不同脂肪源飼料對斑馬魚elovl5、elovl2和fads2 在高度不飽和脂肪酸合成中的作用影響

王玉梅，任天應，高堅,2

1.華中農業(yè)大學水產學院，武漢 430070； 2.農業(yè)動物遺傳育種與繁育教育部重點實驗室，武漢 430070

高度不飽和脂肪酸(highly unsaturated fatty acids,HUFA)是雙鍵數(shù)有2個或2個以上并且碳原子數(shù)有20個或20個以上的一類多烯直鏈脂肪酸。由于人體內無法自身合成HUFA，必須從食物中攝取，因此，HUFA被稱為必需脂肪酸[1]。HUFA作為必需脂肪酸在維持哺乳動物的正常生命活動中有著不可替代的作用。研究表明，HUFA在機體抵抗炎癥過程中必不可少[2]，同時，HUFA對抑制心腦血管疾病的產生，以及在抵抗癌細胞增殖擴散等疾病的治療中發(fā)揮重要作用[3-4]。

目前，水產品是人類獲取DHA的主要來源。海水魚類普遍比淡水魚類具有更多含量的HUFA，但海水魚體內的DHA主要通過食物鏈富集而來，而淡水魚類可以通過自身合成DHA。因此，如何提高淡水魚HUFA含量具有重要研究價值。斑馬魚作為淡水魚的經(jīng)典模式生物，與人類基因組具有高度同源性，且發(fā)育迅速、生長周期短，因而在諸多脂質代謝的研究中都有應用[5-6]。

研究表明，脂肪酸碳鏈的延長和去飽和是HUFA合成的關鍵步驟[7]，該過程主要由脂肪酸延長酶2(elongase of very long chain fatty acids 2,elovl2)、脂肪酸延長酶5(elongase of very long chain fatty acids 5,elovl5)和脂肪酸去飽和酶2(desaturase of very long chain fatty acids 2,fads2)參與[8]。elovl2能將C20HUFA延長到C22HUFA[9]。研究表明，在小鼠中，elovl2敲除后血清中C22HUFA含量降低，尤其是C22:6n-3(DHA)含量會顯著減少，使得雄性小鼠精子發(fā)育異常導致不育[10]。Monroig等[8]從斑馬魚中克隆出elovl5基因，并證明elovl5能將C18PUFA延長至C20HUFA，也具有延長C20HUFA至C22HUFA的能力，這與elovl2的功能具有相似之處。然而，目前對elovl5的研究主要集中在海水魚中，在淡水魚elovl5的研究較少。魚類Δ4、Δ5、Δ6、Δ8去飽和作用都屬于fads2基因[11]。不同魚類fads2具有不同的去飽和酶活性[12]。

筆者所在實驗室分別對斑馬魚elovl2、elovl5和fads2在HUFA合成中的作用進行了探究[13-14]。研究結果表明，敲除斑馬魚elovl5出現(xiàn)C18PUFA含量降低、C20HUFA含量升高[13]。elovl5和fads2具有不同的生理功能，在我們前期研究中，elovl5主要將C18:3n-3(ALA)和C18:2n-6(LNA)分別延長至C20:3n-3和C20:2n-6，然而缺失elovl5的斑馬魚并沒有出現(xiàn)ALA和LNA累積[13]，我們推測ALA和LNA可能是通過fads2的Δ6作用將ALA和LNA分別轉變?yōu)镃18:4n-3和C18:3n-6。在作為elovl5和fads2的脂肪酸底物ALA和LNA的合成中，elovl5缺失后，fads2是否會起到替補合成作用，elovl5和fads2是競爭底物的關系還是互相替補合成的關系都需要進行深入探究。

為此，本研究利用CRISPR/Cas9技術成功構建了不同敲除型斑馬魚，即elovl5-/-(以下簡稱E5-/-組)、elovl2-/-×elovl5-/-(以下簡稱E2-/-×E5-/-組)、elovl5-/-×fads2-/-(以下簡稱E5-/-×F2-/-組)、elovl2-/-×elovl5-/-×fads2-/-(以下簡稱E2-/-×E5-/-×F2-/-組)。通過對投喂不同飼料的突變體進行脂肪酸組成分析和實時熒光定量，探究斑馬魚敲除elovl5后缺失elovl2和fads2在HUFA合成中的影響，旨在為更好地闡釋elovl2、elovl5和fads2在HUFA合成中的相互作用機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用魚由國家斑馬魚資源中心(中國武漢)提供，成魚雌雄分別飼養(yǎng)于循環(huán)水系統(tǒng)中，系統(tǒng)條件如下：水溫為(28±0.5) ℃，pH值為7.6±0.1，光照周期為14 h光照(08:00-22:00)/10 h黑暗(22:00-08:00)。每天用孵化的豐年蟲投喂3次。試驗中斑馬魚自然受精的卵在28 ℃恒溫過濾水中孵化，受精后5 d投喂經(jīng)紗網(wǎng)過濾的蛋黃，受精后10 d開始投喂豐年蟲。

