不同鋁耐性小麥內(nèi)源磷再利用差異分析

張曉龍 陶燁 朱曉芳 馬建鋒 沈仁芳

摘要：植物體內(nèi)磷的分配和再利用是植物對磷元素利用的具體表現(xiàn)，磷和鋁是酸性土壤上限制作物生長的兩大主要因子，因此，對不同鋁耐性品種在磷再利用機(jī)制方面的研究具有重要意義。以小麥耐鋁品種Atlas 66和鋁敏感品種Scout 66為研究材料，研究有無磷供應(yīng)下品種間磷含量與細(xì)胞壁及其組分磷含量以及果膠甲酯酶（PME）活性的差異。結(jié)果表明，與Scout 66相比，Atlas 66在缺磷條件下鮮質(zhì)量和干質(zhì)量相對較低，全磷和可溶性磷含量也相對較低，但品種間差異不顯著。另一方面，在缺磷條件下，小麥耐鋁品種Atlas 66磷相關(guān)基因表達(dá)量大多顯著大于鋁敏感品種Scout 66，說明在缺磷條件下，Atlas 66對磷的需求明顯要高于Scout 66，以此來滿足自身的生長發(fā)育需求。缺磷條件下，Atlas 66的根部細(xì)胞壁磷含量以及地上部果膠磷含量大多顯著高于Scout 66，無論有無磷供應(yīng)下Atlas 66 與Scout 66的PME活性并沒有顯著差異，說明相比于Scout 66，Atlas 66在缺磷時細(xì)胞壁釋放的可供植物再利用的磷顯著減少，因而，Atlas 66對磷的需求提高，進(jìn)一步驗證了表達(dá)量的結(jié)果。綜上所述，耐鋁型小麥品種Atlas 66在整體磷含量上略低于鋁敏感型品種Scout 66，更多的磷固定在Atlas 66細(xì)胞壁中不能釋放，這可能也是其耐鋁機(jī)制之一。

關(guān)鍵詞：小麥;耐鋁性;缺磷;細(xì)胞壁;磷再利用

中圖分類號：Q945.12;S512.101? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2021）17-0080-07

收稿日期：2021-02-04

基金項目：江蘇省杰出青年基金（編號：BK20190050）;中國科學(xué)院青年創(chuàng)新促進(jìn)會（編號：2015250）;國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（973）項目（編號：2014CB441000）;中國科學(xué)院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項（編號：XDB15030302、XDB15030202）。

作者簡介：張曉龍（1990—），男，安徽阜陽人，博士研究生，主要從事植物逆境生理的研究。E-mail：974588379@qq.com。

通信作者：朱曉芳，博士，副研究員，主要從事植物逆境生理的研究。E-mail：xiaofangzhu@issas.ac.cn。

磷是生物體內(nèi)不可缺少的大量營養(yǎng)元素，同時也是農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中作物生長的主要限制因子[1]。植物吸收和代謝的磷主要是磷酸鹽形式的無機(jī)磷，盡管土壤中的磷含量豐富，但是由于磷在土壤中的特殊形式，導(dǎo)致可供植物吸收利用的量少之又少[2]。微生物的轉(zhuǎn)化固定、酸性土壤中磷鋁等的結(jié)合、堿性土壤中磷鈣等的結(jié)合以及徑流等過程限制著植物對磷的吸收[3-6]。因此，研究植物在缺磷、低磷條件下的機(jī)制已經(jīng)成為植物育種的主要目標(biāo)之一。

