常春藤皂苷元-半酯-AZT衍生物的合成及抗病毒蛋白酶活性

郝永佳, 危 英, 周 英, 劉 青, 諶 芬, 向 琴, 張 華, 於 祥, 吳繼春, 楊 虹

(貴州中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

由HIV(人類(lèi)免疫缺陷病毒)、HCV(丙型肝炎病毒)等病毒引起的感染性疾病嚴(yán)重地威脅人類(lèi)健康，并已造成全球范圍內(nèi)流行傳播。病毒肆虐之下，開(kāi)發(fā)、尋找高效、低毒的抗病毒藥物是目前的當(dāng)務(wù)之急。中藥、民族藥作為中華民族的瑰寶，在歷史的實(shí)踐過(guò)程中積累了諸多抗病毒藥物經(jīng)驗(yàn)。苗藥榜榜加腔為忍冬科忍冬屬藥用植物(LonicerafulvotomentosaHsu et S.C.Cheng)的花蕾，具有抗菌、抗炎、抗病毒和保護(hù)肝臟等多種生物活性[1-3]。其主要的活性成分為五環(huán)三萜皂苷和酚性化合物，如黃褐毛忍冬苷、咖啡酸衍生物和綠原酸等[4]。筆者在前期研究中，發(fā)現(xiàn)苗藥榜加腔酸水解產(chǎn)物含有豐富的常春藤皂苷元和咖啡酸等[5]。據(jù)報(bào)道齊墩果烷型五環(huán)三萜常春藤皂苷元具有抗艾滋病病毒蛋白酶、抗惡性細(xì)胞增生、抗癌、止痙、保肝、抗菌等生物活性[6-8]，而對(duì)正常人腎小管上皮細(xì)胞(HK2)沒(méi)有明顯的細(xì)胞毒性[9]。現(xiàn)代研究表明，三萜類(lèi)化合物A環(huán)C-3羥基導(dǎo)入C6內(nèi)酸酐，所形成的三萜半酯類(lèi)化合物抗HIV-1蛋白酶活性增強(qiáng)，三萜酸酐半酯類(lèi)衍生物與第一個(gè)用于臨床的艾滋病藥物齊多夫定(azidothymidine，3′-疊氮-3′脫氧胸腺嘧啶脫氧核苷，AZT)復(fù)合，具有較好的抗HIV-1蛋白酶活性[10]。

Chart 1

前期計(jì)算機(jī)模擬研究發(fā)現(xiàn)，采用二羧酸酯化三萜-3-羥基，能夠增強(qiáng)三萜與艾滋病蛋白酶的結(jié)合[11]。為此，本文以具有抗HIV-1蛋白酶活性的常春藤皂苷元為原料，合成一系列常春藤皂苷元半酯類(lèi)-AZT復(fù)合物(Scheme 1)，采用熒光法考察目標(biāo)分子抗HIV-1和HCV NS3/4A蛋白酶的活性，以期發(fā)現(xiàn)具有進(jìn)一步開(kāi)發(fā)潛質(zhì)的抗病毒蛋白酶抑制劑。

Scheme 1

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

BrukerAV 600 MHz型核磁共振儀(CDCl3為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo)); Bruker Daltonics micro ToF-QII型質(zhì)譜儀。

所用試劑均為分析純或化學(xué)純。

1.2 合成

(1)Ethyl(3β)-3,23-dihydroxyolean-12-en-28-oate(HES)[12]的合成

將常春藤皂苷元(1.0 g, 2.12 mmoL)，碘乙烷(0.68 mL, 8.40 mmoL)和碳酸鉀(1451.1 mg, 10.50 mmoL)溶于15 mL二甲基甲酰胺中，室溫下反應(yīng)12 h(TLC檢測(cè))。反應(yīng)結(jié)束，用乙酸乙酯(2×100 mL)萃取，合并有機(jī)相，減壓去除溶劑，殘余物經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：石油醚/乙酸乙酯=20/0～1/1,V/V)純化得白色無(wú)定形固體HES800 mg，收率76%;1H NMRδ: 5.28(t-like, 1H), 4.08(t,J=8.0 Hz, 16.0 Hz, 2H), 3.72(d,J=8.0 Hz, 1H), 3.63(dd,J=8.0 Hz, 16.0 Hz, 1H), 3.42(d,J=8.0 Hz, 1H), 1.23(s, 3H), 1.26(s, 3H), 1.26(s, 3H), 1.13(s, 3H), 0.92(s, 3H), 0.89(s, 3H), 0.74(s, 3H);13C NMRδ: 177.5, 143.5, 122.5, 76.8, 72.1, 60.2, 49.7, 47.7, 46.4, 46.1, 41.7, 41.7, 41.2, 39.3, 38.1, 36.9, 33.1, 32.4, 32.4, 30.6, 29.6, 29.6, 27.6, 26.6, 25.8, 25.8, 23.5, 18.3, 16.9, 15.8, 14.2, 11.0; HR-MS(EI)m/z: Calcd for C32H52O4Na{[M+Na]+}523.3763, found 523.3757。

