基于ITS2序列的藏當歸及易混植物DNA分子鑒定

姜釗 色里瑪 李捷 陳依春 郝婷婷 孫芳云

摘要：筆者所在實驗室長期從事藏藥基源鑒定與藥物開發(fā)，為了確保試驗藥材的質(zhì)量及臨床安全用藥，運用ITS2條形碼技術(shù)對采自西藏的藏當歸及相似植物進行分子鑒定。首先，利用試劑盒提取植物葉片的DNA，對ITS2序列進行PCR擴增，雙向測序后運用SeqMan組裝。而后，基于ITS2 Database中的Annotate注釋方法去掉兩端的5.8S區(qū)和28S區(qū)獲得ITS2條形碼并預(yù)測二級結(jié)構(gòu)，用MEGA 5.0軟件進行遺傳距離計算并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（NJ）。分析發(fā)現(xiàn)，試驗中的4種類似植物ITS2條形碼間存在明顯差異，結(jié)合二級結(jié)構(gòu)、遺傳距離、進化樹位置及形態(tài)對比可知其分為3個物種并確定了其分類地位。試驗證明，ITS2條形碼可有效快速地鑒別易混中藥材的種類，為保證其臨床用藥安全提供了簡單、高效、準確的技術(shù)手段。

關(guān)鍵詞：ITS2條形碼;藏當歸;系統(tǒng)發(fā)育分析;DNA分子鑒定

中圖分類號： R282.5? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）17-0058-05

收稿日期：2020-12-20

基金項目：西藏民族大學(xué)青年學(xué)人培育計劃（編號：19MDX01）;藏藥材基源研究及標準完善（編號：402040003）;西藏自治區(qū)自然科學(xué)基金（編號：XZ2018 ZRG-86（Z））;香蓮祛痛霜的Ⅱ期臨床實驗（編號：2015XZOIG62）。

作者簡介：姜 釗（1990—），男，陜西鎮(zhèn)安人，博士，講師，主要從事藏藥材基源研究及分類工作。E-mail：xzmu_jiangz@163.com。

通信作者：孫芳云，教授，主要從事藏藥材基源研究及藥物開發(fā)工作。E-mail：xzmvsfy@ 163.com。

藏當歸，學(xué)名白亮獨活（Heracleum candicans Wall. ex DC.），是傘形科獨活屬植物，多年生草本，花期7—8月，分布在尼泊爾、巴基斯坦以及我國的云南、西藏、四川等地。白亮獨活植物形態(tài)與《晶珠本草》等書對珠嘎的敘述相符，具有殺蟲、止血、愈瘡癰、治麻風(fēng)的功效，主治各種炎癥、麻風(fēng)、癰疽疔瘡（中華本草），還用于治療風(fēng)寒感冒頭痛、肢節(jié)風(fēng)濕痛、白癜風(fēng)及各種銀屑?。ā缎氯A本草綱要》）。藏藥學(xué)發(fā)展至今共1 300多年歷史，經(jīng)典本草書總共6本：《度母本草》《醫(yī)學(xué)四續(xù)》《藍琉璃》《晶珠本草》《甘露本草》《晶鏡本草》，而常用植物藏藥材就有近1 000種[1]。加之植物形態(tài)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，使得傳統(tǒng)的藏藥鑒定技術(shù)無法準確地進行具體藏藥及其混偽品的區(qū)分，嚴重影響藏藥的開發(fā)，也無法保證藏藥的用藥安全。筆者所在實驗室前期對采自西藏林芝、那曲、日喀則、昌都等地的藏當歸進行藥效分析試驗時發(fā)現(xiàn)各地樣本藥效和外在表型，尤其是根莖的形態(tài)都有差異，于是藏當歸及混偽品分類地位的確定成為后期藥效研究的先決條件，也是藏藥開發(fā)和利用的重中之重。西藏地區(qū)藏當歸分布普遍，常分布于海拔2 000～4 000 m，而傘形科以下的分類等級常以果實的形態(tài)、有無，脊棱的形態(tài)、油管的數(shù)目等作為種屬的分類依據(jù)[2]。Widmer等對獨活屬形態(tài)解剖研究表明，營養(yǎng)體的特征和果實的解剖特征為屬以下分類的重要依據(jù)[3]。加之有研究表明，獨活屬及芹亞科內(nèi)的幾個大屬均不是單系群。因此，藏當歸及相近植物鑒定困難，易混淆。

