羊巴貝斯蟲病PCR鑒別診斷方法建立

劉玉海

摘要：羊的巴貝斯蟲病是世界范圍內(nèi)嚴(yán)重影響?zhàn)B羊業(yè)發(fā)展的重要寄生蟲病，快速檢測是有效防控該病的重要措施之一。本研究將以甘肅省分離的一株羊的巴貝斯蟲為研究對象，在純化的裂殖子中提取基因組DNA，根據(jù)18S rRNA基因序列設(shè)計特異性引物進行擴增，結(jié)果獲得羊巴貝斯蟲的目的基因片段199 bp。同時以羊的呂氏泰勒蟲、尤氏泰勒蟲和干凈羊的基因組作為對照進行擴增，結(jié)果均無交叉反應(yīng)，表明該PCR方法有很好的特異性，可用于羊巴貝斯蟲病臨床和流行區(qū)感染的早期檢測和診斷。

關(guān)鍵詞：羊巴貝斯蟲;PCR;檢測方法

中圖分類號：S858.26文獻標(biāo)識碼：Bdoi：10.3969/j.issn.2096-3637.2021.22.001

Establishment of PCR Differential Diagnosis Method for Babesiosis in Sheep

LIU Yuhai

（Animal Husbandry Technical Service Center of Longxi County，Animal Husbandry and Veterinary Station of Biyan Town，Longxi Gansu 748107，China）

Abstract：Babesiosis in sheep is an important parasitic disease that seriously affects the development of sheep farming worldwide. Rapid detection is one of the important measures to effectively prevent and control the disease. In this study，a sheep Babesia isolated from Gansu Province was taken as the research object，the genomic DNA was extracted from the purified merozoites，and specific primers were designed according to the 18S rRNA gene sequence for amplification. The target gene fragment is 199bp. At the same time，the genomes of T. lutii，T. eustii and clean sheep were used as controls for amplification，and the results showed no cross-reaction，indicating that the PCR method has good specificity. It can be used for early detection and diagnosis of babesiosis infection in clinical and endemic areas.

Keywords：sheep Babesia，PCR，detection method

0引言

巴貝斯蟲病是由巴貝斯屬的不同種病原寄生于哺乳動物紅細胞內(nèi)引起的以貧血、消瘦、黃疸為特征的一種血液寄生蟲病。該病與泰勒蟲病，無漿體病都是由生物媒介蜱傳播而引起，故同稱為蜱傳病。截至目前，世界范圍內(nèi)已報道的羊巴貝斯蟲病的病原種類有莫氏巴貝斯蟲、羊巴貝斯蟲、泰氏巴貝斯蟲、粗糙巴貝斯蟲和葉狀巴貝斯蟲等5個種[1]。

羊巴貝斯蟲病是由頂復(fù)門、梨形蟲綱、梨形蟲目的巴貝斯科巴貝斯屬的巴貝斯蟲寄生于羊紅細胞內(nèi)引起的一類疾病。該病以高熱、貧血、黃疸和血紅蛋白尿為主要臨床特征，感染嚴(yán)重時可引起羊只的死亡[2]。該病在我國分布廣泛，危害嚴(yán)重，常常給疫區(qū)的養(yǎng)羊業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。由于該病病原寄生部位的特殊性，臨床很難根除。因此，建立及時有效的檢測方法是預(yù)防和控制該病發(fā)生與流行的主要手段之一。對于羊巴貝斯蟲病的鑒別診斷方法，目前主要有經(jīng)典的病原學(xué)方法，吉姆薩染色血液涂片進行顯微鏡檢查，血清學(xué)檢測抗體的酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）等方法。但由于不同的診斷方法都有其自身的缺陷，血液原蟲病原學(xué)診斷方法、顯微鏡鏡檢和血清學(xué)ELISA檢測方法的敏感性較低，很難進行羊巴貝斯蟲種的鑒別診斷。近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，越來越多的分子生物學(xué)檢測方法被不斷地應(yīng)用于巴貝斯蟲不同種的鑒別診斷中。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是實驗室最常見的用于檢測巴貝斯蟲病的分子生物學(xué)方法之一。該方法是通過一對特異性引物對靶標(biāo)基因進行體外核酸擴增，從而獲得大量復(fù)制的目的基因。尤其適用于動物感染后表現(xiàn)為亞臨床癥狀或染蟲率較低的時候，與傳統(tǒng)的血液涂片鏡檢法相比，具有更高的敏感性。Altay等[3]建立的以綿羊巴貝斯蟲核糖體18SrRNA為靶基因的PCR方法，不但能特異性檢測羊巴貝斯蟲的感染，而且在敏感性和特異性方面都具有很好的優(yōu)勢。與其它診斷方法相比，PCR檢測方法更加簡單，且容易操作，已在國內(nèi)外被廣泛應(yīng)用于不同病原的檢測中。