在長期應(yīng)對磷不足的過程中，植物本身進(jìn)化出一系列的應(yīng)對機(jī)制。對于植物而言，可通過自身形態(tài)的改變[7]、有機(jī)酸的分泌[8]、微生物共生[9]等方式促使根際范圍有效磷含量的提高。植物自身內(nèi)部通過磷轉(zhuǎn)運(yùn)基因的表達(dá)[10]、糖類代謝[11]、磷的再分配[12]等機(jī)制將吸收的磷再利用進(jìn)而緩解磷的缺乏以滿足自身的生長發(fā)育。近年來，對于植物體內(nèi)磷再利用的研究又有了新的認(rèn)識，即細(xì)胞壁中吸附的磷在植物磷不足時的再利用機(jī)制。果膠是細(xì)胞壁的主要成分，其可在植物磷缺乏時將細(xì)胞壁中吸附的磷酸鹽中的磷置換出來，進(jìn)而供植物再利用，而體外的磷解析試驗也證實了這一點(diǎn)[13-15]。因此，由于磷缺乏導(dǎo)致的細(xì)胞壁組分含量的改變可以影響植物內(nèi)源磷的再利用。

小麥?zhǔn)俏覈匾募Z食作物，在南方酸性土壤上也多有種植，與其他作物一樣，鋁毒和磷缺乏也是限制酸性土壤小麥生產(chǎn)的2個主要因素[16]。已有的研究多是從單一方向?qū)α缀弯X進(jìn)行比較，結(jié)果一致認(rèn)為，耐鋁則磷高效，而磷高效則耐鋁[17-18]。而不同鋁耐性品種作物在內(nèi)源磷再利用機(jī)制方面是否存在差異還鮮有報道。因此，本研究以小麥耐鋁品種Atlas 66和鋁敏感品種Scout 66為研究材料，研究缺磷條件下磷再利用能力的差異，從而豐富不同鋁耐性小麥品種內(nèi)部的磷再利用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 供試材料和培養(yǎng)條件

本試驗于2019年12月至2020年9月于江蘇省南京市中國科學(xué)院南京土壤研究所溫室內(nèi)進(jìn)行。選取Atlas 66和Scout 66 2個小麥品種為試驗材料。

將種子在10%的H2O2中浸泡消毒30 min，用蒸餾水沖洗干凈后，置于蒸餾水中浸泡2 h。然后將種子置于濕潤的濾紙上，26 ℃避光催芽。1 d后，將種子移至浮于0.5 mol/L的CaCl2（pH值為6.0）溶液的浮板上，26 ℃避光培養(yǎng)3 d，培養(yǎng)過程中每天更換CaCl2溶液。避光培養(yǎng)后，選取長勢一致的幼苗移至改良后的1/4 霍格蘭（Hoagland）營養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，全營養(yǎng)液配方如下：2 mmol/L Ca（NO3）2·4H2O、650 μmol/L MgSO4·7H2O、250 μmol/L KH2PO4、750 μmol/L K2SO4、40 μmol/L Fe-EDTA、10 μmol/L MnSO4·H2O、0.1 μmol/L CuSO4·5H2O、1 μmol/L ZnSO4·7H2O、1 μmol/L H3BO3、0.05 μmol/L （NH4）6Mo7O24·4H2O、100 μmol/L KCl，pH值為6.0。培養(yǎng)和處理試驗均在光照培養(yǎng)間培養(yǎng)，白天14 h/28 ℃和夜晚10 h/23 ℃，光照強(qiáng)度為400 μmol/（m2·s），相對濕度為60%，每天更換1次營養(yǎng)液。

正常培養(yǎng)1周后，選取長勢一致的幼苗置于1.25 L的培養(yǎng)罐中進(jìn)行處理，處理1周后收樣。試驗設(shè)品種和磷供應(yīng)水平2個因素，小麥為耐鋁品種Atlas 66和鋁敏感品種Scout 66 2個品種，磷供應(yīng)水平設(shè)正常培養(yǎng)（+P）和缺P處理（-P）2個水平，共4個處理，分別標(biāo)記為A+P、A-P、S+P、S-P。

