HPLC法測定10種香型鳳凰單叢茶咖啡因的含量

劉志聰　林麗麗

摘 要：目的：建立HPLC法測定10種潮州鳳凰茶葉中咖啡因的含量。方法：以Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18為分析柱，樣品進樣體積為10?L。流動相A為0.2%的乙腈溶液，流動相B為55%甲醇，流速為1ml/min，柱溫箱為30℃，紫外檢測器檢測波長272nm。結果：在所選條件下，樣品中咖啡因與其它組分分離良好。在咖啡因濃度為0.02～0.16mg/mL范圍內與峰面積有良好的線性關系，相關線性系數達到0.99999，加標回收率97.75%～99.83%之間，平均回收率為98.65%，RSD=0.8177%。10種鳳凰單叢茶咖啡因含量在20.50-31.00mg/g之間。結論：該方法快速準確，可用于茶葉中咖啡因含量的測定。

關鍵詞：高效液相色譜;鳳凰單叢茶;咖啡因

中圖分類號 S571.1? 文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2021）17-0159-04

The Content Determination of Caffeine in Ten Kinds of Fenghuang Dancong Tea by HPLC

LIU Zhicong et al.

（School of Life sciences and Food Engineering， HanshanNormoal Universiy ，ChouZhou 521000， China）

Abstract：AIM： To establish an HPLC method for the content determination of caffeine in ten kinds of Fenghuang tea from Chaozhou. METHODS： We taked Agilent ZORBAXEclipse XDB-C18 as analytical column， the inject volume was 10μL， and taked 0.2% acetonitrile solution as the mobile phase A and 55% methanol solution as the mobile phase B， flow rate was 1ml/min， the column temperature was 30℃，and the detection wavelength was 272nm.Under the selected conditions. RESULTS： The caffeine got an ideal separation with other compounds. The peak time of caffeine has a good liner relation with the peak area of caffeine when the concentration of caffeine range of 0.02 to 0.16mg/mL， and the relevant linear coefficient reached 0.99999（n= 5）. In addition， the adding standard recoveries were 97.75%～99.83%， the average recoveries were 98.65%， and RSD=0.8177% .The caffeine content of ten kinds of Fenghuang Dancong tea ranged from 20.50 to 31.00mg/g.CONCLUSION： This method was quick and accurate. Therefor it was suitable for the determination of caffeine in tea.

Key words：HPLC;Fenghuang Dancong tea;Caffeine

鳳凰茶產于廣東省潮州市鳳凰山區(qū)，屬于烏龍茶類，是全國六大茶類之一，具有生津止渴，減肥美容，防癌癥，抗衰老，降血脂等多種功能。鳳凰茶葉中含有多種生物堿，主要以咖啡因為主，咖啡因是一種弱堿性生物堿，在強光和高溫下穩(wěn)定性較差，脂溶性強，可溶于沸水、乙醇、丙酮、乙酸乙酯，易溶于二氯甲烷[1]。少量的咖啡因可以使身心處于一種興奮狀態(tài)，刺激機體的中樞神經系統，誘發(fā)腎上腺素釋放入血，增高機體血糖水平，使注意力集中[2]。因為咖啡因能促進新陳代謝，影響神經、心臟和腎臟的功能，所以是一種重要的醫(yī)藥原料，但是，過量的咖啡因會使人精神疲倦、身體發(fā)顫、難以入睡、刺激胃黏膜[2]，因此不適合神經衰弱者、孕婦、老人、兒童飲用。

目前測定咖啡因含量的方法很多，如薄層色譜法，紫外分光光度法和高效液相色譜法等。而薄層色譜法的分離效果直接影響測定結果的準確度，測定結果誤差較大。紫外分光光度法中，樣品的前處理過程復雜，雜質干擾嚴重，測定結果往往偏高[3]。高效液相色譜法則具有分離度與準確度高，操作簡便易行等特點[3-7]。