DNA條形碼技術(shù)是目前較為純熟、快速、準確的分子鑒定方法，相較于傳統(tǒng)的分類學(xué)研究方法更加快速、準確，在中藥材的分類鑒定中有著廣闊的前景。對于植物鑒定，DNA條形碼相對較多，其中有ITS、trnH-psbA、rbcL、matK等 [4-5]，而核糖體DNA的第2內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS2）序列由于變異較快，能夠較ITS1提供更多的變異位點信息，且其長度不到300 bp，具有結(jié)構(gòu)保守性高等特點，近年來已被提出作為藥用植物鑒定的標準條形碼序列[6-9]，并且植物ITS2序列在數(shù)據(jù)庫中數(shù)據(jù)量較大，利于系統(tǒng)比較分析。本試驗對采自西藏那曲、林芝、昌都、日喀則4個地區(qū)的4種相近外型和藥效的植物樣品基于ITS2基因進行分子驗證，并結(jié)合形態(tài)結(jié)構(gòu)，探究其分布和物種的多樣性，旨在為后期實驗室藏藥的篩選和研究奠定基礎(chǔ)，也為藏藥的應(yīng)用和識別提供更多的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

藥材由西藏甘露藏藥股份有限公司提供，分別采自昌都卡若區(qū)城關(guān)鎮(zhèn)（054）、日喀則康馬縣南尼鄉(xiāng)（055）、林芝波密縣扎木鎮(zhèn)（056）、那曲申扎縣申扎鎮(zhèn)（057），樣品采集后于-80 ℃保存（表1）。由筆者所在團隊“藏藥檢測技術(shù)教育部工程研究中心”相關(guān)藏藥鑒定專家進行實驗室樣本形態(tài)對比和鑒定，證實采集的4個樣點部分植物表型差異明顯，為不同種屬植物。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑

高速離心機（Eppendorf 5810R）;PCR擴增儀（Life）;制冰機（IMS-50）;電泳儀（JUNYI-300）;凝膠成像儀（SAGECREATION）;測序儀器ABI 3730。DNA Marker [天根生化科技（北京）有限公司的D2000，貨號：MD114-01];Tris、乙二胺四乙酸（EDTA）、冰乙酸、無水乙醇（海默生物科技有限公司）;植物基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司DP305];DNA凝膠回收試劑盒（北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司，貨號：GE0101-50）;PrimeSTAR HS DNA Polymerase （TaKaRa公司）。

1.2.2 DNA提取、PCR擴增及測序

將收集的樣品洗凈并烘干，稱取植物葉片干質(zhì)量約30～50 mg，加入液氮充分研磨成粉末狀，采用天根生化科技（北京）有限公司的植物基因組DNA提取試劑盒（DP305）提取植物基因組DNA。PCR擴增依照中藥材DNA條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則，采用內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2（ITS2）序列[10]，擴增正向引物 5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′，反向引物5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′。擴增體系（25 μL）：5×Prime STAR Buffer 5 μL，dNTP Mixture 2 μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.25 μL，正、反向引物各1 μL，模板1 μL，雙蒸水14.75 μL。 ITS2序列擴增程序為94 ℃預(yù)變性 5 min;94 ℃變性30 s，60 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸35 s，33個循環(huán);72 ℃ 延伸 10 min。擴增后，凝膠電泳檢測，之后使用DNA凝膠回收試劑盒（GE0101）進行DNA片段的純化回收并送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進行雙向測序。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

