基于網絡藥理學的宮外孕Ⅰ號方治療異位妊娠的作用機制研究

邱嘉菡 袁 爍 張家旗 鄺梓君

1.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院婦科，廣東廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，廣東廣州 510405

異位妊娠是育齡期婦女的噩夢，近年來，隨著盆腔炎性疾病、人工流產、輔助生育技術等高危因素的增加，其發(fā)病率逐年增長。在異位妊娠中，輸卵管妊娠占比最多，約占95%，典型的臨床表現(xiàn)為停經、下腹疼痛及陰道流血。

隨著醫(yī)學的進步和婦女健康意識的加強，使輸卵管妊娠在早期得到診斷已成為可能。目前西醫(yī)對輸卵管妊娠的治療有手術、藥物和期待治療3 種方式。其中甲氨蝶呤是藥物治療最常用藥物。甲氨蝶呤是一種抗葉酸類腫瘤藥，臨床上常見的不良反應有骨髓抑制、胃腸道反應、黏膜損傷，以及肝臟毒性、腎臟毒性、心臟毒性、感染等[1]，其中有報道指出肝功能損傷發(fā)生了高達51.6%[2]，面對西醫(yī)藥物治療嚴重的毒副作用，筆者所工作的廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，經過十余年的臨床研究，形成了“輸卵管妊娠的中西醫(yī)結合診療方案”，有報道指出中藥治療異位妊娠的成功率達97.6%[3]，為中醫(yī)藥治療輸卵管妊娠開辟了新天地。

中醫(yī)理論認為輸卵管妊娠的“本”是少腹血瘀證[4]。早在20 世紀60 年代山西醫(yī)學院率先開啟了中西醫(yī)結合非手術治療宮外孕，研制了宮外孕Ⅰ號方，宮外孕Ⅱ號方。其中宮外孕Ⅰ號方由桃仁、丹參、赤芍3 味藥物組成，其中以丹參為君藥，白芍、桃仁為臣藥，共奏化瘀消癥、活血殺胚之功，本方藥味雖然極其精簡，但臨床效果明確[5]。臨床藥理研究證實，宮外孕Ⅰ號方能促進腹腔凝血塊的吸收，對實驗動物的凝血時間[6]及淋巴回流均有一定影響。上述資料的來源均為20 世紀70 至80 年代的文獻，研究焦點也多集中在血液流變學上。經過數(shù)十年的時間，現(xiàn)代醫(yī)學的進步不止體現(xiàn)在臨床，同時也體現(xiàn)在細胞、動物實驗等科研相關的生物技術水平上。筆者所在的醫(yī)院在臨床上將宮外孕Ⅰ號方化裁的湯劑，應用于治療早期異位妊娠有著“效廉驗便”的優(yōu)勢[7]，同時能避免西藥的某些副作用和手術的痛苦；而且對患者生育能力的保護又是治療方案的另一優(yōu)勢。臨床上也有不少對該化裁湯劑進行實驗室研究[8-11]，但對其基礎湯劑——宮外孕Ⅰ號方的研究在近年來卻鮮少報道，本研究利用網絡藥理學方法探討宮外孕Ⅰ號方通過何種成分，利用機體的哪些靶點，最終達到治療異位妊娠的目的。

1 資料與方法

1.1 中藥活性成分的篩選和靶點

將宮外孕Ⅰ號方各中藥的中文名稱“丹參”“桃仁”“赤芍”作為關鍵詞輸入中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫和分析平臺[12]（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP），在中國知網、維普、萬方網站搜索近5 年（2015 年1 月至2020 年1 月）發(fā)表的文獻報道查找未在TCMSP 中檢索到的中藥成分進行整理補充。獲取所有中藥成分以后，錄入TCMSP 以匹配信息，將“口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18[13]”作為篩選條件。將上述活性成分輸入Uniprot 網站進行規(guī)范并轉換成藥物有效成分的作用靶點，匯總去除重復值，得出有效基因靶點。

1.2 構建宮外孕Ⅰ號方的“活性成分-靶點”網絡

宮外孕Ⅰ號方“活性成分-靶點”網絡主要通過軟件Cytoscape 3.8.0 來構建與分析，其中藥物成分或靶點用“節(jié)點”（node）表示，成分及靶點之間關系用“邊”（edge）表示。

