基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接探討溫陽通絡(luò)方治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用機制*

汪宗清 侯衛(wèi) 聶紅科 宋娜 王興強 湯小虎, 彭江云,

(1.云南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,云南 昆明 650032;2.云南中醫(yī)藥大學(xué),云南 昆明 650500)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)屬于全身性、自身免疫性炎癥性疾病，其基本病理表現(xiàn)為滑膜炎和血管翳的形成，并逐漸出現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨和骨破壞，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和功能喪失，嚴重影響患者生存質(zhì)量[1]。RA屬于中醫(yī)學(xué)“痹證”范疇[2]，《素問·痹論》言:“風(fēng)寒濕三氣雜至，合而為痹也?！眳巧淌谡J為“陽虛邪湊”為痹證的關(guān)鍵病機，常風(fēng)寒濕三痹合治，以散寒為主要治法，溫陽益腎、活血通絡(luò)為輔，兼具祛邪通陽和補虛扶陽，兩者相得益彰，并廣泛應(yīng)用于RA的臨床診治中。

吳生元教授為國家級名老中醫(yī)、云南省已故名中醫(yī),著名扶陽學(xué)派代表人物吳佩衡的學(xué)術(shù)傳人。溫陽通絡(luò)方(蠲痹顆粒)為吳生元教授在繼承云南吳氏扶陽流派學(xué)術(shù)思想的基礎(chǔ)上，結(jié)合多年治療痹證的臨床經(jīng)驗，以桂枝附子湯合麻黃附子細辛湯為基礎(chǔ)，化裁擬定而成，全方由附子、桂枝、細辛、麻黃、羌活、獨活、青風(fēng)藤、透骨草、五加皮、赤芍、川芎、薏苡仁12味中藥組成，具有溫陽散寒，活血通絡(luò)之功，現(xiàn)作為云南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院有效院內(nèi)制劑，在云南20余家醫(yī)院廣泛使用。多年的臨床實踐研究及動物實驗研究表明，溫陽通絡(luò)方對RA具有良好的臨床療效及安全性[4-9]，但目前尚缺乏系統(tǒng)的研究。因此，基于前期臨床及動物研究基礎(chǔ)，本文運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接的研究方法，以求更為全面了解溫陽通絡(luò)方的機制，為其更加深入的機制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1數(shù)據(jù)庫與軟件 數(shù)據(jù)庫和軟件主要包括:TCMSP數(shù)據(jù)庫(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)、Pubchem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)、Uniport數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org/)、STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)、GO數(shù)據(jù)庫(http://geneontology.org/)、KEGG數(shù)據(jù)庫(https://www.kegg.jp/)、Venny(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)、RSCB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/)、Cytoscape3.7.2軟件、R3.6.2軟件、Chem3D 18.0軟件、AutoDock Tool 1.5.6軟件、AutoDock Vina 1.1.2軟件、pymol 3.7軟件、LigPuls軟件。

1.2溫陽通絡(luò)方的化學(xué)成分 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索溫陽通絡(luò)全方附子、桂枝、細辛、麻黃、羌活、獨活、青風(fēng)藤、透骨草、五加皮、赤芍、川芎、薏苡仁12味所有化學(xué)成分，刪選條件為口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18、藥物對小腸上皮細胞穿透性(Caco-2)≥-0.4[10]。在“Related Targets”欄目檢索并篩選溫陽通絡(luò)方有效活性成分的作用靶點，最后將篩選得到的所有靶點均經(jīng)Uniport數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)化成蛋白質(zhì)ID格式，以便于后續(xù)處理分析。

1.3RA相關(guān)靶點的獲取及與溫陽通絡(luò)方靶點的映射 通過GeneCards數(shù)據(jù)庫以“rheumatoid arthritis”作為檢索詞獲取疾病相關(guān)靶點，篩選條件為Relevance score≥10，將溫陽通絡(luò)方靶基因與RA相關(guān)基因用R軟件進行映射，篩選出共同靶基因，利用R軟件制作韋恩圖。

1.4活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用Cytoscape 3.7.2軟件，將上述得到的活性成分、共同靶基因數(shù)據(jù)導(dǎo)入軟件中，制作“活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖”，并計算其Degree值，篩選出核心成分。

