERRα可作為轉(zhuǎn)錄因子直接調(diào)控脂肪酸氧化代謝相關(guān)基因Acsl1表達升高，而下調(diào)調(diào)控糖酵解通路的Acsl3基因表達[5]。同時期對心肌細胞離子通道相關(guān)基因表達亦具有重要調(diào)控作用[5]。因此推測其可能在肌絲蛋白亞型轉(zhuǎn)換中也發(fā)揮關(guān)鍵作用,本文探討雌激素受體α(ERRα)在心肌細胞成熟過程中調(diào)控機制，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 選取三級無特殊病原體動物(SPF級)c57小鼠(購于四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動物中心)，按雄雌1:2比例合籠，次日觀察陰栓，觀察到陰栓最早之日計為孕期E0.5。取E14.5、E17.5、新生小鼠、生后2周及生后4周小鼠為研究對象，設(shè)為E14.5組(胎齡14.5天)、E17.5組(胎齡17.5天)、NB組(新生小鼠)、P2W組(生后2周)、P4W組(生后4W)，每組各4只。采用二氧化碳窒息處死小鼠，隨即取出心臟組織備用。本實驗對動物處理符合動物倫理要求，并經(jīng)成都市第一人民醫(yī)院倫理委員會審核同意。

1.2 主要試劑和儀器 抗組蛋白H3乙?；贵w(ab1791)；工作濃度1∶1000；抗ERRα抗體(1ERR87)抗ssTnI抗體(ab203515)、抗cTnI抗體(ab209809)，工作濃度1∶2000；抗β-actin鼠單克隆抗體(ab8227)，工作濃度1∶1000；ChIP試劑盒(ab500)(Abcam 英國)；山羊抗兔及山羊抗小鼠帶HRP標記的IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；凱基全蛋白提取試劑盒(凱基生物，中國，KGP 2100)；總RNA提取試劑盒(凱基生物，中國，KGA 1203)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司，日本)；實時定量PCR試劑盒(天根生化技術(shù)有限公司)。凝膠圖像分析儀(Gene公司，美國)；熒光定量PCR儀(Bio-Rad公司，美國)。

1.3 實驗方法

1.3.1 Western blot實驗 小鼠心臟組織獲取后根據(jù)全蛋白提取試劑盒操作提取蛋白組織；上樣量為30 μg, 點樣在10%的SDS-聚丙酰胺凝膠上進行電泳后電轉(zhuǎn)至0.22 μm的PVDF膜上，用封閉液稀釋Ⅰ抗后4 ℃10小時，洗膜后再孵育Ⅱ抗(1∶3000稀釋)，室溫下孵育2 h后再洗膜后用化學(xué)發(fā)光成像，將條帶輸入Quantity one軟件獲得其灰度值，以目的蛋白/β-actin(灰度值)來反映蛋白的相對表達量。

1.3.2 實時定量PCR實驗 收集心臟組織標本后進行相應(yīng)目標基因mRNA檢測。ERRα上游引物序列5′-CACAAGAGCTTGAGCGATT-3′ 下游引物序列為5′- CAGGCTGGAC TTCTACGAT-3′，產(chǎn)物長度為127 bp；ssTnI的上游引物序列為5′-AAGACGTAGCCTACTGCTG-3′，下游引物序列為5′-ATGCCGCTATGTGA GTAGC-3′，產(chǎn)物長度為142 bp；cTnI的上游引物序列為5′-CCTGCACCGATACCGATT-3′，下游引物序列為5′-CCGTCGAATGCTC GCACTG-3′，產(chǎn)物長度為135 bp；αMHC的上游引物序列為5′-GCCTGGAATAATACCCGAG-3′, 下游引物序列為5′-ATCCGCTGCATTCCTAATCT-3′，產(chǎn)物長度114 bp；βMHC上游引物序列為5′-AGC GTTGATTCATCGAT-3′，下游引物序列為5′-ATC GATGAATCAACGCT-3′。選取β-actin作為內(nèi)參基因。所得數(shù)據(jù)用Bio-RadCFX96 熒光定量PCR 儀自帶基于Pfaffl 原理的相對定量數(shù)據(jù)分析軟件分析。

