生物炭對烤煙成熟期土壤養(yǎng)分及根際細菌群落結(jié)構(gòu)的影響

楊煥煥,李茂森,王麗淵, 馮慧琳,劉福童,杜君,任天寶,高衛(wèi)鍇

1.河南農(nóng)業(yè)大學河南省生物炭研究工程技術(shù)中心，鄭州 450002； 2.河南省農(nóng)業(yè)科學院植物營養(yǎng)與資源環(huán)境研究所/河南省農(nóng)業(yè)生態(tài)與環(huán)境重點實驗室，鄭州 450002； 3.江西省煙草公司宜春市公司，宜春 336000； 4.廣東中煙工業(yè)有限責任公司，廣州 510032

植煙土壤的質(zhì)量直接決定了煙葉的質(zhì)量[1-2]。近些年來，由于大量化肥和農(nóng)藥的施用，土壤養(yǎng)分失衡、次生鹽漬化和酸化現(xiàn)象嚴重，病原菌不斷積累，土壤質(zhì)量和生態(tài)環(huán)境不斷惡化，烤煙成熟期的耐熟性和成熟度受到了很大的影響，造成煙葉品質(zhì)下降，這些問題給煙草的可持續(xù)發(fā)展帶來了極大的挑戰(zhàn)[3]。土壤微生物是土壤物質(zhì)循環(huán)和能量流動的參與者和驅(qū)動者，在土壤環(huán)境中具有重要地位[4]，其對土壤環(huán)境具有極強的敏感性，可以作為評價人為干擾土壤質(zhì)量變化的指標之一[5]。

生物炭是生物質(zhì)在低氧條件下，經(jīng)高溫裂解產(chǎn)生的一種性質(zhì)穩(wěn)定的富碳物質(zhì)[6]。生物炭表面孔隙豐富，有極大的電荷密度和比表面積，生物炭富含活性基團，具有較強的陽離子交換能力，在土壤修復領(lǐng)域發(fā)揮著重要的作用[7-9]。生物炭在自然條件下呈堿性，施入土壤后可以提高酸性土壤pH。馮慧琳等[10]研究了生物炭對土壤酶活和細菌群落的影響及其作用機制，生物炭施用后土壤容重降低，pH值、速效磷、速效鉀、有機質(zhì)含量和碳氮比均升高，且細菌多樣性顯著提升，尤其是增加了芽單胞菌門和變形菌門等促生菌的豐度。閻海濤等[11]研究發(fā)現(xiàn)施加生物炭3 a后顯著提高了土壤pH、含水率、總有機碳(TOC)和總氮(TN)含量,而降低了土壤容重和溶解性有機碳(DOC)含量。曲晶晶等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在土壤中施加秸稈炭可以提高土壤pH和團聚體數(shù)量，并且環(huán)境因子的改變驅(qū)動土壤微生物群落的生態(tài)演替。生物炭通過改變土壤的理化性質(zhì)，增加活性炭源和改善土壤水分環(huán)境，從而影響土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)[13-14]。在土壤中添加生物炭能顯著改變微生物的豐度和群落結(jié)構(gòu)[15]，隨著生物炭施用量的增加，土壤中各類微生物的豐度和群落結(jié)構(gòu)均顯著提高[16-18]，生物炭施加到土壤后可以在短期內(nèi)富集微生物類群[19]。