1.5蛋白互相作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與核心靶點的分析 將共同靶基因數(shù)據(jù)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫，物種選擇為“Homo Sapience”進行PPI網(wǎng)絡(luò)互作圖，設(shè)置連接評分最小值為0.700，刪除游離的節(jié)點，獲得蛋白互作關(guān)系，導(dǎo)出TSV文件，導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件中，計算各主要蛋白之間的互作次數(shù)，并據(jù)此找到核心靶點。

1.6基因本體(GO)功能富集京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析 將共同靶基因轉(zhuǎn)換成entrezID。然后在R軟件安裝“clusterProfiler”包，根據(jù)已轉(zhuǎn)換的entrezID，以P<0.05進行關(guān)鍵靶基因的GO和KEGG功能富集分析，GO富集分析又包括生物過程(biological process，BP)、分子功能(molucular function，MF)和細胞組分(cellular component，CC)3個分支。結(jié)果以條形圖和氣泡圖形式展示。

1.7分子對接驗證 以溫陽通絡(luò)方主要活性成分以及傳統(tǒng)治療藥物甲氨蝶呤、來氟米特、醋氯芬酸作為配體，以PPI網(wǎng)絡(luò)中Degree>20的核心靶點作為受體。

配體準備：通過PubChem數(shù)據(jù)庫下載排名前五的活性成分以及3個傳統(tǒng)治療RA藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，保存為SDF文件，導(dǎo)入Chem3D 18.0軟件，進行MM2力場進行構(gòu)象優(yōu)化，將其轉(zhuǎn)換為mol2格式，利用AutoDock Tool 1.5.6軟件對其進行加氫、加電荷處理，并保存為pdbqt格式。

受體準備：通過RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/)下載排名前10的靶蛋白結(jié)構(gòu)式的PDB格式文件，并利用Pymol軟件除去靶蛋白中水分子及復(fù)合配體，以pdb格式保存，再通過AutoDock Tool 1.5.6軟件對其包括加氫、加電荷等，并保存為pdbqt格式。

對接參數(shù)準備：通過AutoDock Tool 1.5.6軟件中的“grid”設(shè)置網(wǎng)格大小和相應(yīng)的位置以初步確定成分和靶蛋白相結(jié)合的位點。

對接：將準備好的蛋白文件、配體文件、化合物文件以及腳本放入相應(yīng)文件夾，利用AutoDock Vina(v1.1.2)進行分子對接。

分析：選取結(jié)合能最低的最優(yōu)結(jié)合模式利用PyMOL和LigPuls軟件作圖分析。

2 結(jié)果

2.1溫陽通絡(luò)方活性成分和潛在靶點 通過篩選條件，從TCMSP數(shù)據(jù)庫中共獲得溫陽通絡(luò)方119個活性成分。其中附子16個、桂枝7個、細辛8個、麻黃21個、羌活12個、獨活8個、青風(fēng)藤6個、透骨草3個、五加皮3個、赤芍20個、川芎6個、薏苡仁9個。整合TCMSP數(shù)據(jù)庫預(yù)測，以及通過Uniprot數(shù)據(jù)庫校正去重，共獲得383個化合物相關(guān)潛在靶點。

2.2RA相關(guān)基因 在Genecards數(shù)據(jù)庫中共找到4157個RA相關(guān)基因，評分排名前10的靶點分別是白細胞介素6(IL-6)、人類白細胞抗原組織相容復(fù)合物DRβ1(HLA-DRβ1)、腫瘤壞死因子(TNF)、蛋白酪氨酸磷酸酶非受體型22(PTPN22)、白介素2受體α(IL2Ra)、白細胞介素10(IL-10)、信號傳導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子4(STAT4)、4型肽精氨酸轉(zhuǎn)亞胺基酶(PADI4)、巨噬細胞遷移抑制因子(MIF)、白細胞介素1β(IL-1β)，根據(jù)Relevance score≥10進行篩選，共獲得425個相關(guān)基因，與溫陽通絡(luò)方活性成分潛在靶點對比，共有57個共同基因，韋恩圖(圖1)，通過與溫陽通絡(luò)方的119個活性成分匹配后，得到52個具有治療RA作用的活性成分。