1.3 異位妊娠相關靶點檢索

將“異位妊娠”輸入中國知網翻譯，得出“ectopic pregnancy”的譯名，以“ectopic pregnancy”作為關鍵詞，在Genecards[14]、Disgenet[15]兩個疾病基因數(shù)據(jù)庫進行檢索與篩選，將得到的靶點匯總并去除重復值，在中國知網、維普、萬方網站搜索近5 年（2015 年1 月至2020 年1 月）發(fā)表的文獻報道查找未預測到的已知治療靶點，并將所得靶點錄入Uniprot數(shù)據(jù)庫對其名稱進行標準化命名。

1.4 宮外孕Ⅰ號方治療異位妊娠的靶點獲取及構建靶蛋白蛋白質-蛋白質相互作用（proteinprotein interaction，PPI）網絡

1.4.1 宮外孕Ⅰ號方治療異位妊娠的靶點獲取 將“1.1”中取得的藥物有效成分的作用靶點及“1.3”中取得的疾病治療靶點匯總取交集，經過篩選查重，最終得到宮外孕Ⅰ號方治療異位妊娠的靶點。

1.4.2 建構宮外孕I 號方治療異位妊娠靶蛋白PPI網絡 將最終篩選出來的宮外孕Ⅰ號方治療異位妊娠的靶點導入Cytoscape 3.8.0 軟件中的bisogenet 插件獲取靶蛋白的相互作用關系。使用BisoGenet 數(shù)據(jù)庫對篩選出的基因靶點構建相互作用關系網絡，可得到宮外孕Ⅰ號方治療異位妊娠的PPI 網絡圖，將所得圖導入Cytoscape 3.8.0 軟件，繪制出PPI 網絡圖。

1.5 分子對接評估結合潛力

選擇蛋白和化合物網絡度值各前3 名的蛋白和活性成分進行分子對接。從RSCB PDB 數(shù)據(jù)庫中選取相應靶蛋白并下載其3D 結構，在TCMSP 中獲取活性成分的分子結構。利用Autodock Tolls 軟件對蛋白進行去水、加全氫及設置受體，對核心活性成分則進行加全氫、自動分布電荷、設置為配體，進行分子對接。分子對接過程中，受體與配體的親和力越好，其結合能越低，一般認為，結合能≤-1.2 kcal/mol，則對接結果良好，最后用Pymol 軟件對其進行可視化處理。

1.6 關鍵靶點富集分析

將最終得到的核心靶點導入DAVID[16]數(shù)據(jù)庫，進行兩種富集分析：①GO 分類富集分析，包括：生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和細胞組分（cell component，CC）。由于富集靶標越多，與治療異位妊娠相關性越高，所呈現(xiàn)的P 值便會越小，本課題組在分析富集結果時，選取P ＜0.01的富集數(shù)據(jù)，由小到大進行排序，將符合上述標準GO富集分析使用微生信網站（http：//www.bioinformatics.com.cn/）繪制GO 富集的BP、CC、MF 三合一柱狀圖。②KEGG 通路富集分析。得到通路富集結果后，選取COUNT 數(shù)目排名前20 位的KEGG 通路，使用微生信網站（http：//www.bioinformatics.com.cn/）繪制氣泡圖，并將上述通路數(shù)據(jù)的基因名及通路名稱使用Cytoscape 3.8.0 軟件繪制通路關系圖。

2 結果

2.1 宮外孕Ⅰ號方活性成分篩選

以檢索TCMSP 并根據(jù)OB 和DL 值初步篩選得到宮外孕Ⅰ號方活性成分共243 個，丹參137 個，桃仁52 個，赤芍54 個，其中桃仁和赤芍共有成分1 個，丹參和赤芍共有成分1 個，丹參和桃仁共有成分1 個，其中Degree（DC）值排名前3 的成分是β-谷甾醇、芹菜素、二氫異丹參酮Ⅰ。在中國知網、維普、萬方網站搜索近5 年相關文獻未查找到未納入的有效成分。將上述活性成分輸入Uniprot 網站得出丹參有2161 個有效靶點，桃仁有470 個有效靶點，赤芍有297 個有效靶點，去除重復值，得出有效基因靶點共159 個。方中OB 值排名前5 位的有效成分見表1。

