新梨7號(hào)及其親本果皮揮發(fā)性物質(zhì)的比較分析

向思敏，劉園，王江波，邵建柱， 張紅艷，吳翠云，唐章虎，徐娟

1.園藝植物生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院,武漢430070； 2.南疆特色果樹高效優(yōu)質(zhì)栽培與深加工技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室/塔里木大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院，阿拉爾843300；3.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木盆地生物資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，阿拉爾 843300；4.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，保定071000； 5.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院輪臺(tái)國家果樹資源圃，輪臺(tái)841600

早酥(PyrusbretschneideriRehd ‘Zaosu’)是以蘋果梨(P.bretschneideriRehd ‘Pingguoli’)為母本、身不知(P.communis‘Shenbuzhi’)為父本通過有性雜交培育的適應(yīng)性極強(qiáng)的早熟梨品種，是雜交育種的優(yōu)良骨干親本[1]。庫爾勒香梨(P.sinkiangensis‘Korla’)屬于新疆梨系統(tǒng)，原產(chǎn)新疆庫爾勒地區(qū)，是瀚海梨(P.sinkiangensis‘Hanhai’)和鴨梨(P.bretschneideri)的后代，其果實(shí)香味濃郁，汁多味甘[2]。新梨7號(hào)(P.sinkiangensis‘Xinli No. 7’)是塔里木大學(xué)于1985年以庫爾勒香梨作母本、早酥作父本經(jīng)過有性雜交選育而成。在新疆阿克蘇地區(qū)表現(xiàn)為大果、綠皮、色澤鮮艷、多汁味甜且早熟[3]。新梨7號(hào)遺傳了父本的早熟性，且較其更早熟15～20 d；同時(shí)，遺傳了母本的優(yōu)良品質(zhì)性狀，如質(zhì)地酥脆、耐貯、清香和陽面紅暈等，且較母本果實(shí)大、果心小[4]。

雜交育種可以將雙親不同的優(yōu)良性狀傳遞給后代，在產(chǎn)量、生長發(fā)育特性、抗逆性、適應(yīng)性和品質(zhì)性狀的優(yōu)化等方面均有很好的表現(xiàn)，提升香氣品質(zhì)也是其中的研究熱點(diǎn)之一。怡人的香氣有利于吸引消費(fèi)者購買水果，隨著國際市場(chǎng)對(duì)果實(shí)品質(zhì)的要求越來越高，對(duì)水果中揮發(fā)性物質(zhì)譜的研究也已成為果實(shí)品質(zhì)的重要研究方向[5]。果實(shí)香氣物質(zhì)成分主要包括揮發(fā)性的脂肪酸、氨基酸，以及由次生代謝產(chǎn)生的酯類、醇類、酮類、醛類、萜類和酚類化合物等[6-7]。葡萄中各揮發(fā)性物質(zhì)含量在后代中呈廣泛分離，是多基因控制的數(shù)量性狀，而且香葉醇的表達(dá)在雜交后代中增強(qiáng)[8]。對(duì)甜瓜及其雜交后代的揮發(fā)性成分研究發(fā)現(xiàn)，大部分酯類化合物含量在F1代果實(shí)中居于雙親之間，且偏向于高值親本，而醛類、醇類及其他類化合物在F1代均表現(xiàn)為接近低值親本[9]。寒富蘋果(MaluspumilaMill ‘Hanfu’,母本)與四倍體嘎啦(M.pumilaMill ‘Gala’,父本)雜交產(chǎn)生的后代三倍體蘋果中果實(shí)品質(zhì)均傾向于父本遺傳[10]。張文君等[11]對(duì)不同種間雜交梨果的揮發(fā)性成分進(jìn)行SPME-GC-MS分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，酯類、醛類、烷烴類、酮類、烯烴類及醇類物質(zhì)的種類與含量決定了果實(shí)的香氣差異性。前期研究表明，庫爾勒香梨的揮發(fā)性物質(zhì)以果皮中種類和含量為最高，其中醛類和酯類物質(zhì)含量占總揮發(fā)性物質(zhì)的90%[12-13]。