1.2 可溶性磷的提取與含量測定

將處理后的小麥樣品用蒸餾水沖洗干凈，用吸水紙吸干水分后分別稱取根和地上部鮮質(zhì)量。將樣品用液氮充分研磨，根和地上部樣品分別依次加入400 μL 5 mol/L H2SO4、4 mL去離子水和800 μL 5 mol/L H2SO4、8 mL的去離子水，充分混勻后轉(zhuǎn)入10 mL離心管。室溫靜置4 h后，4 000 r/min離心 5 min。吸取100 μL上清液或100 μL磷標(biāo)準(zhǔn)液（0、5、10、15、20、25、30 mg/L），100 μL鉬銻抗試劑（含15%維生素C），800 μL去離子水于1.5 mL離心管中。混勻后于37 ℃靜置顯色30 min，在880 nm處測定吸光度。

1.3 全磷的提取與含量測定

將處理后的小麥樣品用蒸餾水沖洗干凈，吸水紙吸干水分后分別稱取根和地上部鮮質(zhì)量。將稱好的樣品塞入信封并于烘箱中105 ℃殺青30 min，然后70 ℃烘至恒質(zhì)量。將烘干的樣品粉碎，稱取0.5 g放入20 mL消煮管中，而后向消煮管中加入 5 mL 濃H2SO4，于消煮爐上180 ℃消煮至無色。消煮結(jié)束后，置于室溫條件下，待溫度降至室溫后定容。吸取100 μL上清液或100 μL磷標(biāo)準(zhǔn)液（0、5、10、15、20、25、30 mg/L），100 μL鉬銻抗試劑（含15%抗壞血酸），800 μL去離子水于1.5 mL離心管中，混勻后于37 ℃靜置顯色30 min，在880 nm下測定吸光度。

1.4 RNA的提取及相關(guān)基因表達(dá)量的測定

試驗處理完成后，將小麥根系剪下沖洗干凈，迅速用吸水紙吸干水分并放入1.5 mL滅菌后的離心管中，于液氮中冷凍，每個處理3次重復(fù)。將樣品用液氮充分研磨，加入 300 μL裂解液，充分混勻后65 ℃裂解2 min，15 000 r/min、4 ℃條件下離心 3 min。取 200 μL 上清液，用 TGuide 核酸自動提取儀（TIANGEN M16，中國）提取總RNA。然后用 NanoDrop（Thermo Fisher，美國）檢測 RNA 的濃度和質(zhì)量，并用 1% 瓊脂糖電泳檢測其完整性。

用 ReverTra Ace qPCR RT Kit（TOYOBO，日本）試劑盒進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄，共20 μL體系，即4 μL 5×RT Buffer、1 μL Enzyme Mix、1 μL Primer Mix、14 μL RNA和無菌水混合液（RNA總量為 1 μg）。反轉(zhuǎn)錄程序：37 ℃ 15 min，98 ℃ 5 min，4 ℃ 終止反應(yīng)，得到 cDNA。

實時熒光定量 PCR（RT-PCR）用 SYBR Green Realtime PCR Master Mix（TOYOBO，日本）試劑盒及實時熒光定量 PCR儀（LightCycler 480Ⅱ，Roch，瑞士）進(jìn)行試驗。反應(yīng)體系共10 μL體系，即5 μL SYBR Green，4.5 μL 無菌水，0.2 μL 正向引物，0.2 μL 反向引物，0.1 μL cDNA（稀釋后）。反應(yīng)條件：95 ℃ 預(yù)變性1 min，95 ℃ 變性15 s，55 ℃ 退火10 s，72 ℃ 延伸20 s，40個循環(huán)。每個樣品3次平行，用公式 2-ΔΔCT 來計算基因的相對表達(dá)量。反應(yīng)的引物序列見表1。