鳳凰單叢按香型可分成10多個類型，分別為黃桅香，芝蘭香，桂花香，蜜蘭香，玉蘭香，姜花香，杏仁香，茉莉香，肉桂香，夜來香，奇蘭香等[8]。在國內外，對潮州鳳凰茶咖啡因含量的研究鮮有報道[9、10]，而對于不同香型之間咖啡因含量的差異還未見有報道，了解其咖啡因含量的差異性，可以為給人們根據身體的實際需要選擇購買不同香型茶葉時提供咖啡因含量數據參考。本試驗采用高效液相色譜法，對10種香型鳳凰茶葉中咖啡因的含量進行準確定量，比較研究了其中的差異性。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 安捷倫1200高效液相色譜儀;KQ5200超聲波清洗器（ 昆山市超聲儀器有限公司）;萬分之一電子分析天平（（型號：FA2004，上海精密科學儀器公司）;離心機（型號：湘儀L420，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）;電熱恒溫水浴鍋（型號：HHS-11-4，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）;0.45?m微孔濾膜;咖啡因標準品（Cas：58-08-2）;雙蒸水;色譜純乙腈和甲醇等。

1.2 試驗材料 10種試驗材料為市售產于廣東省潮州市潮安區(qū)鳳凰鎮(zhèn)鳳凰山成茶，經韓山師范學院生命科學與食品工程學院鳳凰單叢茶種質評價與資源利用重點實驗室品評鑒定為春單樅（鴨屎香），春水仙，黃枝香，蜜蘭香，群體香，烏葉，杏仁香，玉蘭，芝蘭香，八仙。

1.3 測定方法

1.3.1 色譜條件 色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18柱（4，6×250mm，5?m）;流動相A為0.2%的乙腈溶液，流動相B為55%甲醇，等梯度洗脫;流速為1mL/min;柱溫：30℃;紫外檢測器檢測波長272nm;分析采集時間：10min;進樣量：10?L。

1.3.2 溶液的配制

1.3.2.1 標準品溶液的配制 準確移取濃度為0.16mg/mL的咖啡因標準品母液，以超純水作為稀釋液，配制濃度分別為0.02mg/mL，0.04mg/mL，0.08mg/mL等一系列標準工作液，于4℃冰箱下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2.2 待測樣品溶液的制備 稱取10種茶葉樣品各0.50g，研磨后置于100mL錐形瓶中，分部加入50mL 90℃的熱水，在90℃的水浴中振蕩，繼續(xù)浸提10min后，離心10min（轉速：4000r/min），取10mL上層清液于500mL容量瓶中，用超純水釋至刻度，則得到10種鳳凰茶葉的水提液，將各香型茶葉的水提液過0.45?m微孔濾膜待測[5]。

2 結果與分析

2.1 目標組分的定性 按“2.1”項色譜條件，分別對標準品溶液和10種香型鳳凰茶的樣品提取液進行分析測定，上樣量為10?L。標準品在保留時間3.198min處出峰，峰形基線分離，高斯對稱，峰形較好。以保留時間定性，樣品液測定同樣在保留時間3.198min出峰，定性為咖啡因的色譜峰，基線分離，峰形較好，滿足定量的要求，試驗結果色譜圖見圖1～11。

2.2 方法學考察

2.2.1 線性關系考察 將“2.2.1” 配制好的咖啡因系列標準工作液按“2.1”項色譜分析條件進樣分析，進樣量：10?L。以峰面積為縱坐標，標準溶液的濃度為橫坐標，進行線性回歸，其結果見圖12。從圖12可知，在咖啡因濃度為0.02～0.16mg/mL范圍內與峰面積有良好的線性關系，樣品液測定濃度均在校正曲線所取濃度點之間，線性回歸方程為Y=40137.0262X+12.191818，相關系數為r2=0.99999。