本研究采用HS-SPME-GC-MS方法，對(duì)庫爾勒香梨和早酥的雜交后代新梨7號(hào)的果皮揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)和比較分析，旨在為后續(xù)探索梨果實(shí)芳香品質(zhì)的形成機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2018年8月1日于河北省保定市競秀區(qū)四臺(tái)村采集“新梨7號(hào)(河北)”商業(yè)成熟期果實(shí)。2018年8月10日于塔里木大學(xué)南疆特色果樹種質(zhì)資源圃采集的“新梨7號(hào)(新疆)”、“庫爾勒香梨”和“早酥”，均為商業(yè)成熟期果實(shí)。鮮果運(yùn)回后每5個(gè)果實(shí)為1組，共3組重復(fù)，用手術(shù)刀將果皮組織分離，于-80 ℃冰箱保存。

1.2 儀器設(shè)備與試劑

氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀TRACE GC U1tra結(jié)合DSQ II mass spectrometer(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)，50/30 μm DVB/CAR on PDMS萃取頭(上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)，DTA-33超聲波清洗機(jī)(鼎泰(湖北)生化科技設(shè)備制造有限公司)，H1850R醫(yī)用離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)公司)。

試劑來源：C10-C40正構(gòu)烷烴混標(biāo)(色譜純，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)；壬酸甲酯(色譜純，上海源葉生物科技有限公司)；氯化鈉(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.3 HS-SPME-GC-MS檢測(cè)揮發(fā)性物質(zhì)

梨揮發(fā)性物質(zhì)的提取和檢測(cè)分析參照文獻(xiàn)[11]進(jìn)行。

頂空-固相微萃取(HS-SPME)：將樣品研磨成粉末，取2.50 g置于15 mL頂空瓶中，加入5 mL 30% NaCl(m/V，含內(nèi)標(biāo)壬酸甲酯0.1 μL/100 mL)，加蓋密封；40 ℃水浴15 min，頂空吸附15 min。

氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)：色譜柱為TRACE TR-5 MS 柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm，Thermo Scientific，Bellefonte，PA，USA)。載氣為高純氦氣(99.999%)，恒流模式，流速1 mL/min。離子源(70 eV)正離子掃描模式，掃描范圍45～400m/z。進(jìn)樣口，離子源和傳輸線的溫度分別為 250、260 和280 ℃。升溫程序?yàn)?0 ℃保持3 min，以 3 ℃/min 的速度升溫至160 ℃并保留 l min，然后以5 ℃/min的速度升溫至200 ℃并保留1 min，最后以8 ℃/min的速度升溫至240 ℃并保留1 min，不分流模式。

通過匹配計(jì)算機(jī)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(NIST05)和計(jì)算保留指數(shù)[12]對(duì)揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行定性分析，并采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行相對(duì)定量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析方法

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析及柱形圖繪制采用Excel(MS office 2016,Microsoft,CA,USA)和GraphPad Prism 5(GraphPad Software Inc.,San Diego,CA,USA)。差異顯著性分析利用SPSS(SPSS 20.0,IBM,NY,USA)的ANOVA程序進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 新梨7號(hào)及其親本揮發(fā)性物質(zhì)種類的變化

新梨7號(hào)及其親本中共檢測(cè)出119種揮發(fā)性成分，其中有酯類23種、烷烴19種、醇類17種、萜烯類16種、醛類14種、脂肪酸9種、芳烴9種、烯烴7種和酮類5種(因數(shù)據(jù)量較大，文中未列出)。

新梨7號(hào)中共檢測(cè)到55(新疆阿拉爾)和53種(河北保定)揮發(fā)性物質(zhì)，父本早酥梨中有56種揮發(fā)性物質(zhì)，母本庫爾勒香梨有100種(表1)。