1.3.3 染色質(zhì)免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation，ChIP)實驗 按照ChIP試劑盒進行操作，心臟70 mg，勻漿，預(yù)冷PBS 清洗后加入1%的甲醛交聯(lián)15 min。超聲破碎儀將DNA 切割至200～1 000 bp之間。加入ChIP 級抗ERRα抗體及乙?；M蛋白H3抗體4 ℃沉淀DNA，65 ℃逆轉(zhuǎn)交聯(lián)，純化并回收DNA。于-20 ℃保存。

1.3.4 ChIP-qPCR實驗 選取cTnI、ssTnI、αMHC及βMHC基因外顯子5′端前1000 bp 序列，針對該序列設(shè)計特異性引物。引物用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計，由寶生物公司合成。cTnI的上游引物序列為5′-ATCGGATTCAGGTACCG-3′，下游引物序列為5′-CGGTACCTGAATCCGAT-3′，產(chǎn)物大小為133 bp;ssTnI上游引物序列為5′-AACTGCCGATTCAGTTATC-3′，下游引物序列為5′-GATAACTGAATCGGCAGTT-3′，產(chǎn)物大小為128 bp;αMHC的上游引物序列為5′-TCACTCTTCTCGTACCCACACAA-3′，下游引物序列為5′-CGGGAGAAGTGATGGGGTAACG-3′，產(chǎn)物大小為118 bp; βMHC上游引物序列為5′-TAACGATTCGTAATTCGG-3′，下游引物序列為5′-CCGAATTACGAATCGTTA-3′，產(chǎn)物大小為117 bp。所得數(shù)據(jù)用Bio-RadCFX96 熒光定量PCR 儀自帶基于Pfaffl 原理的相對定量數(shù)據(jù)分析軟件分析。

2 結(jié)果

2.1 心臟發(fā)育及成熟過程中ERRα及肌絲蛋白各亞型mRNA表達時序 運用qPCR方法檢測小鼠心臟中ssTnI、cTnI、αMHC、βMHC及ERRα的mRNA表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)從胚胎E14.5天開始，ERR表達水逐漸升高，至生后2周表達達峰值，后維持在此水平，P2W組與E14.5組、E17.5組、NB組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，較P4w組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見圖1A)。與ERRα表示時序性相似，cTnI轉(zhuǎn)錄水平從E14.5時期逐漸升高，至出生后2周表達達高峰，維持在此水平，P2W組較E14.5組、E17.5組、NB組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，較P4W組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見圖1B)。αMHC從E14.5天表達水平亦逐漸升高，但其在出生后四周，即小鼠心臟發(fā)育完全成熟期表達達峰值，P4W組較E14.5組、E17.5組、NB組及P2W組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)(見圖1C)。ssTnI及βMHC mRNA表達水平則在心臟發(fā)育過程中逐漸下降，E14.5組較NB組、P2W組及P4W組比價差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05),與E17.5組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖1D、圖1E。

圖1 心臟發(fā)育及成熟階段各基因mRNA相對表達(n=4)

2.2 心臟發(fā)育及成熟過程中ERRα及肌絲蛋白各亞型蛋白表達時序 運用western blot方法檢測小鼠心臟中ssTnI、cTnI及ERRα的蛋白表達水平。小鼠心臟發(fā)育及成熟過程中ERRα、cTnI、ssTnI蛋白表達水平與mRNA表達水平相同，見圖2。

2.3 肌絲蛋白各亞型啟動子組蛋白乙?；?組蛋白乙?；瘎討B(tài)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，ChIP結(jié)合Q-PCR方法進一步檢測ssTnI、cTnI、αMHC及βMHC啟動子區(qū)域組蛋白乙?；?。cTnI啟動子組蛋白乙?；皆谏?周達峰值，P2W組與E14.5組、E17.5組及NB組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與P4W組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。ssTnI、αMHC及βMHC啟動子區(qū)域組蛋白乙酰化水平在各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見圖3。

圖3 心臟發(fā)育及成熟階段各基因啟動子組蛋H3乙酰化水平(n=4)

2.4 ERRα與肌絲蛋白基因亞型啟動子結(jié)合水平 利用ChIP-Q-PCR方法檢測轉(zhuǎn)錄因子ERRα與ssTnI、cTnI、αMHC及βMHC啟動子區(qū)域結(jié)合水平。發(fā)現(xiàn)ERRα與cTnI啟動子結(jié)合水平在出生后2周達峰值，P2W組與E14.5組、E17.5組及NB組相比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，與P4W組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。ERRα與ssTnI啟動子結(jié)合水平在E14.5組心臟組織中最高，與NB組、P2W組及P4W組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，與E17.5組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。ERRα與αMHC及βMHC啟動子區(qū)域結(jié)合水平在各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。