1.2 敲除模型的構建

試驗中繁殖用到的單基因elovl2、elovl5和fads2以及E2-/-×E5-/-組純合突變體均來自筆者所在實驗室，具體敲除及構建過程參考文獻[13-14]。E5-/-×F2-/-組和E2-/-×E5-/-×F2-/-組的構建流程如圖1所示，對基因elovl2、elovl5和fads2互相雜交后獲得雜合子，而雜合子間自交后經(jīng)篩選獲得純合突變體。各純合突變體在形態(tài)上與野生型(wild type,WT)斑馬魚沒有區(qū)別，雄雌都可育。

1.3 RNA提取

用Primer Premier 6軟件設計斑馬魚熒光定量引物，引物序列見表1。用Trizol法提取各類基因型斑馬魚的RNA，具體步驟參考筆者所在實驗室已發(fā)表文章[13-14]。

1.4 不同脂肪源飼料的制作及試驗取樣

采用商品飼料(粗蛋白≥35%，粗脂肪≥3%，粗灰分≤12%)經(jīng)破碎、索氏抽提法乙醚脫脂后，分別添加大豆油(SO)和亞麻芥油(CO)制粒并烘干制成的飼料。油脂添加量為7%，不同飼料脂肪酸組成見表2。試驗飼料置于-20 ℃冰箱保存。本試驗所用各基因型2月齡以上雄性斑馬魚共300尾，初始試驗魚體質量選擇在每尾(0.25±0.03) g，所用循環(huán)水系統(tǒng)缸數(shù)為30缸。每種飼料每種基因型有3個平行缸，每缸放置10尾。投喂試驗開始前饑餓1 d并稱體質量。每天定量投喂3次，時間分別為08:00、13:00和18:00，每次投喂飼料質量為缸內魚體總質量的3%。每天記錄斑馬魚的攝食和死亡情況，試驗持續(xù)4周。4周后饑餓1 d再進行取樣。取樣時，測量每尾斑馬魚的體質量。從每缸隨機取3尾魚的肝臟，用于提取RNA和分析表達變化；從每缸任意取9尾斑馬魚肝臟混合后保存在-80 ℃冰箱，用于脂肪酸分析。

1.5 斑馬魚肝臟脂肪酸分析

飼料脂肪酸及肝臟組織脂肪酸的測定通過Li等[15]描述的方法進行甲酯化，使用氣相色譜儀(GC-2010 Plus)鑒定和定量脂肪酸種類。每種脂肪酸含量計算公式為：脂肪酸含量組成百分比=該種脂肪酸出峰面積/總脂肪酸出峰面積×100%。

1.6 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)以平均值±標準誤差(mean±SD)表示，采用SPSS18.0軟件進行單因素方差分析(One way ANOVA)，用LSD和Duncan’s多重比較分析確定各試驗組間差異的顯著性，P<0.05則認為是顯著的。采用Prism 8.0.2軟件作圖。

WT:野生型 Wild type; 自交：Selfing.

圖1 斑馬魚不同基因的KO模型示意圖

Fig.1 Zebrafish different knockout (KO) genotypes maps

表1 PCR和熒光定量PCR引物序列 Table 1 Primers sequence used for PCR and qPCR

表2 飼料脂肪酸組成(占總脂肪酸的百分比) Table 2 Fatty acid composition(percentage of total fatty acids)of experimental diets %