2.2.2 精密度試驗 在“2.1”項色譜分析測定條件下，對質量濃度為0.16mg/mL的咖啡因標準工作液連續(xù)進樣分析6次，分別記錄其保留時間和峰面積，結果見表1。從表1可知，在選定色譜條件下，精密度良好，能達到儀器分析檢測的要求。

2.2.3 重復性試驗 準確稱取八仙茶葉樣品，按“2.2.2”項下方法平行制備6份樣品溶液，按“2.1”項色譜條件分析測定，測得咖啡因的含量分別為0.0423，0.0417，0.0418，0.0425，0.0418，0.0419，RSD為0.7678%，表明同批樣品經多次測定，重現性良好。

2.2.4 加標回收試驗 取經過測定，咖啡因含量為0.0419mg/mL的八仙茶葉樣品溶液6份，各1mL，一份作為本底值，另外5份分別準確加入1mL 0.016 mg/mL咖啡因標準品，按照“2.1”項色譜條件測定含量，結果顯示該方法具有較高的準確度，結果表2。由表2可知，咖啡因的加標回收率在97.75%～99.83%之間，平均回收率為98.65%，RSD=0.8177%，說明本測定方法準確可靠。

2.3 樣品含量測定 精密稱取10種茶葉樣品各0.50g，按“2.2.2”項法制備各種茶葉的咖啡因樣品提取液各3份，在“2.1”項色譜條件下測定，記錄峰面積，用外標法定量每一種茶葉的咖啡因含量，結果見圖13。由圖13可知，各種鳳凰單叢茶咖啡因含量存在差異性，杏仁香中咖啡因的含量最高，而群體香含量為最低，各種茶葉之間咖啡因含量由高到底為：杏仁香>春單樅（鴨屎香）>黃枝香>春水仙>烏葉>玉蘭>芝蘭香>蜜蘭香>八仙>群體香。

注：與群體香比較，（*）p<0.05and（**）p<0.01。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇 咖啡因檢測最大吸收波長在文獻中多報道為270nm[11]，272nm[12]和274nm[4]，因此以這3個波長作為試驗波長選擇，實驗結果表明，當其它色譜檢測條件相同的情況下，對濃度為0.16mg/mL標準品進行檢測分析，結果表明在波長272nm下咖啡因的響應因子要比波長在270nm和274nm下大，考慮到靈敏度的因素[13]，故選擇272nm作為咖啡因的檢測的最大吸收波長。

3.2 流動相的優(yōu)化 對于流動相的優(yōu)化，本試驗以參考文獻報道水∶甲醇（65∶35）[1]、甲醇∶乙腈∶0.1%甲酸（20∶10∶70）[3]及甲醇∶水（5.5∶4.5）為流動相[11]作為參考，配制流動相所使用的試劑及比例進行流動相條件的優(yōu)化，結果表明當以0.2%的乙腈溶液為流動相A，以55%甲醇為流動相B時，保留時間適當，峰形較好，咖啡因與其它組分分離良好（R>1.5）。因此以0.2%的乙腈溶液和55%甲醇分別作為咖啡因檢測的流動相A和流動相B。

4 結論

本試驗建立了HPLC法測定了10種香型潮州鳳凰茶樣品中咖啡因的含量，結果表明，各種香型鳳凰茶之間存在咖啡因含量的差異，其測定結果范圍在20.50～31.00mg/g之間，其中杏仁香中咖啡因的含量最高，而群體香含量為最低。用此方法能準確測定潮州鳳凰茶中咖啡因的含量，方法靈敏度高，線性良好，準確度高，穩(wěn)定性及重復性好，能準確的測定不同香型鳳凰茶的咖啡因含量品質。

基金項目：廣東省粵東藥食資源功能物質與治未病研究重點實驗室（2021B1212040015）。

作者簡介：劉志聰（1983—），男，廣東興寧人，碩士研究生，從事天然活性產物的研究。? 收稿日期：2021-06-10

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（責編：王慧晴）