與父本相比，新梨7號(hào)中的揮發(fā)性物質(zhì)增加了19種，含醛類4種、萜烯類1種、醇類1種、烷烴3種、酯類5種、芳烴1種、烯烴1種和酮類3種；減少了9種，含萜烯類3種、醇類2種、脂肪酸1種、烷烴2種及芳烴1種。

與母本相比，新梨7號(hào)中的揮發(fā)性物質(zhì)增加了11種，含醛類2種、萜烯類1種、烷烴1種、酯類2種、芳烴1種、烯烴1種和酮類3種。減少了41種，含醛類3種、萜烯類6種、醇類10種、脂肪酸8種、烷烴1種、酯類7種、芳烴3種及烯烴3種。

表1 新梨7號(hào)及其親本揮發(fā)性物質(zhì)種類的變化 Table 1 Differences of volatile compounds between ‘Xinli No. 7’ and its parents

2.2 新梨7號(hào)及其親本不同種類揮發(fā)性物質(zhì)含量對(duì)比

新梨7號(hào)揮發(fā)性物質(zhì)總含量及大部分揮發(fā)性物質(zhì)種類含量均介于父母本之間，僅酮類物質(zhì)含量顯著高于其親本(圖1)。

就酮類物質(zhì)而言，新梨7號(hào)較父本新增了2-庚酮、2-癸酮和2-十一烷酮，較母本新增了2-庚酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、2-癸酮和2-十一烷酮。6-甲基-5-庚烯-2-酮和2-壬酮的含量顯著高于其親本。

2.3 新梨7號(hào)及其親本不同種類揮發(fā)性物質(zhì)譜對(duì)比

新梨7號(hào)及其親本的9類揮發(fā)性物質(zhì)譜如圖2所示，新梨7號(hào)的揮發(fā)性物質(zhì)相對(duì)含量分布與親代父本早酥之間具有更高的相似性。

4種梨果中醛類物質(zhì)含量占總揮發(fā)物的58.04%～89.60%。新梨7號(hào)中比例高達(dá)87.30%和89.60%，與父本相似(87.75%)，約為母本的1.5倍。己醛、(E)-2-己烯醛、(E)-4-氧代己-2-烯醛、壬醛和癸醛是4種梨果中共有的揮發(fā)性化合物，提供青香味[14]。(E)-2-辛烯醛僅在新梨7號(hào)中檢出，具有清香味[15]。萜烯類物質(zhì)具有一定的花香味[14]，共鑒定出9種萜烯類物質(zhì)，4種梨果中萜烯類物質(zhì)含量占總揮發(fā)物的0.87%～13.08%。新梨7號(hào)中占比為0.86%和1.00%，與父本的相對(duì)含量相似(1.23%)，僅為母本的0.06倍。醇類物質(zhì)的含量占總揮發(fā)物的1.10%～9.46%。新梨7號(hào)中的醇類物質(zhì)占比均接近低值親本父本早酥。酯類物質(zhì)是提供果實(shí)主要香氣的物質(zhì)之一，大多具有果香味。4種梨果酯類物質(zhì)含量占總揮發(fā)物的0.92%～3.20%。在新梨7號(hào)梨果中(E)-3-己烯-1-醇乙酸酯、乙酸己酯含量較高，分別具有果香和藥草香(http://www.flavornet.org/flavornet.html)。

4種梨果中脂肪酸類物質(zhì)含量占總揮發(fā)物含量的0.02%～6.31%。新梨7號(hào)中脂肪酸占比低于雙親。苯甲酸是4種受檢梨果中唯一共有的脂肪酸類物質(zhì)，新梨7號(hào)中的含量介于父母本之間。

其他揮發(fā)性物質(zhì)種類中，新梨7號(hào)中芳烴相對(duì)含量顯著低于雙親，烯烴的相對(duì)含量介于父母本之間，而酮類的相對(duì)含量顯著高于雙親。