測序公司返回數(shù)據(jù)利用SeqMan軟件去除引物和低質(zhì)量序列，并進行拼接。將所有個體的雙向拼接序列結(jié)果利用Keller等的研究方法[11] （http：//its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de）中的Annotate注釋并去除兩端的58S和28S區(qū)段獲得ITS2間隔區(qū)序列，利用網(wǎng)站中的Predict預(yù)測其二級結(jié)構(gòu)。結(jié)合二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果從NCBI數(shù)據(jù)庫下載相似性較高序列去除兩端的5.8S和28S區(qū)。采用Clustal X軟件[12]進行多序列比對，比對結(jié)果通過MEGA 5.0[13]計算遺傳距離（K2P）并利用鄰近法（NJ）[14]構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，采用雙參數(shù)模型（Two-parameter model），通過Boot strapping進行系統(tǒng)發(fā)育樹的評估，自展數(shù)據(jù)集為 1 000 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 ITS2條形碼序列長度、GC含量及序列差異

測序拼接后的序列經(jīng)過數(shù)據(jù)庫去除5.8S和28S區(qū)，4個樣品條形碼序列的長度為228～229 bp，GC含量為52.4%～57.5%（表1），NCBI下載高相似性序列數(shù)據(jù)信息見表1。將NCBI收集到的高相似性序列與試驗序列一起利用MEGA 5.0做序列間的K2P距離計算，結(jié)果見表2。

從表2中可以看出，樣品054與其他3個樣品的遺傳距離為0.175，樣品055與056、057的遺傳距離為0.216，056與057的遺傳距離為0.000;054與相似性最高序列的亮蛇床（Selinum cryptotaenium）的遺傳距離為0.009;055與其相似性最高序列的白亮獨活（H. candicans）的遺傳距離為0.000，同時056和057這2個樣品與其相似性最高序列西藏凹乳芹（Vicatia thibetica）的遺傳距離也為0.000。說明054、055、056和057分別為3個不同物種，055樣品可能為藏當歸（白亮獨活），056和057可能為同一物種（西藏凹乳芹）。

2.2 系統(tǒng)進化分析

將試驗序列及NCBI得到的參考序列共20條序列經(jīng)過統(tǒng)一去除5.8S和28S區(qū)，利用Clustal X進行多序列比對，結(jié)果通過MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（NJ），見圖1-A。從進化樹中可以看到，4個樣品主要集中在3枝，054與傘形科亮蛇床（S. cryptotaenium）聚在一枝，序列相似性為93.75%，可能為一個新種。055與傘形科獨活屬的白亮獨活（H. candicans）聚在一枝，序列相似性為99.96%，該樣品可能為白亮獨活。056、057的ITS2序列一致，在進化樹中與傘形科西藏凹乳芹（V. thibetica）聚在一枝，ITS2序列相似性為100%，056及057號樣品應(yīng)為西藏凹乳芹。

2.3 二級結(jié)構(gòu)分析

將4個樣品以及系統(tǒng)進化樹中相似度較高且聚在一起的物種的ITS2序列做二級結(jié)構(gòu)比對，見圖1-B，054和S. cryptotaenium二級結(jié)構(gòu)有差異，結(jié)合系統(tǒng)進化樹的位置，054樣品可能為亮蛇床屬中一個新種;055和H. candicans的二級結(jié)構(gòu)一致，根據(jù)其在進化樹中的位置、遺傳距離及ITS2序列相似性，055樣本可能為傘形科獨活屬的白亮獨活（H. candicans），別稱藏當歸;056、057這2個樣本的二級結(jié)構(gòu)與V. thibetica的二級結(jié)構(gòu)基本一致，前期認為該樣本可能為牡丹葉當歸（Angelica paeoniifolia），但056、057這2個樣本ITS2二級結(jié)構(gòu)與牡丹葉當歸的二級結(jié)構(gòu)差異較大，并且進化樹分布相差較遠，因此056、057這2個樣本為同一物種，但不是牡丹葉當歸，056、057這2個樣本屬于西藏凹乳芹（V. thibetica），別稱野當歸。