烤煙成熟期是影響煙葉質(zhì)量的關(guān)鍵時期，因此，探究生物炭對烤煙成熟期煙株根際土壤細菌群落結(jié)構(gòu)和土壤養(yǎng)分變化規(guī)律對優(yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)具有重要的意義。本試驗在江西宜春煙區(qū)進行，在植煙土壤中添加生物炭，采用高通量技術(shù)分析了土壤細菌群落結(jié)構(gòu)和土壤養(yǎng)分變化規(guī)律，以期為烤煙土壤微生態(tài)的調(diào)控和我國優(yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2020年在江西宜春上高煙區(qū)進行，該煙區(qū)為煙稻輪作，植煙土壤均為砂壤土。土壤基本理化性質(zhì)為：土壤pH值5.52，全碳、全氮、全硫含量分別為1.37%、0.17%、0.073%，有機質(zhì)含量為2.31%，堿解氮為97.25 mg/kg，土壤速效磷為25.54 mg/kg，土壤速效鉀105.40 mg/kg。生物炭原料為花生殼，理化性質(zhì)為：比表面積(按過 0.85 mm 孔徑篩計) 16.71 m2/g，容重 0.21 g/cm3，pH 9.05，含碳 465.3 g/kg，全氮 8.30 g/kg，全硫0.83 g/kg，孔體積0.029 m2/g。

1.2 試驗設計

試驗采用隨機區(qū)組設計，共設置2組處理，每組處理設3次重復，小區(qū)長20 m，寬10 m。CK：常規(guī)施肥(純氮為145.0 kg/hm2，m(N)∶m(P2O5)∶m(K2O)= 1∶1∶3)，T：750 kg/hm2生物炭+常規(guī)施肥。4月23日之前將生物炭施入煙田，生物炭料和常規(guī)肥作為基肥一次性施入植煙土壤，施肥方式為條施。各處理的移栽方法、水肥管理、農(nóng)事操作與非試驗田管理一致。

1.3 供試土壤與樣品采集

烤煙生長到成熟期第75天時，根據(jù) 5點取樣法確定取樣點，每個處理取5株煙株根際土壤，收集完成后混勻，一部分保存在 10 mL無菌離心管中，干冰保存，用于進行微生物多樣性檢測，一部分于-4 ℃冰箱保存，用于土壤微生物量的檢測。最后一部分在陰涼處自然風干后研磨，分別過0.85、0.25和0.15 mm篩后于陰涼處保存，進行土壤理化性質(zhì)分析。

1.4 土壤理化指標及養(yǎng)分測定

參照文獻[20]測定土壤理化性質(zhì)，對樣點做平行組。pH的測定采用超純水做浸提劑，按照土水質(zhì)量比1∶2.5浸提，用精密pH計(型號：IS128C)測定；采用火焰光度計法測定土壤速效鉀；土壤有機碳采用濃硫酸-重鉻酸鉀外加熱法測定；土壤速效磷采用碳酸氫鈉浸提法測定；土壤全碳、全氮、全硫含量采用碳氮硫元素分析儀(Vario MAX CNS，德國)測定；堿解氮采用堿解擴散法；微生物量碳氮(MBC、MBN)采用氯仿熏蒸-硫酸鉀浸提法測定[10]。

1.5 煙葉化學成分測定

煙葉常規(guī)化學成分(總氮、煙堿、蛋白質(zhì)、總糖、還原糖、鉀、氯)采用流動分析儀( AutoAnalyzer3) 測定，分別參照YC/T 161—2002《煙草及煙草制品總氮的測定》、YC/T 160—2002《煙草及煙草制品總植物堿的測定》、YC/T 249—2008《煙草及煙草制品蛋白質(zhì)的測定》、YC/T 159—2002《煙草及煙草制品水溶性糖的測定》、YC/T 217—2007《煙草及煙草制品鉀的測定》和YC/T 162—2002《煙草及煙草制品氯的測定進行》。

1.6 土壤微生物檢測

使用E.Z.N.A.?soil試劑盒 (OMEGA)提取土壤DNA，利用NanoDrop2000超微量分光光度計(Thermo Fisher Scientific公司)檢測DNA純度；檢測合格后，用用338F和806R引物進行擴增[21-22]。

使用瓊脂糖回收盒回收PCR產(chǎn)物，混合后送往IlluminaMiSeq平臺平臺進行基因序列測定(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)。

1.7 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2016整理數(shù)據(jù)，方差分析采用最小顯著性差異法以SPSS 22.0軟件分析處理數(shù)據(jù)，用 R軟件的 vegan包進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物炭對烤煙農(nóng)藝性狀的影響