表1 宮外孕Ⅰ號方部分活性成分

2.2 宮外孕Ⅰ號方活性成分-有效靶點網絡構建

宮外孕Ⅰ號方活性成分-有效靶點網絡具體關系見圖1。圖中內部綠色節(jié)點呈矩形排列者代表有效基因靶點；外圈呈圓形排列者代表藥物有效成分：內層紫色六邊形代表桃仁有效成分，中層綠色六邊形代表赤芍有效成分，外層兩圈紅色六邊形代表丹參有效成分；圖片最下方淡黃色六邊形代表共有有效成分：A1 代表桃仁和赤芍共有有效成分，A2 代表丹參和桃仁共有有效成分，A3 代表丹參和赤芍共有有效成分；圖片最上方橙色圓形代表藥物名稱：赤芍、丹參、桃仁。整個網絡圖共包含338 個節(jié)點，3087 條邊。宮外孕Ⅰ號方中多個有效成分對應同一靶點，多個靶點對應同一有效成分。

圖1 宮外孕Ⅰ號方有效靶點網絡圖（見內文第7 頁）

2.3 異位妊娠相關靶點檢索

在Genecards 數(shù)據(jù)庫中查找出5396 個靶點，由于靶點數(shù)量較多，因此通過SCORE 的中位數(shù)進行篩選，第一次中位數(shù)為1.19，第二次中位數(shù)為2.96。經過兩次取SCORE 中位數(shù)后共篩選出1360 個靶點；在Disgenet 數(shù)據(jù)庫中查找到49 個靶點；在中國知網、維普、萬方網站搜索近5 年相關文獻未查找到未納入的有效治療靶點。最終將所取得的上述所有靶點匯總去除重復值，并將所得靶點錄入Uniprot 數(shù)據(jù)庫對其名稱進行標準化命名，最終得到疾病靶點共1362 個。

2.4 宮外孕Ⅰ號方治療異位妊娠的靶點與PPI 網絡構建

2.4.1 宮外孕I 號方治療異位妊娠的靶點 得到宮外孕Ⅰ號方治療異位妊娠的靶點：ADRB2、AR、CHEK1、ESR1、ESR2、MAPK14、NOS2、PGR、PTGS1、PTGS2、SCN5A、F2、PPARG、F10、NOS3、CDK2、ACHE、BCL2、JUN、NR3C1、PON1、HTR2A、NR3C2、ADRB1、MAOA、PLAU、CAT、GSTM1、GSTP1、MMP2、VEGFA、IL-6、TNF、CYCS、MPO、TP53、CDK1、ADH1B、BCHE、SRC、CDK4、EGFR、HMOX1、IFNG、IL-2、INSR、MAPK1、MMP1、RB1、XDH、F7、CDK6、INS、NQO1、CTSB、IL-1B、MAPK8、MMP3、SELE、DRD2、CYP1A2、CYP3A4、EDNRA、ITGB3、VCAM1，共65 個交集靶點。見圖2。

圖2 宮外孕Ⅰ號方活性成分靶點與異位妊娠靶點的匹配維恩圖

2.4.2 宮外孕Ⅰ號方治療異位妊娠的PPI 網絡構建該PPI 網絡圖（圖3）共包含3 個小圖，左側圖為通過原始交集靶點作出的網絡圖，包括4613 個節(jié)點，167258 條邊，經過計算得出DC、Betweenness Centrality、Closeness Centrality 的中位數(shù)分別為48、6.74E-05、0.44，以此為條件截取出中間圖；中間圖包括931 個節(jié)點，41 403 條邊，經過計算得出DC、Betweenness Centrality、Closeness Centrality 的中位數(shù)分別為162、0.000565、0.47，以此為條件截取出右側圖；中間圖包括220 個節(jié)點，5932 條邊，圖中節(jié)點越大，代表DC 值越大，則代表與治療相關性越密切。DC 值排名在前5 位的靶蛋白：NTRK1、TP53、EGFR、APP、ESR1。

圖3 宮外孕Ⅰ號方治療異位妊娠核心靶點的蛋白質-蛋白質相互作用網絡圖

2.5 分子對接分析結果

對PPI 網絡中DC 值排名前3 的蛋白和活性成分進行分子對接，結果見表1[對接結果只保留每對分子對接的最低結合能（kcal/mol）]。分子對接結果顯示宮外孕Ⅰ號方核心成分與異位妊娠靶點具有較好結合活性。選擇最低結合能的分子對接繪制對接模式圖。見圖4。