(2)化合物1～5的合成通法

將常春藤皂苷元或常春藤皂苷元乙酯(500 mg, 1.06 mmol)和相應(yīng)無(wú)水酸酐(10.6 mmol)，DMAP(1015.20 mg, 8.31 mmol)置于50 mL圓底燒瓶，溶于6 mL無(wú)水吡啶中，120℃回流反應(yīng)24 h(TCL監(jiān)測(cè))。反應(yīng)完全后，用1 mol/L的硫酸調(diào)pH至6，用氯仿(2×100 mL)萃取,合并有機(jī)相，減壓去除溶劑，殘余物經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：石油醚/乙酸乙酯=20/0～1/1,V/V)純化得常春藤皂苷元半酯類(lèi)粗品600 mg，收率48%～70%。取半酯類(lèi)粗品(100 mg, 0.143 mmol)置于50 mL圓底燒瓶，加入DCC(176.75 mg, 0.858 mmol)、AZT(152.84 mg, 0.572 mmol)和DMAP(104.85 mg, 0.858 mmol)，溶解于6.0 mL混合溶劑(二氯甲烷/乙腈=4/1,V/V)中，避光反應(yīng)15 h(TLC監(jiān)測(cè))。反應(yīng)完全，用氯仿(2×100 mL)萃取,合并有機(jī)相，減壓去除溶劑，殘余物經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：石油醚/乙酸乙酯=20/0～1/1,V/V)純化后以薄層板(展開(kāi)劑：石油醚/丙酮=1/1,V/V)分離；再經(jīng)半制備高效液相色譜儀純化得無(wú)定形粉末狀固體1～5。

1：白色固體，收率22.5%;1H NMRδ: 9.10(brs, 2H), 7.25～7.26(m, 2H), 6.07(dd,J=6.0 Hz, 12.0 Hz, 2H), 5.28(t-like, 1H), 4.73～4.77(m, 1H), 4.43～4.45(m, 2H), 4.28～4.33(m, 4H), 4.05～4.09(m, 4H), 3.86(d,J=12.0 Hz, 1H), 3.75(d,J=12.0 Hz, 1H), 2.87(dd,J=12.0 Hz, 1H), 2.63～2.69(m, 3H), 2.46～2.48(m, 3H), 1.92(d,J=12.0 Hz, 6H), 1.23(s, 3H), 1.14(s, 3H), 0.96(s, 3H), 0.93(s, 3H), 0.90(s, 3H), 0.83(s, 3H), 0.74(s, 3H);13C NMRδ: 177.7, 172.0, 171.9, 171.8, 171.6, 163.7, 163.7, 150.1, 150.1, 144.0, 135.9, 135.4, 122.1, 111.2, 111.2, 86.0, 86.0, 81.9, 81.9, 75.1, 65.7, 63.3, 63.3, 60.4, 60.4, 60.1, 47.9, 47.7, 46.4, 46.1, 45.8, 41.7, 41.3, 40.8, 39.3, 37.7, 37.5, 37.4, 36.8, 36.8, 33.9, 33.1, 32.4, 32.3, 30.8, 30.7, 29.2, 29.1, 29.0, 27.6, 25.8, 23.6, 23.4, 23.0, 18.0, 17.0, 15.8, 14.3, 13.1, 12.6, 12.6; MS(ESI)m/z: Calcd for C60H82N10O16{[M+H]+}1198.5910, found 996.6, 733.8, 697.0。