1.5 根系果膠甲酯酶（PME）活性測定

處理后的根系樣品于1.5 mL離心管中經(jīng)液氮冷凍后充分研磨，加入 500 μL PME提取液（1 mol/L NaCl，10 mmol/L Tris-HCl，pH值=7.5），靜置冰浴 30 min后，15 000 r/min 離心 5 min。吸取 100 μL 上清液和甲醇標(biāo)準(zhǔn)液（0、10、20、30、40、50、75、100 μmol/L）于1.5 mL離心管中，加入200 μL 200 mmol/L 磷酸緩沖液{其中包含0.64 mg/mL果膠[酯化度（DE）=90%，Sigma]、0.01 units/μL 乙醇氧化酶（AO），pH值為7.5}。振蕩混勻，30 ℃孵育 10 min后加入 400 μL 5 g/L的巰基拉曼染料，振蕩混勻，30 ℃ 孵育 30 min，在550 nm 處測定吸光度。

1.6 細(xì)胞壁的提取及細(xì)胞壁有效磷含量測定

試驗處理完成后，將樣品用蒸餾水沖洗干凈，用吸水紙擦干水分。將樣品分根和地上部2個部分分別于研缽中用液氮充分研磨，然后加入5 mL 75%的乙醇，混勻后倒入10 mL離心管，室溫靜置20 min后，4 000 r/min 離心10 min，去上清。分別依次加入 5 mL 丙酮，1 ∶1的甲醇和三氯甲烷混合液以及甲醇，重復(fù)靜置、離心、去上清等步驟。最終得到的殘渣即為細(xì)胞壁粗提物，用冷凍干燥儀冷凍干燥后，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

稱取5 mg左右細(xì)胞壁樣品于1.5 mL離心管中，加入1 mL 2 mol/L HCl溶液，渦旋振蕩24 h 后，15 000 r/min離心5 min。取100 μL上清液測定磷含量，測定方法同“1.2”節(jié)。

1.7 果膠的提取及其磷含量測定

稱取3 mg左右細(xì)胞壁樣品于1.5 mL離心管中，加入1 mL去離子水，100 ℃水浴1 h后13 200 r/min離心10 min，然后將上清液轉(zhuǎn)移至5 mL離心管中。重復(fù)2次水浴步驟后，將3次所得到的上清液混勻即為提取的果膠溶液。取100 μL上清液測定磷含量，測定方法同“1.2”節(jié)。

1.8 數(shù)據(jù)處理

試驗所得數(shù)據(jù)采用Excel 2007 和 SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，并用最小顯著性差異法（LSD）檢驗處理間的差異顯著性（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種不同處理條件下生物量比較

Atlas 66和Scout 66 2個品種在不同處理條件下的生物量見圖1，結(jié)果表明，缺磷處理后，2個品種的鮮質(zhì)量和干質(zhì)量均有所降低，但只有Atlas 66缺磷處理根部鮮質(zhì)量顯著降低。此外，除正常培養(yǎng)條件下，Scout 66的根部干質(zhì)量顯著小于Atlas 66且鮮質(zhì)量略低外，其他各處理無論供磷水平如何Scout 66的鮮質(zhì)量和干質(zhì)量均大于Atlas 66，但品種間差異沒達(dá)到顯著水平（圖1-B）。

2.2 不同品種不同處理條件下磷含量的差異

2個小麥品種在正常培養(yǎng)和缺磷培養(yǎng)條件下全磷和可溶性磷含量有所差異（圖2）。Atlas 66在正常培養(yǎng)條件下根和地上部的全磷和可溶性磷含量大多大于Scout 66，但是品種間差異均未達(dá)到顯著水平。而缺磷條件下，品種間差異趨勢則相反，全磷和可溶性磷含量大多表現(xiàn)為Atlas 66小于Scout 66，但品種間差異不顯著。