圖4 分子對接結果圖

2.6 宮外孕Ⅰ號方治療異位妊娠通路富集分析

將PPI 網絡中的220 個核心靶點基因導入DAVID 數(shù)據(jù)庫，進行GO 富集分析及KEGG 通路富集分析。

表2 宮外孕Ⅰ號方異位妊娠靶點與核心成分分子對接的最低結合能（kcal/mol）

2.6.1 宮外孕Ⅰ號方治療異位妊娠的GO 富集分析GO 富集分析結果顯示，220 個相關靶點基因其中有207 個核心靶點基因參與富集，共得到518 個富集結果，其中包括MF 為174 項，主要涉及蛋白結合、泛素蛋白連接酶結合、酶結合等；CC 為126 項，主要涉及細胞核液、細胞核、細胞胞質溶膠等；BP 為218 項，主要涉及病毒過程、上調RNA 聚合酶Ⅱ啟動子的轉錄、抑制細胞凋亡等。選擇P 值最小排名前20 位的富集結果見圖5。

圖5 宮外孕Ⅰ號方治療異位妊娠的GO 富集分析

2.6.2 宮外孕Ⅰ號方治療異位妊娠的KEGG 通路富集分析 KEGG 分析結果：220 個相關靶點基因，其中有181 個核心靶點基因參與111 條信號通路過程。篩選得到COUNT 數(shù)目排名前20 位的通路見圖6。

圖6 宮外孕Ⅰ號方治療異位妊娠的KEGG通路富集分析（見內文第8頁）

將基因數(shù)目排名前20 位相關基因及通路導入Cytoscape 3.8.0 繪制的相關基因及通路關系圖，見圖7。進行KEGG 富集通路分析后發(fā)現(xiàn)，腫瘤通路、病毒致癌作用信號通路、乙肝信號通路、PI3K-AKT 信號通路、腫瘤中微小RNA 作用信號通路、細胞周期信號通路等信號通路與宮外孕Ⅰ號方治療異位妊娠的靶點關系密切。相關基因數(shù)最高的兩條通路作圖見圖8～9。

圖7 宮外孕Ⅰ號方治療異位妊娠的“靶點-通路”網絡圖

圖8 腫瘤通路的相關基因

圖9 病毒致癌通路的相關基因

3 討論

山西醫(yī)學院研制宮外孕Ⅰ號方為目前中藥治療異位妊娠的最常用的方劑之一，由丹參、赤芍、桃仁3 味中藥組成，藥味簡單，組方精妙，在臨床應用多年療效顯著。

本研究基于網絡藥理學，探討宮外孕Ⅰ號方治療異位妊娠的作用機制，共收集活性成分243 個，其中丹參的活性成分最多；宮外孕Ⅰ號方治療異位妊娠的作用靶點共65 個，提示宮外孕Ⅰ號方可以利用不同有效成分通過多個靶點蛋白治療異位妊娠。PPI 網絡圖提示宮外孕Ⅰ號方治療異位妊娠的作用機制錯綜復雜，核心靶點涉及的范圍可以分為細胞增殖及其周期、泛素化及惡性腫瘤相關指標，GO 和KEGG 富集分析結果顯示，宮外孕Ⅰ號方治療異位妊娠涉及不同的生物過程及不同的信號通路，如腫瘤信號通路、PI3K-Akt 信號通路、細胞周期、MAPK 信號通路、FoxO 信號通路等。

異位妊娠指的是受精卵在子宮體腔以外的部位著床發(fā)育。在正常妊娠中，受精卵必須在一個極短的“窗口期”完成定位、黏附、穿透三部曲才能繼續(xù)發(fā)育。牢固的黏附是著床的先決條件，而在黏附之后，滋養(yǎng)層細胞便開始迅速增殖，同時發(fā)生遷移和侵蝕，分化形成合體滋養(yǎng)層和細胞滋養(yǎng)層，同時分泌人絨毛膜促性腺激素（HCG）[17]。受精卵在異位的著床點雖然不能最終發(fā)育成熟，但其早期的著床過程與正常妊娠相一致。臨床上疑診或確診異位妊娠的時候，受精卵已經完成黏附，滋養(yǎng)細胞正處于快速增殖分裂，向周圍組織迅速遷移侵蝕，并同時分泌HCG。綜觀目前藥物治療異位妊娠，大多從抑制滋養(yǎng)細胞的增殖，最終調控其細胞周期；控制滋養(yǎng)細胞的遷移及侵蝕[18]等方面著手。