2.4 形態(tài)對比

對比《中國植物志》（FRPS）及《中國高等植物》（HPC）中的描述。亮蛇床（S. cryptotaenium）：植株高達80 cm。根粗壯，多枝根。葉寬三角狀卵形，長8～10 cm，寬約8 cm，二至三回羽裂，小裂片長卵形或?qū)捙樞危?～3級深裂或淺裂，小裂片線形?；ㄐ驈?～10 cm，果序徑達20 cm;花序梗長10～20 cm;總苞片2～3片，線形，長約1 cm，密生糙毛，早落;傘輻12～28 cm，長5～7 cm，小總苞片5～10片，線形，長5～8 mm，常向下反曲，密生糙毛。白亮獨活（H. candicans）：該植物全株被毛，根圓柱形，莖上部多分枝。基生葉和莖下部葉有長柄;葉寬卵形或長橢圓形，長12～27 cm，一至二回羽裂，小裂片卵形或長卵形，長4～7 cm，寬2.0～4.5 cm，有不規(guī)則淺裂和鋸齒，下面密生灰白色毛;莖上部葉有寬葉鞘。復(fù)傘形花序梗長15～30 cm，總苞片1～3片，線形;傘輻長3～7 cm，小總苞片少數(shù)，線形;傘形花序有花約25朵。西藏凹乳芹（V. thibetica）：根圓錐形，長達15 cm。除傘輻基部有糙毛外，全株無毛?；~近三角形，長10～15 cm， 三出二至三回羽裂;小裂片長圓形或?qū)捖研?，長1.0～2.5 cm，寬0.5～1.5 cm，羽狀深裂或缺刻狀;頂部莖生葉細羽裂或3級裂。復(fù)傘形花序徑5～9 cm，總苞片1片或早落;傘輻8～16 cm，長2～5 cm;傘形花序有花8～13朵，小總苞片4～7片，鉆形。

經(jīng)筆者所在實驗室“藏藥檢測技術(shù)教育部工程研究中心”相關(guān)藏藥鑒定專家進行形態(tài)對比并結(jié)合ITS2序列的相似性、遺傳距離、ITS2二級結(jié)構(gòu)的相似性、系統(tǒng)進化樹位置最終確定055樣品為白亮獨活（H. candicans），別稱藏當歸。056、057這2個樣本屬于西藏凹乳芹（V. thibetica），別稱野當歸。054樣品與亮蛇床形態(tài)略有差異，根單支，并且054樣品ITS2序列相似性、遺傳距離和ITS2二級結(jié)構(gòu)都與亮蛇床有差異，因此確定054樣品可能為亮蛇床屬的一個潛在新種。

3 討論與結(jié)論

藏當歸是十大藏藥之一，應(yīng)用較為廣泛，但形態(tài)相似植物較多，只能根據(jù)零散的傳統(tǒng)形態(tài)進行區(qū)分，導(dǎo)致很多其他混偽品被錯識而入藥，因此在臨床和用藥過程中十分危險，比如，我國明確提出禁止以歐當歸和東當歸代替當歸入藥[15]，因此對入藥植物的細分和仔細鑒定十分重要。傳統(tǒng)的中藥鑒定主要是依靠基原、性狀鑒別，植物鑒別需要注重多樣的性狀，需要長期豐富的經(jīng)驗和理論基礎(chǔ)，然而大多數(shù)藥農(nóng)和普通人不具備專業(yè)知識無法做到精確判斷。DNA條形碼技術(shù)操作簡便、準確度高、不受性狀限制，可以為藥材的準確鑒定提供依據(jù)。