圖1 活性化合物-疾病交集基因韋恩圖

2.3化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將52個活性成分及57個交集靶點數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，構(gòu)建成分靶點網(wǎng)絡(luò)圖，并刪除與網(wǎng)絡(luò)圖連接不緊密的節(jié)點，結(jié)果見圖2。圖中黃色為藥物與疾病共同基因，綠色表示溫陽通絡(luò)方中能與這些基因反應(yīng)的有效成分，并對該網(wǎng)絡(luò)圖中的每個節(jié)點的Degree進行分析。Degree在活性成分節(jié)點表示該活性成分所對應(yīng)的靶點個數(shù)，這意味著Degree值越大，在治療RA的過程中所發(fā)揮的作用也越大?？傻贸銮?位核心成分為槲皮素(quercetin)、木犀草素(luteolin)、山柰酚(kaempferol)、黃芩素(baicalein)、去氧烏頭堿(deoxyaconitine)分別能與37、19、15、10、9個關(guān)鍵靶點連接，其中對治療RA具有重要的意義，具體見表1，選取Degree≥3的活性成分進行展示。

圖2 活性成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)

表1 關(guān)鍵化合物的基本信息(Degree≥3)

續(xù)表1 關(guān)鍵化合物的基本信息(Degree≥3)

2.4核心靶點互作圖 將57個共同靶基因?qū)隨tring數(shù)據(jù)庫中，刪除游離的靶點5個，將蛋白互作文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件獲得蛋白互作圖，見圖3，圖中圓形節(jié)點表示每個基因蛋白，顏色由深變淺、圖案由大變小映射degree由大變小，由圖可見白介素6(IL6)，白介素1β(IL1β)，CC趨化因子(CCL2)，前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(PTGS2)、絲裂原活化蛋白激酶8(MAKP8)，血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)，絲氨酸蛋白激酶1(AKT1)，原癌基因(JUN)，絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)，細胞間黏附分子-1(ICAM1)，基質(zhì)金屬蛋白酶9((MMP9)，信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子1(STAT1)等基因排名靠前，這些度值較大的節(jié)點在整個網(wǎng)絡(luò)中起著關(guān)鍵的作用，可能是溫陽通絡(luò)方治療RA的關(guān)鍵靶點，其基本信息見表2。

圖3 溫陽通絡(luò)方靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

表2 PPI中的核心基因(degree≥10)

2.5GO功能富集分析與KEGG通路富集分析 使用R軟件對57個共同靶點進行GO功能富集分析，其中生物學(xué)過程1399條，分子功能60條，細胞組成22條，在生物過程中對脂多糖的調(diào)節(jié)(response to lipopolysaccharide)、對細菌起源的分子的反應(yīng)(response to molecule of bacterial origin)、金屬離子反應(yīng)(response to metal ion)、抗氧化反應(yīng)(response to oxidative stress)等排名靠前；在細胞組分中胞膜窯(caveola)、質(zhì)膜筏(plasma membrane raft)、細胞膜膜筏(membrane raft)、膜微區(qū)(membrane microdomain)、膜區(qū)(membrane region)、黏著斑(focal adhesion)、細胞基質(zhì)黏著小帶(cell-substrate adherens junction)和細胞-基質(zhì)結(jié)(cell-substrate junction)比例最大；而在分子功能中與細胞因子受體結(jié)合(cytokine receptor binding)和細胞因子活性(cytokine activity)關(guān)系最密切，具體結(jié)果見圖4a/4b/4c。

圖4a GO通路富集分析的BP分析氣泡圖(前20)

圖4b GO通路富集分析的CC分析氣泡圖(前20)

圖4c GO通路富集分析的MF分析氣泡圖(前20)

通過KEGG分析結(jié)果顯示共有123條KEGG代謝通路參與其中，篩選出富集基因數(shù)較多的前20條通路，主要涉及AGE-RAGE信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、IL-17信號通路、流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化、松弛素信號通路、美洲錐蟲病、Th17細胞分化、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等。通路上靶點基因越多，提示溫陽通絡(luò)方可能通過調(diào)控該信號通路從而起到治療作用。涉及炎癥反應(yīng)、細胞凋亡與免疫調(diào)節(jié)等多個環(huán)節(jié)，提示溫陽通絡(luò)方通過調(diào)節(jié)多種代謝通路共同發(fā)揮治療RA的作用。

圖5 KEGG通路富集分析柱狀圖(前20)