續(xù)表2 Continued Table 2

2 結果與分析

2.1 斑馬魚敲除型的構建

經(jīng)過4周投喂試驗，各組魚體生長性能沒有顯著差異(未提供數(shù)據(jù))。為了研究elovl2、elovl5和fads2在斑馬魚HUFA合成中的功能，使用SO飼料和CO飼料進行投喂試驗，分析不同突變型斑馬魚的肝臟脂肪酸組成變化，結果見表3。脂肪酸分析結果顯示，SO飼料中主要脂肪酸為LNA。在投喂SO飼料后，與WT組相比，E5-/-組的C18:2n-6未顯著變化，而E5-/-×F2-/-組和E2-/-×E5-/-×F2-/-組LNA出現(xiàn)了顯著累積。相反，在E2-/-×E5-/-組LNA出現(xiàn)了顯著降低。此外，與WT組相比，4組突變類型的EPA含量都顯著升高。相較于WT組，E5-/-×F2-/-組和E2-/-×E5-/-×F2-/-組的DHA顯著降低，但E2-/-×E5-/-組的DHA含量卻顯示顯著升高(圖2)。

2.2 不同脂肪源飼料投喂對敲除型斑馬魚脂肪酸組成的影響

在CO飼料中，ALA是主要脂肪酸。脂肪酸分析結果顯示，相較于WT組，E5-/-×F2-/-組、E2-/-×E5-/-×F2-/-組出現(xiàn)了ALA與LNA的積累，但在E5-/-組和E2-/-×E5-/-組中ALA與LNA呈現(xiàn)顯著降低的結果。與WT相比，E5-/-組DHA明顯增加。同時，E5-/-×F2-/-組和E2-/-×E5-/-×F2-/-組的DHA含量顯著降低。在5組比較中發(fā)現(xiàn)，EPA的含量并沒有明顯差異。此外，E2-/-×E5-/-組的花生四烯酸(C20:4n-6，ARA)以及DHA含量無明顯變化，而ARA含量顯著高于WT組(圖2)。

圖內5組數(shù)據(jù)字母不同表示差異顯著(P<0.05)。下同。Five groups of data have different letters indicating significant difference in the figure(P<0.05).The same as below．

2.3 不同脂肪源投喂對敲除型斑馬魚中HUFA合成相關基因表達的影響

檢測不同突變型斑馬魚肝臟中HUFA合成相關基因(如elovl4a、elovl4b和fads6)的表達變化，如圖3所示。在經(jīng)過CO飼料投喂后，與WT組相比，elovl4a、elovl4b和fads6在各敲除類型中都有明顯上調，除在E5-/-組elovl4b沒有顯著性變化。大豆油飼料投喂后，elovl4a、elovl4b在E5-/-組、E2-/-×E5-/-組和E5-/-×F2-/-組中呈現(xiàn)梯度遞增，而E2-/-×E5-/-×F2-/-組和WT組相比，elovl4a、elovl4b的表達水平?jīng)]有顯著變化。與WT組相比，fads6的表達水平在E5-/-組和E2-/-×E5-/-×F2-/-組沒有顯著性變化，在E2-/-×E5-/-組與E5-/-×F2-/-組中呈現(xiàn)顯著升高。

圖3 不同試驗組斑馬魚肝臟基因表達量Fig.3 Gene expression of zebrafish liver in different experimental groups

3 討 論

與海水魚相比，淡水魚類具有更高的HUFA合成能力[16]。因此，研究淡水魚HUFA生物合成相關機制有利于提高淡水魚HUFA含量，并為建立高營養(yǎng)價值的淡水生物群提供理論基礎。有研究報道，elovl2、elovl5和fads2的缺失或活力低下是造成魚體HUFA生物合成功能較弱、甚至缺失的主要原因[17]，說明elovl2、elovl5和fads2是合成HUFA的關鍵酶。為深入了解elovl2、elovl5和fads2在淡水魚HUFA的合成機理，本試驗構建了elovl5和fads2的雙基因敲除斑馬魚模型以及elovl2、elovl5和fads2三基因敲除斑馬魚模型。用CO飼料和SO飼料分別投喂4周后對4種突變體及WT組的肝臟進行了脂肪酸組成分析和其他與DHA合成相關基因的熒光定量分析。

本研究發(fā)現(xiàn)，盡管CO飼料和SO飼料中不含有DHA含量，但在各突變體仍可以檢測到DHA含量，這表明淡水魚elovl2、elovl5和fads2外還存在其他基因作用HUFA合成。有研究報道，硬骨魚類elovl4可能是通過Sprecher途徑促進DHA的生物合成[18]。在斑馬魚中已有研究發(fā)現(xiàn)elovl4a可以將C20HUFA轉化為C22HUFA，而elovl4b可以使C20HUFA轉化至C36的多烯產物[19]。在本研究中，相對于WT組，除SO飼料投喂的E2-/-×E5-/-×F2-/-組，elovl4a和elovl4b均在各組高表達，從脂肪酸結果分析，在elovl5、elovl2及fads2缺失后elovl4a和elovl4b可能參與了合成DHA的過程，但elovl4a和elovl4b的高表達并沒有使DHA的含量達到正常水平，這也說明elovl4a和elovl4b并不能完全替代elovl2和elovl5在C20HUFA合成DHA過程中的功能。

