新工藝制備的咳喘六味合劑治療哮喘小鼠的作用機制研究

楊帆平 奚 燕

1.上海中醫(yī)藥大學附屬普陀醫(yī)院臨床試驗機構辦公室，上海 200062；2.上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院藥學部，上海 200032

哮喘是一種常見的呼吸道疾病，主要由免疫介導引起氣道反應性增高，形成慢性氣道炎癥，在不同的國家有1%～18%的人群受到侵襲[1]。據研究統計中國大陸成年人哮喘患病率為1.81%[2]，患病率有逐年升高的趨勢[3]。

吸入糖皮質激素是治療輕度和中度哮喘的主要手段之一[4]?？却逗蟿┦巧虾Ｖ嗅t(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院的院內制劑，由麻黃、附子、細辛、桃仁、黃芩及虎耳草組成，具有溫陽抗寒、化痰平喘之功[5-6]。課題組前期已對咳喘六味合劑原有制備工藝中加水量、提取次數、提取時間、乙醇用量及其濃度等工藝條件進行了優(yōu)化，提高了麻黃中麻黃堿和偽麻黃堿以及黃芩中黃芩苷的轉移率并制訂了質量標準[7]。本研究通過觀察新工藝制備的咳喘六味合劑對哮喘小鼠的氣道反應性、肺組織病理變化以及炎癥反應的作用，驗證其對哮喘病癥的有效性并探討其作用機制[8-10]。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雌性BALB/c 小鼠，6～8 周齡，體重18～26 g，清潔級，由上海斯萊克公司提供，動物合格證號：SCXK（滬）2017-0003。動物實驗中心飼養(yǎng)，環(huán)境溫度18～22℃，相對濕度40%～70%，12 h/12 h 光暗循環(huán)。本研究設計和操作均嚴格按照上海中醫(yī)藥大學動物實驗倫理原則進行。小鼠自購入起，適應性飼養(yǎng)1 周后實驗。

1.2 試藥和儀器

咳喘六味合劑（新工藝）（上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院，批號：1706001）；地塞米松（上海上藥信誼制藥有限公司，批號：015161004）；卵清蛋白（ovalbumin，OVA）（美國Sigma 公司，貨號：A5503）；氫氧化鋁凝膠（美國Sigma 公司，貨號：V900163）；白細胞介素（in terleukin，IL）-13 酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（上海西唐生物，貨號：F10890）；IL-17 ELISA 試劑盒（上海西唐生物，貨號：F10910）；γ 干擾素（IFN-γ）ELISA 試劑盒（上海西唐生物，貨號：F10660）；無創(chuàng)式動物肺功能檢測儀（美國Buxco 公司，型號：FinePointeTMNAM）；正置顯微鏡（日本OLYMPUS 公司，型號：CX41）；恒溫烘箱（上海恒一科學儀器有限公司，型號：DHG-9023A）；石蠟切片機（湖北徠克醫(yī)療儀器有限公司，型號：SQ2125）；多功能酶標儀（芬蘭Thermo 公司，型號：DENLEY DRAGON Wellscan MK 3）；離心機（上海安亭科學儀器廠，型號：TGL-168），旋渦混合器（上海青浦滬西儀器廠，型號：XW-80A）。

1.3 方法

1.3.1 動物分組與哮喘模型制備 將小鼠按隨機數字表法分為對照組、哮喘模型組、咳喘六味合劑（新工藝）低劑量組、咳喘六味合劑（新工藝）高劑量組和地塞米松組，每組6 只。除對照組外，其他各組小鼠分別于第0、7、14 天進行腹腔注射致敏液（0.08% OVA 0.1 ml＋氫氧化鋁凝膠0.1 ml）致敏，對照組小鼠給予等劑量生理鹽水。第21 天起將小鼠置于密閉霧化吸入箱中，予1% OVA 30 ml 霧化激發(fā)，對照組小鼠給予等劑量生理鹽水霧化激發(fā)，各組小鼠激發(fā)30 min，1 次/d，連續(xù)10 d。當小鼠出現躁動、呼吸急促、擦鼻、打噴嚏、腹肌收縮等癥狀，提示造模成功。每次霧化激發(fā)前30 min 給藥，對照組和哮喘模型組給予生理鹽水灌胃，咳喘六味合劑（新工藝）低劑量組給予咳喘六味合劑（新工藝）15.5 g/kg 灌胃；咳喘六味合劑（新工藝）高劑量組給予咳喘六味合劑（新工藝）31 g/kg 灌胃；地塞米松組給予地塞米松3 mg/kg 灌胃[11-13]。

1.3.2 小鼠氣道反應性測定 采用無創(chuàng)的整體體積描記法測量各組小鼠的氣道反應性，以呼氣間歇（enhanced pause，Penh）值來表示氣道受限程度。使用無創(chuàng)式動物肺功能檢測儀，將小鼠密封放置于特定的描記器內，按照儀器使用說明操作，待小鼠適應5 min穩(wěn)定后，依次用濃度梯度為0.000、3.125、6.250、12.500和50.000 mg/ml 的乙酰甲膽堿（Methacholine，Mch）激發(fā)小鼠，每次激發(fā)時間不超過1.5 min，間隔3 min，記錄各濃度激發(fā)后的Penh 值。