如圖1所示，添加生物炭后煙株株高和中部葉葉寬在移栽后65、85、105 d均大于對照處理，且均達到顯著性差異，株高在3個時期分別提高了3.27%、0.42%和0.63%，生物炭處理煙株中部葉葉寬較對照分別提高了4.15%、4.96%和5.13%。添加生物炭處理莖圍與對照組相比無顯著提高。生物炭處理在移栽后65 d和105 d中部葉葉長較對照分別顯著提高了2.12%和1.96%，表明施加生物炭有利于促進煙株生長。

不同小寫字母表示在0.05水平存在顯著性差異。Different letter means significantly different at 0.05 probability level.圖1 生物炭對煙株不同生育期農(nóng)藝性狀的影響Fig.1 Effects of biochar on agronomic traits of tobacco at different growth stages

2.2 生物炭對土壤主要營養(yǎng)指標的影響

試驗結(jié)果(表1)顯示，與CK相比，施加生物炭的土壤pH顯著提高了9.48%，土壤堿解氮含量提高了10.11%，但與CK沒有顯著差異；施加生物炭處理土壤速效鉀、速效磷和有機碳含量較CK分別提高了11.14%、7.90%和11.76%，均與CK存在顯著差異。說明添加有機碳可以顯著提高土壤pH和養(yǎng)分含量。

表1 不同處理土壤化學性質(zhì) Table 1 Soil chemical properties of different treatments

2.3 生物炭對土壤細菌多樣性的影響

1)生物炭對根際土壤細菌α多樣性的影響。對10個土壤樣本進行細菌檢測(圖2)，共獲得有效序列573 285條。樣品測序覆蓋度為98.11%，測序數(shù)據(jù)量合理。依據(jù)97%序列相似性對所測序列進行聚類分析，10個樣本產(chǎn)生2 459～3 002個OTU，樣本平均OTU數(shù)為2 860.5。施肥與對照處理共有OTU數(shù)3 842，與CK相比，施加生物炭處理處理土壤OUT數(shù)提高了2.28%。

對土壤細菌多樣性指數(shù)(表2)進行分析，CK和T的Shannon指數(shù)分別是6.52和6.60，施加生物炭處理ACE指數(shù)和Chao指數(shù)高于CK處理，表明施加生物炭對土壤微生物群落有一定影響。

2)生物炭對根際土壤細菌群落組成的影響。細菌群落組成測定結(jié)果表明，所有樣本中門水平上共獲得細菌群落44個。如圖3所示，豐度較高的門種類分別為放線菌門(Actinobacteriota)、變形菌門(Proteobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、酸桿菌門(Acidobacteriota)和厚壁菌門(Firmicutes)，相對豐度分別為26.41%～32.43%、22.32%～34.62%、7.86%～15.18%、6.08%～13.99%和3.07%～7.85%，平均相對豐度分別為29.39%、26.65%、12.76%、11.43%和4.37%。其中優(yōu)勢菌為放線菌門、變形菌門、綠彎菌門和酸桿菌門，其相對豐度之和占所有可注釋菌的84.58%以上。

生物炭對不同門細菌豐度的影響不同。對施加生物炭處理和對照土壤樣品中細菌群落的相對豐度進行t檢驗，結(jié)果(圖4)顯示，與CK相比，生物炭處理的綠彎菌門(Chloroflexi)、酸桿菌門(Acidobacteriota)和厚壁菌門(Firmicutes)豐度分別提高了1.82%、12.36%和64.55%；放線菌門(Actinobacteriota)和變形菌門(Proteobacteria)豐度分別降低了2.02%和9.00%。此外，在非優(yōu)勢種群中，Myxococcota和Desulfobacterota豐度與對照相比有顯著提高(P<0.05)，而Bacteroidota和Patescibacteria豐度與對照相比顯著降低(P<0.05)。

圖2 所有樣品細菌群落OTUsFig.2 OTUs numbers of bacterial and fungal communities in all samples