根據(jù)上述機制，分析本次網絡藥理PPI 核心蛋白結果，發(fā)現(xiàn)宮外孕Ⅰ號方治療異位妊娠DC 值排名前30 的核心蛋白與調控細胞增殖凋亡及其周期、調節(jié)細胞遷移及侵蝕有密切關系。如①TP53 為細胞周期研究領域中的明星分子，目前有研究表明p53 的高表達可能導致滋養(yǎng)細胞增殖[19]；細胞實驗研究表明miR-520 可能通過激活內質網應激誘導滋養(yǎng)細胞發(fā)生凋亡[20]。②體外細胞實驗同樣證實miR-137 可以影響滋養(yǎng)細胞的增殖活性及其遷移能力[21]。分析P 值排名前20 位的KEGG 通路可以發(fā)現(xiàn)宮外孕Ⅰ號方治療異位妊娠的主要通路可以分為以下三大類：①調節(jié)滋養(yǎng)細胞的增殖、侵襲及凋亡：目前的實驗室研究表明，通過調控PI3K-AKT 信號通路[22-23]、FoxO 信號通路[24-25]、MAPK 信號通路[26-30]，下調滋養(yǎng)細胞的增殖速度，抑制其遷移及侵襲、促進細胞凋亡?；谏鲜鼋Y論，本課題組推測對于治療異位妊娠同樣可以通過抑制上述通路的功能，達到控制滋養(yǎng)細胞的有絲分裂，抑制滋養(yǎng)細胞增殖，縮短其細胞周期，最終導致滋養(yǎng)細胞凋亡，從而治療異位妊娠。②與腫瘤相關性：在本次網絡藥理研究中發(fā)現(xiàn)，KEGG 富集的結果有很多與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關的信號通路。受精卵在著床可以分泌早孕因子，以防止免疫排斥。這種免疫行為與惡性腫瘤中的免疫逃逸[31-32]行為相類似。本課題組在回顧文獻中也發(fā)現(xiàn)目前有不少對滋養(yǎng)細胞的研究也以惡性腫瘤獲得性特征作為切入點[10,33-36]，因此本課題組推測日后研究宮外孕Ⅰ號方對異位妊娠的作用可以借鑒腫瘤相關通路來完成。

綜上所述，宮外孕Ⅰ號方治療異位妊娠的主要成分可能是β-谷甾醇、芹菜素、二氫異丹參酮Ⅰ等，宮外孕Ⅰ號方治療異位妊娠主要通過NTRK1 等蛋白通過腫瘤信號通路、PI3K-Akt 信號通路、細胞周期、MAPK 信號通路、FoxO 信號通路等影響蛋白結合、細胞核質、病毒過程等生物行為。本次網絡藥理實驗同時發(fā)現(xiàn)了部分核心靶點分子及富集所得通路尚未被深入研究，同時在文獻回顧中發(fā)現(xiàn)目前此類研究的對象集中在包括流產、子癇、妊娠期糖尿病等病理妊娠的滋養(yǎng)細胞或體外宮內妊娠滋養(yǎng)細胞株，多以基因敲除、分子檢測等作為干預手段。本文通訊作者目前已經成功對輸卵管妊娠的絨毛組織進行體外培養(yǎng)[37-38]，并使用宮外孕Ⅰ號方的加味湯劑對其進行實驗研究，證實該湯劑能夠阻斷細胞的黏附運動，抑制細胞的侵襲，減輕滋養(yǎng)細胞對輸卵管著床部位的過度浸潤，上調其凋亡率，最終達到治療異位妊娠的目的[9,18,39]。但目前對于復方成分中不同藥物的藥量及相互作用分析仍缺乏系統(tǒng)研究模型，此后，我們可以進一步建立研究模型以實驗的方式來明確之間的區(qū)別。