2.3 不同處理條件下根部磷相關(guān)基因表達(dá)量

分析結(jié)果表明，2個小麥品種在磷含量上存在著差異，那么在體內(nèi)調(diào)控磷吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)制方面是否也存在著差異，我們對磷吸收轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因進(jìn)行表達(dá)量的測定。由圖3可知，正常培養(yǎng)條件下，除TaPHT1;6基因外，Atlas 66的磷相關(guān)基因表達(dá)量均小于Scout 66，尤其是TaPHT1;1a/b、TaPHT1;2a/b、TaPHT1;8，品種間差異達(dá)到顯著水平。缺磷條件下，除Scout66的TaPHT1;8基因略微下調(diào)外，2個供試品種的磷相關(guān)基因表達(dá)量均有所上調(diào)，且個別基因在不同磷供應(yīng)水平下的表達(dá)量顯著上調(diào)。另一方面，Atlas 66在缺磷條件下的各基因表達(dá)量均大于Scout 66，說明在缺磷條件下，Atlas 66對磷的需求明顯要高于Scout 66，以此來滿足自身的生長發(fā)育需求。

2.4 不同處理條件下細(xì)胞壁中有效磷含量

植物吸收磷以滿足自身生長發(fā)育，而所吸收的磷相當(dāng)一部分量儲存于細(xì)胞壁中，基于本試驗中2個品種在磷含量上存在著差異，因此對細(xì)胞壁的磷含量進(jìn)行分析。結(jié)果（圖4）表明，不同處理條件下Atlas 66的根和地上部分細(xì)胞壁的磷含量均大于Scout 66，尤其是在缺磷條件下品種間差異顯著。說明相比于Scout 66，Atlas 66在缺磷時會有更多的磷作用于細(xì)胞壁中。

2.5 不同處理條件下果膠中的磷含量

果膠是細(xì)胞壁的重要組成成分，本試驗處理條件下，根和地上部果膠中磷的含量差異趨勢與細(xì)胞壁磷的差異趨勢一致， 均表現(xiàn)為Atlas 66大于Scout66（圖5）。

2.6 不同處理條件下根部果膠甲酯酶（PME）活性

果膠甲酯酶（PME）在細(xì)胞壁果膠去甲酯化這一過程中起重要作用，從圖6可以看出，缺磷處理后，Scout 66根中的PME活性提高相比于Atlas 66較為明顯，去甲酯化后裸露的羧基將結(jié)合陽離子進(jìn)而釋放更多的磷酸根用以磷的再利用。此外，2種磷供應(yīng)水平下，Atlas 66的PME活性均高于Scout 66，但品種間差異不顯著。

3 討論與結(jié)論

磷是作物生長發(fā)育所必需的營養(yǎng)元素，植物對無機(jī)磷的吸收和代謝過程多伴有陽離子的參與，其中也包括植物不需要的陽離子，如Al3+、Cd2+等[19]。由于磷酸根的特性而導(dǎo)致可供植物吸收利用的無機(jī)磷非常少，所以在酸性土壤上，磷和鋁2種元素同時限制植物的生長發(fā)育[20]。本試驗所用供試材料Atlas 66和Scout 66是2個鋁耐性不同的小麥品種，Atlas 66的耐鋁性顯著高于Scout 66[21]。近年來關(guān)于磷和鋁之間關(guān)系的研究報道很多，一致認(rèn)為耐鋁則磷高效、而磷高效則耐鋁[17-18，22]。那么在缺磷條件下，耐鋁性不同的作物對磷的再利用能力是否存在差異？基于這一問題，本研究在正常條件下對鋁耐性不同的2種小麥的磷含量進(jìn)行了測定，發(fā)現(xiàn)Atlas 66地上部和根的可溶性磷和全磷含量大多高于Scout 66;進(jìn)一步缺磷處理后，Atlas 66根和地上部分的可溶性磷和全磷含量大多低于Scout 66，而造成這一趨勢的原因可能是由于缺磷后的生物量差異造成的。