表2 細菌群落測序數(shù)據(jù)和α多樣性 Table 2 Sequencing data and α diversity of the bacterial community

圖3 所有樣本中細菌門水平上的物種相對豐度Fig.3 Relative abundance of species at phylum level in all samples

圖4 不同處理組門水平上優(yōu)勢細菌相對豐度Fig.4 Relative abundance of dominant bacteria at phylum level in different treatment groups

3)生物炭對根際土壤微生物β多樣性的影響。對樣本距離矩陣進行聚類分析，構(gòu)建樣本層級聚類樹，可以準確表述不同樣本的相似性和差異關(guān)系。從圖5A可以看出，與對照相比，施加生物炭的樣本可以完全聚類在一起，且與對照相隔較遠，表明根際微生物區(qū)系在朝一定的方向發(fā)生變化，施加生物炭能夠顯著改變煙株根系微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)?；贠TUs豐度的土壤菌落結(jié)構(gòu)主成分分析結(jié)果如圖5B所示，PC1軸和PC2軸對樣本組成差異的貢獻值分別為52.30%和14.08%，從圖5B可以看出，施加生物炭的處理與對照處理樣本點在PC1軸上有較明顯的分離，說明生物炭對土壤細菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了一定的影響。

A:層級聚類樹 Hierarchical clustering tree on OTU level; B:主成分分析 Principal component analysis.圖5 生物炭施用對烤煙根際土壤細菌β多樣性Fig.5 Effects of biochar on diversity of soil bacterial beta

2.4 土壤細菌群落結(jié)構(gòu)與土壤化學性質(zhì)相關(guān)性分析

相關(guān)性分析結(jié)果(圖6)表明，厚壁菌門(Firmicutes)相對豐度與土壤速效鉀、pH和有機碳呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，Myxococcota相對豐度與速效鉀和pH呈顯著正相關(guān)，Bacteroidota相對豐度與速效磷和有機碳呈顯著負相關(guān)，Patescibacteria相對豐度與速效鉀、速效磷和pH呈顯著負相關(guān)，Desulfobacterota相對豐度與土壤速效鉀、速效磷和pH呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，與有機碳呈顯著正相關(guān)關(guān)系。結(jié)果表明，土壤化學性質(zhì)大多與土壤細菌優(yōu)勢門類有顯著相關(guān)關(guān)系。

AN:堿解氮 Alkali-hydro lyzed nitrogen; AK:速效鉀 Available potassium; AP:速效磷 Arailable phosphorus; SOC:有機碳 Soil organic carbon.

2.5 施加生物炭對煙葉化學成分的影響

比較分析各個處理B2F等級烤后煙葉的化學成分，由表3可知，生物炭處理的煙葉總糖含量、還原糖含量、鉀含量較對照處理均有顯著增加，分別增加了16.4%、10.82%和11.78%；煙堿含量、總氮含量和蛋白質(zhì)含量較常規(guī)處理相比有所增加，但差異未達顯著水平。另外，煙葉中氯含量顯著降低4.47%。結(jié)果表明，生物炭施用有利于改善煙葉質(zhì)量，協(xié)調(diào)煙葉化學成分。

表3 生物炭施用對烤后煙化學成分的影響 Table 3 Effects of biochar on conventional chemical components of flue-cured tobacco g/kg

3 討 論

3.1 生物炭對土壤養(yǎng)分的影響

添加生物炭可以改善土壤的養(yǎng)分狀況，促進植物生長，提高作物產(chǎn)量[23]。本試驗結(jié)果表明，與對照相比，施加生物炭顯著提高了土壤的pH，這是由于生物炭在自然條件下呈堿性，pH值一般為7.0～10.5[24],施加到土壤中后可以增加土壤的pH，使煙株在適宜的pH條件下生長發(fā)育。氮素是影響植株生長發(fā)育的關(guān)鍵元素，直接決定了作物的產(chǎn)量。余其昌等[25]研究發(fā)現(xiàn)，生物炭與菜籽餅配施可以有效增加烤后煙葉的氮含量，其中以生物炭750 kg/hm2+菜籽餅1 500 kg/hm2處理效果最佳；Steiner等[26]研究發(fā)現(xiàn)，在土壤中施入生物炭可以顯著提高水稻、高粱的產(chǎn)量；鄧霞[27]在玉米、黃瓜地塊中施加生物炭，顯著提高了玉米和黃瓜的干質(zhì)量。施加生物炭能有效提高土壤的持水能力，提升土壤氮的固持能力[28]，可以降低氮素的淋失作用[29]。