2.4 新梨7號(hào)及其親本主要揮發(fā)性成分的對(duì)比

對(duì)比新梨7號(hào)及其親本梨果中含量最高的7種揮發(fā)性成分(表2)發(fā)現(xiàn)，新梨7號(hào)與父本早酥中有6種揮發(fā)性成分相同，較母本庫爾勒香梨減少了2種萜烯類、1種脂肪酸類和1種烷烴類物質(zhì)。

4種梨果含量最高的揮發(fā)性成分均為己醛和(E)-2-己烯醛，其在新梨7號(hào)中均顯著高于父本早酥梨，偏向于高值親本。而d-檸檬烯的含量偏向于低值的父本早酥。除此之外，新梨7號(hào)中的(E,E)-2,4-己二烯、(Z)-1-乙氧基-4-甲基-2-戊烯和(E)-4-氧代己-2-烯醛的含量顯著高于其雙親，而α-法呢烯顯著低于雙親。

同組不同小寫字母表示經(jīng)鄧肯式新復(fù)極差檢驗(yàn)，差異達(dá)顯著水平(P<0.05)。Different lowercase letters in the same group indicate that the difference has reached a significant level through Duncan’s new multiple range test (P<0.05).

圖2 新梨7號(hào)及其親本揮發(fā)性物質(zhì)相對(duì)含量Fig.2 Relative content of volatile compounds in ‘Xinli No. 7’ and its parents

表2 新梨7號(hào)及其親本主要揮發(fā)性物質(zhì)含量對(duì)比(前7種) Table 2 Comparison of the concentrations of the main volatile compounds in ‘Xinli No. 7’ and its parents (top 7 compounds) μg/kg

續(xù)表2 Continued Table 2

2.5 兩地新梨7號(hào)揮發(fā)性物質(zhì)的對(duì)比

如表3所示，新疆和河北采集的新梨7號(hào)相比，前者樣品中大部分揮發(fā)性物質(zhì)含量顯著高于后者，包括萜烯類、芳烴、醇類和烷烴。大部分不同種類的揮發(fā)性物質(zhì)所包含的物質(zhì)數(shù)相近，僅烷烴類物質(zhì)有差異，河北樣品較新疆樣品減少6種物質(zhì)(表1)。

兩地的大部分揮發(fā)性物質(zhì)含量介于親本之間，且新疆樣品中的萜烯類、烷烴和芳烴類物質(zhì)總量顯著高于河北樣品。

表3 兩地新梨7號(hào)揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)比 Table 3 Comparison of volatile compounds between ‘Xinli No. 7’ in two places μg/kg

3 討 論

3.1 雜交品種新梨7號(hào)揮發(fā)性成分

種間雜交的梨果，品種較新，市場(chǎng)前景較好。張文君等[11]研究了5種雜交梨果及其親本的揮發(fā)性成分，通過聚類分析發(fā)現(xiàn)，受檢梨果主要分為2組，與其雜交親本的親緣關(guān)系基本一致。本研究中，雜交品種新梨7號(hào)的主要揮發(fā)性成分與親本相似。新梨7號(hào)較父母本增加了2種揮發(fā)性物質(zhì)，分別具有青香味和果香(http://www.flavornet.org/flavornet.html)。較母本減少了42種揮發(fā)性物質(zhì)，總含量減少了約51%，損失了多種具有油脂味的脂肪酸和具有花香味的萜烯類物質(zhì)；較父本減少了8種揮發(fā)性成分，包括己酸、順式芳樟醇氧化物、L-樟腦、β-環(huán)檸檬醛、對(duì)苯醌、香葉醇、1-十二烷醇和4,6-二甲基-十二烷，分別具有甜味、樟腦味、薄荷味、中藥味、花香和刺激性異味?？梢酝茰y(cè)其香氣特性較父母本都發(fā)生了較大改變，與實(shí)際上其香氣濃郁度遠(yuǎn)低于庫爾勒香梨的情況相符。但是，揮發(fā)性成分對(duì)果實(shí)香氣的影響主要取決于風(fēng)味閾值[16]，增加或減少的揮發(fā)性成分是否會(huì)影響果實(shí)風(fēng)味，有待進(jìn)一步開展揮發(fā)性成分的呈香閾值分析并設(shè)計(jì)感官評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)來進(jìn)行驗(yàn)證。