研究表明，淡水魚elovl5能將C18PUFA延長至C20HUFA，同時也具有延長C20HUFA至C22HUFA的能力[8]，但脂肪酸分析結果顯示E5-/-組中C18PUFA并未出現(xiàn)累積，CO投喂的E5-/-組C18:2n-6和C18:3n-3甚至出現(xiàn)顯著下降，這表明在E5-/-有替代基因在C18PUFA延長至C20PUFA起作用。與我們先前的結果一致[13]，E2-/-×E5-/-組與WT相比DHA含量并沒有出現(xiàn)顯著差異，E2-/-×E5-/-組DHA并沒有降低,說明在C18PUFA延長至C22PUFA出現(xiàn)了“補償基因”，即可能激活別的基因對其產生了“遺傳補償效應”。

脂肪酸組成分析結果顯示，E5-/-×F2-/-組和E2-/-×E5-/-×F2-/-組在CO組和SO組的ALA和LNA都出現(xiàn)顯著累積，關鍵產物ARA和DHA的含量都有顯著降低的現(xiàn)象。E2-/-×E5-/-×F2-/-組與E2-/-×E5-/-組相比，E2-/-×E5-/-×F2-/-組DHA含量顯著降低，延長底物顯著累積。這表明，淡水魚fads2在DHA合成中起到非常重要的作用。

表3 斑馬魚肝臟脂肪酸組成(占總脂肪酸的百分比) Table 3 Fatty acid composition (percentage of total fatty acids) of zebrafish liver

斑馬魚fads6的功能目前未在酵母試驗中得到證實，但有研究報道，fads6在淡水魚中有微弱的Δ4去飽和功能[20]。熒光定量分析結果顯示，fads6在SO飼料投喂的E2-/-×E5-/-組和E5-/-×F2-/-組以及CO飼料投喂的4組突變體中都被誘導表達，但fads6的高表達未能彌補fads2缺失導致的DHA含量下降，說明fads2在HUFA合成中不可或缺，fads2的缺失阻礙了相應HUFA的合成。E2-/-×E5-/-×F2-/-組的碳鏈延長和去飽和功能受到阻礙，這提示我們fads2是在elovl2和elovl5合成HUFA途徑中的必要酶，去飽和酶的作用是不可被替代的。

在SO組中，E2-/-×E5-/-×F2-/-組的elovl4a、elovl4b和fads6的表達都未發(fā)生顯著性變化，這與其在CO組的結果有明顯差異。脂肪酸分析結果顯示，SO飼料投喂后的E5-/-組DHA含量與WT無顯著差異，E5-/-×F2-/-組較WT組DHA含量顯著增加，然而CO飼料投喂后的E5-/-組DHA含量較WT組顯著升高，E5-/-×F2-/-組與WT無顯著差異(表3)。此外，在CO組中，各突變體的EPA含量與WT沒有明顯變化，這表明在底物n-3脂肪酸充足的情況下，EPA含量并不會因為elovl5缺失而發(fā)生變化。EPA含量是否是elovl5缺失后魚體維持新穩(wěn)態(tài)的重要指標，其分子機制還有待研究。

綜上所述，本研究首次構建了elovl5和fads2的雙基因敲除斑馬魚模型以及elovl2、elovl5和fads2三基因敲除斑馬魚模型。本研究數(shù)據(jù)表明，在投喂SO飼料和CO飼料后，在E5-/-組和E2-/-×E5-/-組中，C18PUFA到C20PUFA的延長仍然存在，這可能是“遺傳補償效應”的結果。而E5-/-×F2-/-組和E2-/-×E5-/-×F2-/-組攝食到的ALA和LNA在體內出現(xiàn)累積，表明fads2是elovl2和elovl5參與HUFA合成途徑過程中的必需酶。elovl4和elovl4b會在elovl2、elovl5和fads2缺失后被誘導表達但不足以使脂肪酸恢復至正常水平。這更加突出了elovl2、elovl5和fads2在HUFA合成中的協(xié)同作用，證明了fads2對機體HUFA的合成至關重要。