1.3.3 小鼠肺組織HE 染色觀察 取小鼠左肺組織，厚度0.2～0.3 cm，大小為1.5 cm×1.5 cm×0.3 cm 為宜，置10%福爾馬林中固定48 h，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、HE 染色后，顯微鏡（200×）下觀察肺組織和炎癥細胞浸潤情況[14]。

1.3.4 小鼠血清IL-13、IL-17、IFN-γ 的含量測定離心（4℃，離心速率2500 r/min，時間10 min）后收集各組小鼠血清，嚴格按照ELISA 試劑盒說明書進行實驗操作和檢測[15-16]。

1.4 統計學方法

采用SPSS 19.0 統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（）表示，方差齊則多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗；方差不齊多組間的比較用Welch Brown 檢驗，組間兩兩比較則用Games-Howell test 檢驗。以P <0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠霧化激發(fā)后的行為表現

對照組小鼠行為表現一切如常。哮喘模型組、咳喘六味合劑（新工藝）低劑量組、咳喘六味合劑（新工藝）高劑量組、地塞米松組小鼠均霧化激發(fā)哮喘成功。其中哮喘模型組小鼠表現出不喜活動、眼神呆滯、精神狀態(tài)逐漸變差，呼吸頻率較為急促，腹部伴隨呼吸抽動，兩前爪頻繁撓動、擦拭鼻子；各給藥組小鼠也觀察到以上表現，但程度較哮喘模型組輕。

2.2 各組小鼠受到不同濃度Mch 激發(fā)后的Penh 值比較

當Mch 濃度為6.250、12.500、50.000 mg/ml，哮喘模型組Penh 值高于對照組，差異有統計學意義（P ＜0.05）；咳喘六味合劑（新工藝）低劑量組、咳喘六味合劑（新工藝）高劑量組、地塞米松組Penh 值低于哮喘模型組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。見表1。

表1 各組小鼠受到不同濃度Mch 激發(fā)后的Penh 值比較（）

表1 各組小鼠受到不同濃度Mch 激發(fā)后的Penh 值比較（）

注：與對照組同濃度比較，aP <0.05；與哮喘模型組同濃度比較，bP<0.05

2.3 各組小鼠肺組織病理變化

對照組小鼠肺組織結構清晰、完整，支氣管、肺泡等正常，未見明顯的炎癥細胞。哮喘模型組小鼠肺組織結構紊亂，支氣管變窄、壁變厚，周圍有炎癥細胞。咳喘六味合劑（新工藝）低劑量組、咳喘六味合劑（新工藝）高劑量組、地塞米松組小鼠肺組織稍顯改變，結構尚好；支氣管均有不同程度的變形，但變窄變厚程度輕于哮喘模型組，有少量炎癥細胞。見圖1。

圖1 各組小鼠肺組織病理變化（HE 染色，200×）

2.4 各組小鼠血清IL-13、IL-17 和IFN-γ 水平比較

哮喘模型組血清IL-13、IL-17、IFN-γ 水平與對照組比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）；咳喘六味合劑（新工藝）低劑量組、咳喘六味合劑（新工藝）高劑量組、地塞米松組血清IL-13、IL-17、IFN-γ 水平與哮喘模型組比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。見表2。

表2 各組小鼠血清IL-13、IL-17 和IFN-γ 水平比較（mg/ml，）

表2 各組小鼠血清IL-13、IL-17 和IFN-γ 水平比較（mg/ml，）

注：IL：白細胞介素；IFN-γ：γ 干擾素

3 討論

炎癥被認為是哮喘發(fā)病的核心，臨床表現為氣道高反應性與可逆性氣流受限[17-18]，而Th1/Th2 亞群比例失衡和功能失調被認為是哮喘發(fā)病的關鍵環(huán)節(jié)[19-20]。IL-13 是執(zhí)行Th2 細胞分化的主要細胞因子[21]，當哮喘形成時IFN-γ 明顯下降，Th2 細胞分化占據優(yōu)勢，導致IL-13 等細胞因子大量產生[22-23]。IL-17 對于哮喘炎癥起著關鍵作用，哮喘形成時，IL-17 呈高表達狀態(tài)[24-25]。

咳喘六味合劑全方配伍，可振奮腎陽。相關研究證實[26]，溫陽補腎可以調節(jié)Th1/Th2 的比例和功能失衡，從而改善氣道炎癥。麻黃中的總生物堿可調節(jié)哮喘模型大鼠IL-4、IL-13、IFN-γ 等炎癥因子的表達[27]；黃芩苷能作用于HMGB1-TLR4 信號通路，影響其信號傳導，抑制下游炎癥反應遞質的釋放，阻斷炎癥反應的級聯效應，減輕氣道炎癥反應[28]；細辛中所含揮發(fā)油可松弛支氣管平滑肌，抑制氣道炎癥反應，降低哮喘發(fā)病率[29]。

本研究結果顯示，新工藝制備的咳喘六味合劑對哮喘小鼠有一定的治療作用，可以緩解氣道高反應，減輕呼吸氣流受限程度，改善肺組織病理狀態(tài)；而對于相關炎癥因子的調節(jié)作用將做進一步研究。