本研究發(fā)現(xiàn)，施加生物炭可以顯著提高土壤速效磷含量，與劉卉等[30]試驗結(jié)果一致，這可能是生物炭影響了土壤微生物的活性，促進了微生物對磷素的溶解和礦化效率，進而提高土壤中的速效磷含量[31-32]。本研究中施加生物炭顯著提高了土壤速效鉀和有機質(zhì)含量，有機碳能夠降低土壤的固鉀能力，從而提高土壤中鉀元素的有效性，施加生物炭可以提高土壤溫度，加速土壤中緩效鉀的釋放，提升速效鉀含量[33]。

3.2 生物炭對土壤細菌多樣性及煙葉質(zhì)量的影響

生物炭獨特的多孔結(jié)構(gòu)為土壤中的微生物提供了良好的環(huán)境，促進微生物的生長發(fā)育[34]。與常規(guī)施肥相比，施加生物炭肥改變了放線菌門(Actinobacteriota)、變形菌門(Proteobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、酸桿菌門(Acidobacteriota)、厚壁菌門(Firmicutes)、Myxococcota和Desulfobacterota等的相對豐度。說明生物炭顯著影響了細菌群落結(jié)構(gòu)。施加生物炭后，土壤酸桿菌門(Acidobacteriota)和厚壁菌門(Firmicutes)豐度有明顯的增加，這可能是因為生物炭的多孔性為細菌在土壤中生長及繁殖提供了更大的空間，從而增加了細菌的數(shù)量，同時還調(diào)節(jié)了土壤環(huán)境的物理和化學性質(zhì)，影響土壤微生物生長、發(fā)育和代謝[35]。聚類樹圖和PCA分析結(jié)果表明，生物炭可以促使土壤微生物結(jié)構(gòu)向特定的方向發(fā)展，這與任天寶等[36]的研究結(jié)果一致。相關(guān)性分析表明，土壤中優(yōu)勢細菌與土壤pH、速效鉀、速效磷和有機碳均存在一定的相關(guān)關(guān)系，其中厚壁菌門(Firmicutes)、Myxococcota和Desulfobacterota與土壤pH、速效磷、速效鉀和有機碳存在顯著的正相關(guān)關(guān)系(P<0.05),Bacterdidota與Patescibacteria與土壤pH、速效鉀、速效磷和有機碳存在顯著的負相關(guān)關(guān)系。施加生物炭有利于成熟期土壤養(yǎng)分固持，并驅(qū)動根際促生細菌群落增加，進而改善煙株根際礦質(zhì)營養(yǎng)和微生物群落結(jié)構(gòu)，促進營養(yǎng)的吸收和煙株的生長發(fā)育及代謝，進而提高煙葉產(chǎn)量，這與馮慧琳等[10]生物炭對烤煙根際細菌群落的影響及其作用機制研究結(jié)果相一致。

綜上，生物炭可以改善土壤的化學性質(zhì)，顯著提高土壤pH、速效磷、速效鉀和有機碳含量。生物炭對土壤養(yǎng)分的改變，促進了土壤細菌群落的變化，提高了功能微生物如土壤酸桿菌門(Acidobacteriota)和厚壁菌門(Firmicutes)的豐度。本研究結(jié)果表明，pH是影響細菌群落結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵因子之一。土壤微生態(tài)環(huán)境在作物的生長發(fā)育中起著重要的作用，施加生物炭對有利于改善烤煙成熟期土壤養(yǎng)分和根際細菌群落結(jié)構(gòu)。