2.6分子對接結(jié)果 將PPI網(wǎng)絡(luò)中排名前10的靶點蛋白分別與甲氨蝶呤、來氟米特、醋氯芬酸和前5位活性成分進行分子對接驗證，結(jié)果見表3。若結(jié)合能<0，表明配體分子均能和受體蛋白自發(fā)地結(jié)合，結(jié)合能<-5.0 kJ·mol-1，表明其結(jié)合性好，結(jié)合能越小對接越好[11]。表中所有活性成分均能與靶點蛋白較好地結(jié)合，且91.67%的活性成分結(jié)合性好于醋氯芬酸，85%的結(jié)合性好于來氟米特，30%的結(jié)合性好于甲氨蝶呤，雖然甲氨蝶呤與各關(guān)鍵靶點結(jié)合性能比溫陽通絡(luò)方核心成分好，但結(jié)果并無明顯差距。通過對比發(fā)現(xiàn)，槲皮素與木犀草素與各靶點結(jié)合能大部分優(yōu)于其他化合物，其中，luteolin與MMP9結(jié)合性(-10.7 kJ·mol-1)最好，通過pymol可視化分析可見，木犀草素與MMP9活性位點Gln227、Ala189、Leu188、Met247形成了4個較強的氫鍵相互作用，木犀草素上的苯環(huán)與HIS226殘基形成了π-π堆積作用，這是促使其結(jié)合到活性位點的主要作用力，以及與周圍其他殘基的疏水作用進一步穩(wěn)定了化合物與蛋白之間的結(jié)構(gòu)，見圖6。

表3 溫陽通絡(luò)方核心化合物以及臨床治療RA藥物與關(guān)鍵靶點的結(jié)合親和力

圖6 A：木犀草素與MMP9分子對接三維圖；B：木犀草素與MMP9分子對接二維圖

3 討論

溫陽通絡(luò)方具有溫經(jīng)散寒、祛風(fēng)除濕、通絡(luò)止痛之功，主治風(fēng)寒濕痹型RA?！夺t(yī)宗必讀·痹》云：“治痛痹者散寒為主，疏風(fēng)燥濕，仍不可缺，大抵參以補火之劑，非大辛大溫，不能釋其凝寒之害也”。方中附子辛、甘、大熱，溫陽散寒除濕而止痹痛；桂枝、細辛、麻黃辛、溫，祛風(fēng)散寒，溫經(jīng)通絡(luò),并助附片溫陽散寒之功；川芎辛溫，活血通絡(luò)止痛；赤芍性苦、微寒，入血分，有活血化瘀通絡(luò)之效，透骨草、青風(fēng)藤、五加皮、羌活、獨活等藥祛風(fēng)除濕，止一身之痹痛，薏苡仁健脾滲濕除痹。該方治療RA的臨床療效已被廣泛認可，具有良好的抗炎作用、免疫抑制功效及良好的安全性，但具體機制不甚明確。有研究發(fā)現(xiàn)，其對RA的治療作用可能通過干預(yù)Th17分化所需的關(guān)鍵細胞因子及轉(zhuǎn)錄因子的表達，抑制IL17A等促炎因子的分化而降低其高致病性，阻止CD4+T細胞向高致病性Th17細胞分化，同時通過減少IL6的表達，上調(diào)具有免疫抑制功能Treg細胞的表達等方面，從而阻止或延緩了RA的發(fā)展與轉(zhuǎn)歸[12-13]。以往的研究為本文提供了線索及基礎(chǔ)，但尚不全面，隨著系統(tǒng)生物學(xué)的推廣，基于大數(shù)據(jù)的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)已成為分析復(fù)雜成分的中藥方劑作用機制的重要方法。

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，溫陽通絡(luò)方的活性成分119個化合物，可在體內(nèi)作用于383個靶點，進一步分析發(fā)現(xiàn)，在排名靠前5的活性成分中，有4個均屬于黃酮類化合物，包括槲皮素、木犀草素、山柰酚、黃芩素，黃酮類化合物是最豐富的酚類，在抗黃嘌呤氧化酶活性、免疫調(diào)節(jié)[14]等方面均具有顯著效果，槲皮素作為作用靶點(37個)最多的化合物，可顯著抑制關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)，通過抑制NF-κB的生物活性，減少Th17分化及IL1β、IL17、TNF-α的蛋白表達，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)、抑制滑膜細胞的異常增殖與環(huán)氧合酶活性等，從而起到消炎鎮(zhèn)痛、抑制骨損傷的效果[15-16]；木犀草素可下調(diào)TLR/MyD88/NF-κB信號通路，進而抑制下游炎癥因子IL1β、IL6、TNF-α的表達[17]；黃芩素能抑制IL1β誘導(dǎo)的RAFLS增殖、NF-κB轉(zhuǎn)錄活性和MIF介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)[18]；而去氧烏頭堿則具有顯著的鎮(zhèn)痛抗炎活性[19]，以上核心成分可能作為溫陽通絡(luò)方治療RA的主要藥效群。