本研究根據(jù)巴貝斯蟲核糖體18SrRNA基因序列的保守區(qū)，設(shè)計特異性引物，建立檢測羊巴貝斯蟲的PCR方法，其特異性強，敏感性高，重復(fù)性好，可應(yīng)用于該病的臨床檢測。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗材料

羊的巴貝斯蟲蟲血采自甘肅省的發(fā)病羊。野外采的蟲血接種實驗室除脾羊，待染蟲率升高到5%～20%時，頸動脈放血，收集血液純化裂殖子，提取基因組DNA，用于本試驗。

1.1.2試劑耗材

DNA提取試劑盒購自Qiagen公司，DNA凝膠回收試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1蟲體基因組DNA提純

使用DNA提取試劑盒（Gentra公司），按操作說明書進行，從純化的裂殖子中提取基因組DNA 80 uL，以備后續(xù)實驗之用。

1.2.2PCR引物的設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank登錄的羊巴貝斯蟲目的基因序列，經(jīng)同源性分析比較后，選擇基因中高度保守的V4區(qū)域，應(yīng)用Primer Premier 5.0生物信息學(xué)軟件，設(shè)計出適合檢測該病原的特異性引物，送上海生工生物科學(xué)技術(shù)有限公司合成。所設(shè)計的引物序列如下：上游引物（POB1）：5'-TACCGTCAAGCTGATGGGG-3;下游引物（POB2）：5'-ATGGCTCATTACAACAGTTATAG-3'。

1.2.3引物稀釋與配制

先將引物用雙蒸水，配制成100 μM的儲存液，待完全溶解后，吸取2μL于PCR管中，加入18μL雙蒸水配制成10 μM的稀釋液備用。

1.2.4PCR引物反應(yīng)條件（退火溫度）篩選

PCR反應(yīng)條件篩選所用試劑均購自TakaRa公司，退火溫度在55.5～59.0 ℃設(shè)立溫度梯度PCR擴增體系見表1。

1.2.5目的片段的PCR擴增及電泳鑒定

以羊巴貝斯蟲的基因組為模板，分別以羊的呂氏泰勒蟲、尤氏泰勒蟲、健康羊基因組和純凈水作為對照，用已設(shè)計的引物進行PCR擴增，用TakaRa公司生產(chǎn)的試劑盒。PCR擴增的反應(yīng)體系及程序如下表（混合后將體系離心10s）。置于PCR擴增儀中按照表2設(shè)計的程序進行擴增;之后取上述PCR產(chǎn)物5.0 rL，在2.0%的瓊脂糖凝膠中，于120 V電壓、120 mA電流下進行電泳分析，觀察結(jié)果。

2結(jié)果與分析

2.1退火溫度篩選結(jié)果

PCR擴增結(jié)果顯示，在56.0～59.0 ℃時，目的片段的條帶亮度相同，故取中間溫度57.5 ℃為最適退火溫度，見圖1。

2.2羊巴貝斯蟲目的基因片段的擴增及鑒定

以甘肅省分離的一株羊巴貝斯蟲基因組為模版，運用該PCR引物進行擴增。結(jié)果擴增出了與預(yù)期大小相一致的199 bp的片段，見圖2，表明目的片段擴增成功。

2.3羊巴貝斯蟲引物特異性的確定

使用本研究所設(shè)計的擴增羊巴貝斯蟲的引物，分別以感染羊的呂氏泰勒蟲、尤氏泰勒蟲的蟲血和干凈羊的血液所提取的基因組為模板進行PCR擴增，結(jié)果顯示呂氏泰勒蟲、尤氏泰勒蟲基因組及干凈羊血液基因組三者均呈陰性，只有羊巴貝斯蟲基因組呈陽性，表明羊的巴貝斯蟲與呂氏泰勒蟲、尤氏泰勒蟲之間沒有交叉抗原，說明該引物的特異性較好，可用來檢測鑒別感染羊的巴貝斯蟲。見圖3。