需要明確的是，本研究所采用的新梨7號(hào)只是其父母本雜交后代的單株，其他單株在育種過程中因經(jīng)濟(jì)性狀較差、維護(hù)成本高而丟棄。因此，無法總結(jié)出揮發(fā)性物質(zhì)代謝的遺傳規(guī)律，對(duì)呈香相關(guān)物質(zhì)的關(guān)鍵基因挖掘及香氣品質(zhì)形成機(jī)制的研究而言，尚需另尋他法。

3.2 不同產(chǎn)地對(duì)新梨7號(hào)揮發(fā)性成分的影響

即便是同一品種，產(chǎn)地不同則會(huì)產(chǎn)出品質(zhì)不同的果實(shí)，甚至?xí)泻艽蟛町怺17]。在果實(shí)風(fēng)味品質(zhì)方面，變化較大的有可溶性固形物、果實(shí)硬度[18]和揮發(fā)性成分等。李躍紅等[19]對(duì)7個(gè)不同產(chǎn)區(qū)刺梨的果實(shí)品質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，果實(shí)的營養(yǎng)品質(zhì)維生素C含量和非必需微量元素具有較大差異。

本研究收集、分析了相隔較遠(yuǎn)的2個(gè)地點(diǎn)新梨7號(hào)的樣品，可以大體比較不同環(huán)境對(duì)揮發(fā)性物質(zhì)的影響。結(jié)果表明，兩地?fù)]發(fā)性物質(zhì)種類相似，但新疆地區(qū)的新梨7號(hào)果皮中的萜烯類、烷烴和芳烴類物質(zhì)總量更高(http://www.flavornet.org/flavornet.html)。由此可知，新疆地區(qū)種植的新梨7號(hào)揮發(fā)性成分表現(xiàn)更優(yōu)。這可能與新疆的氣候、土壤和水源等因素有關(guān)。魏樹偉等[20]采用頂空進(jìn)樣對(duì)采自山東省的新梨7號(hào)果實(shí)揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，同樣鑒定到較高比例的己醛、(E)-2-己烯醛、1-己醇等物質(zhì)，但總物質(zhì)含量較低，僅為746.61 μg/kg，且僅鑒定到4種萜烯類物質(zhì)，這與其檢測(cè)的樣品組織和揮發(fā)性物質(zhì)的提取方式有關(guān)。同時(shí)，作為同一種基因型，新疆樣品較父母本增加了(E)-2-辛烯醛、1-十二烯、苯甲酸和柏木腦；河北樣品中增加了(E)-2-辛烯醛、苯甲酸、2-庚酮、2-癸酮和1,2,4,5-四甲基-苯。與父母本相比，兩地新梨7號(hào)中有46種揮發(fā)性物質(zhì)變化相似，只有8種物質(zhì)變化有所差異，包括苯乙醛、異佛爾酮、α-法呢烯、1,2-二甲基-苯、1-甲基-4-(1-甲基乙基)-環(huán)己醇、2,6,10-三甲基-十四烷、2,6,11,15-四甲基十六烷和丁酸己酯。這8種揮發(fā)性物質(zhì)中有7種物質(zhì)含量在父母本和新梨7號(hào)中均存在且含量較低，只有α-法呢烯(果香味)僅在河北新梨7號(hào)中存在，而新疆新梨7號(hào)中未檢測(cè)到該物質(zhì)，同時(shí)其在庫爾勒香梨中含量很高。因此，環(huán)境對(duì)新梨7號(hào)的揮發(fā)性物質(zhì)種類和含量都有影響，進(jìn)而影響其香氣品質(zhì)。