筆者所在實驗室采集大量的西藏藏藥植株樣本進行藥用成分分析，但部分植物由于表型接近無法仔細區(qū)分，在藏當歸的藥效研究中，對采自西藏4個地區(qū)具有豐富黃酮類化合物的植物樣本進行分子分類鑒定并結(jié)合《中國植物志》和《中國高等植物》中相關(guān)植物的形態(tài)學(xué)對比，最后確定了054樣品可能為亮蛇床屬中潛在的一個新種，055樣品為白亮獨活（H. candicans），別稱藏當歸。056、057這2個樣本屬于西藏凹乳芹（V. thibetica），別稱野當歸。

西藏藏藥植物資源較多，潛在植物多樣性豐富，相似藥效、相似表型植物容易混淆，這為精確的藏藥研究和開發(fā)增加了難度，為保證試驗研究和藥物開發(fā)資源的準確性，DNA條形碼等分子手段隨著相關(guān)數(shù)據(jù)庫的完善操作簡單、比對迅速，可為后期形態(tài)學(xué)的對比縮小范圍，并提供更多的比較依據(jù)。后期可以廣泛利用DNA條形碼對區(qū)域內(nèi)植物進行驗證，結(jié)合形態(tài)學(xué)比較，為后期藏藥的鑒定以及臨床的安全應(yīng)用提供快速、準確、多維的鑒定技術(shù)保障，也為其他植物的鑒定和研究提供參考。

參考文獻：

[1]多吉仁青，才讓南加，卻 樣. 常用藏藥材種類情況的調(diào)查分析[J]. 西藏科技，2016，275（2）：28-30.

[2]何興金. 中國獨活屬果實的解剖學(xué)研究及獨活屬的修訂[J]. 植物分類與資源學(xué)報，1998，20（3）：295-302.

[3]Widmer A，Baltisberger M. Molecular evidence for allopolyploid speciation and a single origin of the narrow endemic Draba ladina （Brassicaceae）[J]. American Journal of Botany，1999，86（9）：1282-1289.

[4]熊 波，趙志禮，倪梁紅，等. DNA條形碼技術(shù)在中藥鑒定中的應(yīng)用、局限性與展望[J]. 中藥材，2015，38（10）：2202-2206.

[5]張彩云，黃珊珊，顏海飛. DNA條形碼技術(shù)在中藥鑒定中的應(yīng)用進展[J]. 中草藥，2017，48（11）：2306-2312.

[6]Chen S，Yao H，Han J，et al. Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species[J]. PLoS One，2010，5（1）：e8613.

[7]孫稚穎，陳士林，姚 輝，等. 基于ITS2序列的羌活及其混偽品的DNA條形碼鑒定[J]. 中草藥，2012，43（3）：568-571.

[8]林 好，陳鏡安，李斯璐，等. 白前及其混偽品的ITS2分子鑒定[J]. 中藥材，2017，40（11）：2531-2536.

[9]吳亞男，許 亮，陳 靚，等. 基于ITS2條形碼的曼陀羅屬藥用植物DNA分子鑒定[J]. 中藥材，2015，38（9）：1852-1857.

[10]陳士林，姚 輝，韓建萍，等. 中藥材DNA條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則[J]. 中國中藥雜志，2013，38（2）：141-148.

[11]Keller A，Schleicher T，Schultz J，et al. 5.8S-28S rRNA interaction and HMM-based ITS2 annotation[J]. Gene，2009，430（1/2）：50-57.

[12]Thompson J D，Gibson T J，Plewniak F，et al. The CLUSTAL_X windows interface：flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools[J]. Nucleic Acids Research，1997，25（24）：4876-4882.

[13]Tamura K，Peterson D，Peterson N，et al. MEGA5：molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood，evolutionary distance，and maximum parsimony methods[J]. Molecular Biology and Evolution，2011，28（10）：2731-2739.

[14]Saitou N，Nei M. The neighbor-joining method：a new method for reconstructing phylogenetic trees[J]. Molecular Biology and Evolution，1987，4（4）：406-425.

[15]孫紅梅，張本剛，齊耀東，等. 當歸藥材資源調(diào)查與分析[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報，2009，25（23）：437-441.