通過對交集基因進行PPI互作分析發(fā)現(xiàn)，IL6、IL1β、CCL2、PTGS2、MAKP8、MAPK1、VEGFA、AKT1、JUN、ICAM1、MMP9等為關(guān)鍵基因。白介素家族是一類最龐大、最重要的細胞因子，在機體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用，大量研究表明炎癥相關(guān)的細胞因子及趨化因子在RA的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用，IL6和IL1是RA病程中主要的炎癥介質(zhì)，其主要致病作用包括促進炎癥相關(guān)的B細胞和Th17細胞的分化以及急性期蛋白的合成，通過多種過程驅(qū)動RA的病理生理進程[20]；MAPK基因參與的信號通路可減少氧自由基，抑制細胞增殖并促凋亡，減少炎癥反應(yīng)，同時減輕HIF-1α介導(dǎo)的血管生成，從而有效延緩RA進展[21]；有研究發(fā)現(xiàn)MMP-9表達蛋白水平與RA病情進展緊密關(guān)聯(lián)，其能夠較好反應(yīng)病程進展程度，與RF、TNF-α、IL17具有顯著相關(guān)性[22]；VEGF基因與KDR基因參與血管新生及NF-κB信號通路，調(diào)控滑膜細胞增殖凋亡，及血管翳形成[23]；在GO功能富集生物過程中，對脂多糖的調(diào)節(jié)、對細菌起源的分子的反應(yīng)、抗氧化反應(yīng)列前三位，細菌脂多糖作為革蘭陰性菌的重要致病因子，能引起多種炎癥反應(yīng)。在溫陽通絡(luò)方治療RA可能是作用于以上交集基因，從而抑制炎性反應(yīng)、抗氧化反應(yīng)等多種生物學(xué)功能來起到治療效果。

在KEGG通路富集結(jié)果中，其通路包括AGE-RAGE信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、IL17信號通路、流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化、松弛素信號通路、美洲錐蟲病、Th17細胞分化、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等，其中Th17細胞分化，IL17信號通路為蠲痹顆粒治療RA關(guān)鍵通路，與前期實驗研究相互印證，AGE-RAGE信號通路通過引起氧化應(yīng)激反應(yīng)與激活NF-κB[24]，誘發(fā)一系列炎癥級聯(lián)反應(yīng)，破壞髓鞘、細胞骨架等蛋白[25]，骨細胞能感應(yīng)液體流動產(chǎn)生的剪切應(yīng)力而產(chǎn)生破骨和成骨的信號，并通過樹突將信號傳遞給骨表面的成骨細胞和破骨細胞，從而調(diào)節(jié)骨骼重建[26]，而流體剪切應(yīng)力又間接導(dǎo)致動脈粥樣硬化，使關(guān)節(jié)局部淤阻。腫瘤壞死因子作為一種關(guān)鍵的細胞因子，可以誘導(dǎo)廣泛的細胞內(nèi)信號通路，包括細胞凋亡、炎癥和免疫，靶向TNF抑制劑(如英夫利昔單抗、阿達木單抗等)對RA的治療良好的臨床療效也進一步驗證了該因子及其通路在RA中的重要地位。

分子對接顯示關(guān)鍵靶點與溫陽通絡(luò)湯中槲皮素、木犀草素、山柰酚、黃芩素、去氧烏頭堿5種有效成分能穩(wěn)定結(jié)合，且與傳統(tǒng)治療RA藥物類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、來氟米特、醋氯芬酸結(jié)合能相當(dāng)，這些有效成分有望成為治療RA的潛在藥物。

綜上所述，本文運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接的方法，初步探討了溫陽通絡(luò)方治療RA的潛在物質(zhì)基礎(chǔ)及可能的作用機制。結(jié)合前期的研究成果及分子對接結(jié)果，可以部分地驗證本研究預(yù)測結(jié)果的正確性，也為進一步機制研究和擴大臨床適應(yīng)范圍指出了較可靠的研究方向。但數(shù)據(jù)庫中納入的信息有一定的局限性，可能對研究結(jié)果有一定的影響。因此，溫陽通絡(luò)方對治療RA的作用機制還需待進一步實驗及臨床驗證。