2: 白色固體，收率16.7%;1H NMRδ: 8.45(brs, 1H), 7.27～7.28(m, 1H), 6.14(t-like,J=8.0 Hz, 1H), 5.31(t-like, 1H), 4.75～4.80(m, 1H), 4.46～4.49(m, 1H), 4.31～4.37(m, 2H), 4.11～4.14(m, 3H), 3.93(d,J=12.0 Hz, 1H), 3.88(d,J=12.0 Hz, 1H), 3.77(d,J=12.0 Hz, 1H), 2.87(dd,J=12.0 Hz, 1H), 2.62～2.69(m, 2H), 2.41～2.50(m, 3H), 1.96(d,J=12.0 Hz, 3H), 1.25(s, 3H), 1.16(s, 3H), 0.98(s, 3H), 0.95(s, 3H), 0.92(s, 3H), 0.85(s, 3H), 0.77(s, 3H);13C NMRδ: 177.3, 173.1, 172.9, 171.9, 171.8, 171.7, 163.3, 149.9, 143.9, 135.3, 121.9, 111.1, 85.2, 81.5, 74.8, 63.3, 60.5, 52.0, 51.8, 47.8, 47.7, 46.5, 46.6, 45.9, 41.7, 41.3, 40.9, 39.3, 37.7, 37.5, 36.9, 33.9, 33.1, 32.4, 30.7, 30.1, 29.1, 29.0, 28.9, 27.7, 25.9, 23.5, 22.7, 18.0, 17.0, 15.8, 14.3, 13.1, 13.0, 12.7; MS(ESI)m/z: Calcd for C50H71N5O13Na2{[M+2Na]+}995.4844, found 995.7。

3: 白色固體，收率30.0%;1H NMRδ: 7.51(s, 2H), 6.18(dd,J=6.0 Hz, 12.0 Hz, 2H), 5.29(t-like, 1H), 4.76(dd,J=12.0 Hz, 1H), 4.44～4.50(m, 4H), 4.30～4.35(m, 2H), 4.08～4.41(m, 4H), 3.85(dd,J=12.0 Hz, 2H), 3.38(s, 1H), 2.90(dd,J=12.0 Hz, 1H), 2.37～2.85(m, 10H), 1.93(d,J=12.0 Hz, 6H), 1.27(s, 3H), 1.18(s, 3H), 1.04(s, 3H), 0.96(s, 3H), 0.94(s, 3H), 0.87(s, 3H), 0.80(s, 3H);13C NMRδ: 178.2, 172.8, 172.7, 172.6, 165.1, 165.1, 150.6, 150.6, 143.5, 136.5, 136.5, 122.5, 110.5, 110.5, 85.2, 85.2, 81.6, 81.6, 74.1, 64.4, 62.9, 62.9, 60.8, 60.8, 60.1, 48.2, 48.2, 46.5, 45.7, 41.6, 41.4, 40.6, 39.3, 37.7, 36.5, 36.4, 36.4, 36.3, 33.4, 32.8, 32.7, 32.6, 32.4, 32.3, 32.2, 32.1, 30.4, 27.3, 25.0, 23.1, 22.6, 22.5, 20.0, 19.9, 17.6, 16.3, 14.9, 14.9, 13.2, 12.1, 11.3, 11.2; MS(ESI)m/z: Calcd for C62H85N10O16{[M-H]-}1225.6145, found 1225.3。

4: 白色固體，收率11.1%;1H NMRδ: 7.51(s, 1H), 6.19(s, 1H), 5.32(t-like, 1H), 4.80(dd,J=12.0 Hz, 1H), 4.38～4.46(m, 4H), 4.10～4.11(m, 2H), 4.01(d,J=12.0 Hz, 1H), 3.74(dd,J=12.0 Hz, 2H), 2.94(dd,J=12.0 Hz, 1H), 2.48～2.50(m, 4H), 1.96(s, 3H), 1.35(s, 3H), 1.29(s, 3H), 1.27(s, 3H), 1.25(s, 3H), 1.25(s, 3H), 1.07(s, 3H), 1.00(s, 3H), 0.97(s, 3H), 0.91(s, 3H), 0.83(s, 3H);13C NMRδ: 178.2, 176.3, 172.5, 172.4, 171.0, 165.5, 151.1, 143.8, 136.3, 122.3, 110.5, 85.3, 81.4, 74.5, 64.9, 63.6, 61.1, 59.9, 51.1, 48.2, 48.2, 46.5, 45.8, 44.6, 43.8, 41.5, 41.4, 40.4, 40.3, 39.3, 37.6, 36.6, 36.4, 36.3, 33.5, 32.7, 32.6, 32.5, 32.3, 32.2, 32.1, 30.2, 29.4, 27.5, 27.5, 25.4, 25.2, 25.0, 24.9, 24.7, 24.5, 24.5, 23.2, 22.6, 22.6, 22.5, 17.7, 16.4, 14.9, 13.2, 12.3, 11.3; MS(ESI)m/z: Calcd for C54H78N5O13{[M-H]-}1004.5596, found 1004.5。