圖4 心臟發(fā)育及成熟階段ERRα與各基因啟動子結(jié)合水平

3 討論

心臟成熟涉及能量代謝方式的轉(zhuǎn)換，肌絲蛋白亞型轉(zhuǎn)換及適應(yīng)出生后心肌細胞微環(huán)境及收縮/舒張力的改變，以及離子通道基因亞型的轉(zhuǎn)換等[7]。肌絲蛋白亞型轉(zhuǎn)換這一現(xiàn)象已為人所熟知，但其內(nèi)在機理目前仍不明確。心肌細胞能量代謝是肌絲蛋白收縮、舒張的核心環(huán)節(jié)[8-10]，因此近些年有學(xué)者認為，能量代謝是心肌細胞走向成熟的始動因素[5]。而ERR作為轉(zhuǎn)錄因子與心肌細胞能量代謝密切相關(guān)，其可直接調(diào)控PGC1-α而影響心肌細胞能量代謝通路[11-12]。因此，我們對ERRα在心臟成熟過程中的可能作用進行了初步研究。

肌絲蛋白亞型轉(zhuǎn)換涉及眾多基因調(diào)控，其中肌鈣蛋白I及肌球蛋白重鏈在心臟成熟過程中變化最為人所熟知[13-14]。本研究的數(shù)據(jù)與以往研究相符合，即心臟發(fā)育及成熟過程中胚胎型肌鈣蛋白及肌球蛋白重鏈逐漸向成熟亞型轉(zhuǎn)換。同時我們還發(fā)現(xiàn)ERRα表達時序性與成熟型肌絲蛋白，如cTnI及αMHC相同。而與胚胎型ssTnI及βMHC趨勢相反。提示我們其可能參與這些下游肌絲蛋白亞型轉(zhuǎn)換。

為了進一步探討肌絲蛋白亞型轉(zhuǎn)換的可能機理，檢測了各個基因啟動子區(qū)域組蛋白H3乙?；健＝M蛋白乙?；鳛橹匾霓D(zhuǎn)錄調(diào)控因素[15-17]，其動態(tài)調(diào)控染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，進而影響基因轉(zhuǎn)錄活性[18-21]。我們發(fā)現(xiàn)，cTnI啟動子乙?；脚c之表達水平正相關(guān)，提示組蛋白乙?；赡茉谄浔磉_中具有重要作用。然而其在ssTnI、αMHC及βMHC啟動子區(qū)域則則各個發(fā)育時間點間無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。提示可能有其他機制參與這些基因動態(tài)表達。

ERRα是ERR重要亞型之一[22-23]，有研究顯示其心臟特異性敲除可導(dǎo)致胚胎心臟發(fā)育異常，線粒體功能及結(jié)構(gòu)紊亂[5,24-25]。我們對其是否能夠直接調(diào)控肌絲蛋白亞型轉(zhuǎn)換進行了初步驗證。我們數(shù)據(jù)提示，ERRα可直接結(jié)合與ssTnI及cTnI啟動子區(qū)域，同時期結(jié)合水平與二者表達時序性一致，提示在肌鈣蛋白I亞型轉(zhuǎn)換中，ERRα可能扮演重要角色。鑒于cTnI啟動子組蛋白乙酰化水平的時序規(guī)律，我們推測組蛋白乙酰化可能介導(dǎo)了ERRα動態(tài)調(diào)控cTnI在心臟發(fā)育及成熟過程中的時許表達。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果提示，在心肌細胞發(fā)育及成熟過程中，ERRα可能直接參與調(diào)控肌鈣蛋白Ⅰ亞型轉(zhuǎn)換，而組蛋白乙酰化可能介導(dǎo)了ERRα與cTnI啟動子的結(jié)合，并參與其調(diào)控，盡管ERRα亦直接調(diào)控ssTnI，但組蛋白乙?；⒉皇瞧渲虚g關(guān)鍵環(huán)節(jié)。同時ERRα與肌球蛋白重鏈亞型轉(zhuǎn)換存在相關(guān)性，但其并不直接參與其轉(zhuǎn)錄表達，故還需要更多研究進一步明確其潛在機制。