2.4羊巴貝斯蟲目的片段測序結(jié)果分析

對羊巴貝斯蟲所擴增的目的片段進行測序，199 bp片段的核甘酸序列如圖4所示。

2.5田間樣品驗證PCR方法的敏感性

用本實驗所建立的普通PCR方法和經(jīng)典的病原學(xué)血液涂片檢查方法，對采自甘肅省不同地區(qū)58份羊的血液樣本分別進行檢測。檢測結(jié)果顯示，常規(guī)PCR方法檢出的陽性率為39.6%（23/58），而病原學(xué)血液涂片檢出的陽性率為18.9%（11/58），且血液涂片鏡檢確定為陽性的樣品，常規(guī)PCR方法檢測也均為陽性，結(jié)果一致。該田間樣品驗證方法表明PCR檢測方法敏感性更高。

3討論

羊巴貝斯蟲病是一種媒介蜱傳播的血液寄生原蟲病。動物感染該病后，主要的臨床癥狀表現(xiàn)為發(fā)熱、貧血、黃疸和血紅蛋白尿，嚴(yán)重感染時可引起羊只死亡。我國最早報道羊巴貝斯蟲病是20世紀(jì)80年代，首先發(fā)現(xiàn)報道于四川和黑龍江兩省，此后相繼于我國的河南、山西、甘肅和云南等省份被發(fā)現(xiàn)。利用所建立的酶聯(lián)免疫吸附試驗，即血清學(xué)方法，對采自我國22個省份的羊血清進行抗體檢測，從而對我國羊巴貝斯蟲的感染狀況進行了流行病學(xué)調(diào)查;楊強等[6]對采自我國10個不同省份的羊血液進行了羊巴貝斯蟲分子流行病學(xué)調(diào)查。上述兩項不同實驗方法的調(diào)查結(jié)果顯示：羊巴貝斯蟲病在我國的流行范圍廣泛、感染率較高，對我國的養(yǎng)羊業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。

在臨床診斷上，可根據(jù)羊巴貝斯蟲病的臨床癥狀和流行病史2方面綜合考慮，對該病做出初步診斷。如患病動物是否表現(xiàn)出常見的高熱、貧血、血紅蛋白尿和食欲減退、精神萎靡等癥狀，患病動物的發(fā)病季節(jié)、發(fā)病地點和是否有蜱叮咬史等流行病學(xué)數(shù)據(jù)。但若要確診，必須查到病原。確診羊巴貝斯蟲病慣常用的診斷方法主要是病原學(xué)檢查方法，也就是血液涂片染色鏡檢法。但由于吉姆薩染色劑配制的不同，相似病原體很難明顯區(qū)分，而且做顯微鏡鏡檢的人員專業(yè)知識的參差不齊等人為因素也影響鏡檢結(jié)果的判定;其次，該方法的缺陷在于，當(dāng)感染動物處于帶蟲期或感染初期以及隱性感染階段時，血液染蟲率較低，此時在顯微鏡下很難在血液涂片中查到蟲體;加之各種巴貝斯蟲或者泰勒蟲在形態(tài)上較為相似，所以顯微鏡檢測易出現(xiàn)漏檢和誤診的情況。故與之相對應(yīng)的血清學(xué)檢測方法被用于該病的抗體檢測中。

4結(jié)論

以Genbank中登陸的羊巴貝斯蟲的18SrRNA為靶標(biāo)基因序列，設(shè)計一對特異性檢測的核甘酸引物，建立了一種高敏感性和特異性的普通PCR方法，為羊巴貝斯蟲病的隱性感染提供了一種快速定性診斷的分子生物學(xué)檢測方法，適合血液寄生蟲病的定性檢測。該普通PCR方法為我國羊巴貝斯蟲病的流行病學(xué)調(diào)查提供了有力的工具，不失為一種在基層防疫部門推廣應(yīng)用的合理方法。

參考文獻

[1]殷宏，羅建勛，呂文順，等.莫氏巴貝斯蟲和羊巴貝斯蟲在我國的分離及形態(tài)學(xué)觀察測[J].中國獸醫(yī)科技，1997，27（10）：7-9.

[2]劉愛紅.建立于18SrRNA基因測序基礎(chǔ)上的羊巴貝斯蟲分子分類學(xué)研究[D].蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2003.

[3]Altay K. Detection of Babesia ovis by PCR in Rhipicephalus bursa collected from naturally infested sheep and goats [J]. Research in Veterinary Science，2008，85（1）：116-119.