5: 白色固體，收率6.5%;1H NMRδ: 8.13(s, 2H), 7.54(s, 2H), 6.79(d,J=6.0 Hz, 2H), 6.19～6.22(m, 2H), 5.30(t-like, 1H), 4.80(dd,J=12.0 Hz, 1H), 4.33～4.45(m, 6H), 4.13～4.14(m, 3H), 3.67(dd,J=12.0 Hz, 2H), 2.93(dd,J=12.0 Hz, 1H), 2.41～2.58(m, 6H), 1.96(s, 6H), 1.31(s, 3H), 1.21(s, 3H), 1.06(s, 3H), 1.00(s, 3H), 0.95(s, 3H), 0.90(s, 3H);13C NMRδ: 179.1, 173.1, 172.8, 172.7, 172.0, 164.9, 164.9, 150.3, 150.3, 145.4, 136.7, 136.3, 135.7, 121.7, 110.5, 106.3, 85.0, 84.7, 82.0, 82.0, 78.1, 63.1, 63.1, 60.8, 60.8, 59.9, 56.9, 50.3, 48.2, 47.1, 46.8, 46.7, 46.2, 41.6, 41.6, 40.7, 39.1, 38.1, 38.1, 37.7, 36.5, 32.8, 32.8, 32.7, 32.7, 32.4, 30.3, 29.4, 27.4, 27.4, 25.0, 24.5, 22.6, 22.4, 19.7, 17.4, 16.9, 16.5, 15.1, 15.1; MS(ESI)m/z: Calcd for C60H82N10O16{[M-H-}1198.5910, found 1198.6。

1.3 活性測(cè)試

采用熒光法對(duì)常春藤皂苷元-半酯-AZT衍生物抑制HIV-1、HCV NS3/4A蛋白酶活性進(jìn)行測(cè)試[13]。在384孔板中，先分別加入2 μL 溶于DMSO的樣品和8 μL酶，再加入10 μL底物，每個(gè)濃度均為3個(gè)復(fù)孔，震蕩混勻后，37 ℃下暖孵30 min；隨后經(jīng)Synergy II在激發(fā)波長(zhǎng)485 nm和發(fā)射波長(zhǎng)528 nm下測(cè)試熒光強(qiáng)度。選取已知的HIV-1蛋白酶抑制劑Pepstatin A、HCV蛋白酶抑制劑Embelin作為陽(yáng)性對(duì)照。

2 結(jié)果與討論

以常春藤皂苷元為母體結(jié)構(gòu)合成的常春藤皂苷元-酸酐-AZT衍生物比其母體結(jié)構(gòu)(IC50=42.3 μM)對(duì)HCV NS3/4A蛋白酶的抑制活性均有提高(見(jiàn)表1)。，其中化合物5比原料抗HCV蛋白酶活性提高了8倍，化合物5與化合物3均為3,23-雙取代的戊二酸酐衍生物，但化合物3為常春藤皂苷元乙酯衍生物(28-COOC2H5)，化合物5為常春藤皂苷元衍生物(28-COOH)，兩者抗HCV 蛋白酶活性相差近2倍，說(shuō)明28-羧基具有增強(qiáng)抗病毒活性作用。3,23-二氧丁二酸酐-AZT衍生物(1)抗HCV蛋白酶活性略強(qiáng)于單取代取代衍生物(2)?；衔?與3相比，C5酸酐-AZT衍生物抗HCV蛋白酶活性比C4酸酐-AZT衍生物1強(qiáng)3倍。因該類(lèi)衍生物過(guò)少，相關(guān)構(gòu)效關(guān)系的明確，尚需更多衍生物的合成與活性的深入研究[14-15]。

表1 常春藤皂苷元-酸酐-AZT衍生物的抗病毒蛋白酶活性(n=3)

選取常春藤皂苷元為起始原料，經(jīng)逐步酯化反應(yīng)，合成了5個(gè)結(jié)構(gòu)新穎的常春藤皂苷元-酸酐-AZT衍生物，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR和13C NMR表征。此外，測(cè)試了目標(biāo)產(chǎn)物體外對(duì)HIV-1和HCV NS3/4A蛋白酶的抑制活性。結(jié)果顯示，5個(gè)衍生物對(duì)HCV NS3/4A蛋白酶均表現(xiàn)出一定的抑制活性，其中抑制活性最強(qiáng)的是5(IC50=5.8 μM)，研究結(jié)果為抗病毒藥物研究提供了理論基礎(chǔ)。