在磷不足時，植物會誘導(dǎo)磷相關(guān)基因的表達(dá)來增加其對磷的吸收，并將吸收的磷利用以滿足代謝及生長發(fā)育所需[10]。作為磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，PHT家族在磷的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)方面的功能也已經(jīng)非常清楚，其家族所包含的大多數(shù) PHT1 基因表達(dá)定位于植物根系且受到磷饑餓響應(yīng)上調(diào)，然后負(fù)責(zé)增加土壤中磷的吸收和植物體內(nèi)磷的遷移[23-25]。本研究也得到同樣的結(jié)論，缺磷時2種材料的磷相關(guān)基因表達(dá)量顯著上調(diào)。此外，在正常培養(yǎng)條件下Atlas 66的磷相關(guān)基因表達(dá)量大多小于Scout 66，而在缺磷時各基因的表達(dá)量大多顯著大于Scout 66，說明在缺磷條件下，Atlas 66對磷的需求要明顯高于Scout 66，以此來滿足自身的生長發(fā)育需求。

植物吸收的磷90%以上都儲存于細(xì)胞質(zhì)中，而缺磷時細(xì)胞質(zhì)中磷遷移的研究已經(jīng)明確。近年來，新的觀點(diǎn)認(rèn)為，細(xì)胞壁中吸附的磷在植物磷不足時也可以進(jìn)行再利用。在此之前，由于植物的細(xì)胞壁主要由纖維素、半纖維素、果膠等構(gòu)成，其在幫助植物抵抗重金屬脅迫中已有大量研究[14，26]。耐鋁水稻品種Nipponbare在鋁處理后根系細(xì)胞壁中果膠主要為高度甲酯化果膠，從而減少了對外界鋁的吸附，緩解植物鋁毒[27]。由于果膠帶有負(fù)電荷的特性，其可在植物磷缺乏時將細(xì)胞壁中吸附的磷酸鹽中的磷置換出來，進(jìn)而供植物再利用，而同時體外的磷解析試驗也證實了這一點(diǎn)[13-14]?；诒驹囼?種材料在鋁耐性上的差異，我們對其細(xì)胞壁的磷含量進(jìn)行了分析，Atlas 66的根和地上部細(xì)胞壁的磷含量均大于Scout 66，尤其是在缺磷條件下品種間差異顯著，而地上部果膠中磷的含量差異趨勢與細(xì)胞壁中磷的含量差異趨勢一致，說明Atlas 66將更多的磷固定在細(xì)胞壁中，細(xì)胞壁不能釋放的磷導(dǎo)致Atlas 66的磷再利用能力降低。

已有研究結(jié)果表明，高爾基體中合成的果膠具有高度的甲酯化，在果膠甲酯酶（PME）的催化下將甲酯基水解可以增加對細(xì)胞壁中陽離子的吸附，進(jìn)而釋放出無機(jī)磷[28]。本研究前期結(jié)果表明，缺磷條件下Scout 66具有相對較高的可溶性磷含量，而后面的結(jié)果表明，其細(xì)胞壁中的可溶性磷含量卻相對較低，那么2種材料細(xì)胞壁果膠甲酯酶活性的差異是否是導(dǎo)致這一結(jié)果出現(xiàn)的原因呢？經(jīng)試驗發(fā)現(xiàn)，在缺磷處理后，2個品種根中的PME活性均提高。此外，我們發(fā)現(xiàn)在正常條件下Atlas 66的PME活性比Scout 66高出31.62%，而缺磷后Atlas 66的PME活性比Scout 66高出6.65%，說明缺磷處理后Scout 66的PME活性的提高幅度大于Atlas 66，這可能也是2種材料耐鋁性差異的原因之一。

耐鋁性小麥品種Atlas 66的鮮質(zhì)量和干質(zhì)量比鋁敏感性小麥品種Scout 66低，全磷和可溶性磷含量也相對較低。但在缺磷條件下，Atlas 66的根和地上部細(xì)胞壁中的磷含量顯著高于Scout 66;另一方面，缺磷后Scout 66的PME活性的提高幅度要大于Atlas 66，說明相比于Atlas 66，Scout 66細(xì)胞壁中的果膠在缺磷時會保持一個相對較低的甲酯化度，即釋放更多的細(xì)胞壁磷，這可能也是2種材料耐鋁性差異的原因之一。

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