涉及簇毛麥6V染色體結(jié)構(gòu)變異體的篩選與鑒定

摘 要：簇毛麥?zhǔn)切←湹囊粋€(gè)野生近緣種，抗病性、抗逆性強(qiáng)，蛋白質(zhì)和賴氨酸含量高，是小麥遺傳改良的重要基因源。為定位、轉(zhuǎn)移和利用簇毛麥有益基因，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)細(xì)胞遺傳所通過(guò)花粉輻射，獲得了一批涉及簇毛麥不同染色體且不同區(qū)段的結(jié)構(gòu)變異體。該研究從這些結(jié)構(gòu)變異體中篩選鑒定涉及簇毛麥6V染色體的結(jié)構(gòu)變異體，共篩選鑒定出13種涉及簇毛麥6V染色體的結(jié)構(gòu)變異體，包括2個(gè)整臂易位、5個(gè)小片段易位、4個(gè)大片段易位、1個(gè)缺失和1個(gè)中間插入易位，這些結(jié)構(gòu)變異體的篩選鑒定將為進(jìn)一步定位和利用簇毛麥6V染色體上的優(yōu)異基因奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：小麥;簇毛麥;染色體結(jié)構(gòu)變異體;基因組原位雜交;6V特異分子標(biāo)記

中圖分類號(hào) S512.1 ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2021）17-0021-06

Screening and Identification of Chromosomal Aberrations Involving Haynaldia villosa Chromosome 6V

ZHANG Wei

（Tongling Agricultural Technology Management Service Center， Tongling 244000， China）

Abstract： Haynaldia villosa （syn. Dasypyrum villosum） is a wild relative species of wheat （Triticum aestivum）. It has strong ability of diseases and stress resistance， high protein and lysine contents. These characters make it an important gene pool for wheat genetic improvement. To localize， transfer and use interested genes of H. villosa， a series of involving different H. villosa chromosome and chromosomal region lines induced by irradiation have been developed at the Cytogenetics Institute， Nanjing Agricultural University， China. The aim of this study is to screen and identify structural changes involving H. villosa chromosome 6V in these chromosomal aberrations. Finally， 13 types of chromosomal aberrations involving H. villosa chromosome 6V were identified， including 2 of whole arm translocations， 5 of small alien segment translocation， 4 of large alien segment translocation， 1 of chromosomal deletion and 1of intercalary translocation. Screening and identification of these chromosomal aberrations will be basis to localize and use interested genes of H. villosa chromosome 6V.

Key words： Wheat; Haynaldia villosa; Chromosomal aberrations; Genomic in situ hybridization; Specific molecular-markers of 6V

簇毛麥（Haynaldia villosa，又名Dasypyrum villosum，2n=14，VV）屬小麥族簇毛麥屬，是小麥的一個(gè)野生近緣種，它不但抗小麥白粉病、銹病、全蝕病、眼斑病等多種病害[1-3]，而且具有分蘗力強(qiáng)、抗寒耐旱、密穗多花、籽粒蛋白質(zhì)含量高等特點(diǎn)[4，5]，是小麥遺傳改良的重要基因源。目前，簇毛麥的一些基因的表型性狀已初步定位，如抗白粉病[6]、眼斑病[2，7]和癭螨[3]等基因已轉(zhuǎn)移到普通小麥背景中，分別被定位在6VS、4VL和6V染色體上。但是，與簇毛麥巨大的優(yōu)異基因源相比，還有許多可供小麥品種改良的性狀尚未利用，甚至還未定位到具體染色體或染色體片段。因此，進(jìn)一步創(chuàng)造小麥-簇毛麥染色體易位系、缺失系等材料，對(duì)簇毛麥有益基因的定位及有目標(biāo)地向普通小麥轉(zhuǎn)移顯得十分必要?；诖?，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)細(xì)胞遺傳所以硬粒小麥-簇毛麥雙倍體為基礎(chǔ)材料，利用花粉輻射與有性雜交相結(jié)合，創(chuàng)制出大量的簇毛麥染色體結(jié)構(gòu)變異體[8，9]，并對(duì)這些材料用中國(guó)春連續(xù)回交，已得到普通小麥背景中只包含一種形式的簇毛麥染色體結(jié)構(gòu)變異體的單株。準(zhǔn)確鑒定這些單株所涉及的簇毛麥染色體身份，對(duì)于簇毛麥有益基因的定位及有目標(biāo)地創(chuàng)造遺傳種質(zhì)，進(jìn)而應(yīng)用于育種研究，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和應(yīng)用價(jià)值。

簇毛麥6V染色體除攜有抗白粉病基因Pm21外，還有抗稈銹病[10]及癭螨等有益基因。本研究旨在利用簇毛麥6V的特異分子標(biāo)記篩選鑒定涉及6V的染色體結(jié)構(gòu)變異體，從而為定位和利用這些優(yōu)異基因提供遺傳中間材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 普通小麥中國(guó)春（Triticum aestivum cv. Chinese Spring，CS）、簇毛麥（H. villosa，由南京植物園從英國(guó)劍橋植物園引進(jìn)）、硬粒小麥（T. durum）（由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院引種組從國(guó)際玉米小麥改良中心引進(jìn)，編號(hào)“中引1286”）、硬粒小麥-簇毛麥雙倍體（T. durum-H. villosa amphiploid，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)細(xì)胞遺傳研究所選育）、小麥-簇毛麥二體異附加系DA6V和硬粒小麥-簇毛麥雙倍體花粉輻射的回交自交后代，均由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)細(xì)胞遺傳研究所保存提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 根尖細(xì)胞染色體制片 種子在墊有濕濾紙的培養(yǎng)皿中置25℃培養(yǎng)箱中萌發(fā)，待根長(zhǎng)1～2cm時(shí)剪取根尖，在冰水中預(yù)處理22～24h后，用卡諾氏固定液（乙醇∶冰醋酸=3∶1）固定，2～7d后在45%醋酸中壓片，-20℃冷凍揭片。

1.2.2 熒光原位雜交 熒光原位雜交程序參照Z(yǔ)hang等[11]的方法，探針包括簇毛麥基因組和來(lái)自黑麥的重復(fù)序列pSc119.2[12，13]。雜交制片洗滌染色后，在Olympus BX60型熒光顯微鏡下觀察，用Olympus DP72數(shù)碼顯微成像系統(tǒng)攝取圖像。

1.2.3 引物 選取6V上共12個(gè)特異分子標(biāo)記，引物信息見表1。以上引物均由上海英駿生物公司合成。

1.2.4 PCR反應(yīng) PCR體積為10mL，包含約20～30ng模板DNA，1×buffer，1.5mmol L-1 MgCl2，200mmol L-1 dNTP，左右引物終濃度各為0.2mmol L-1，0.5U Taq DNA聚合酶（以上試劑均來(lái)自Promega公司）。PCR程序?yàn)?4℃變性3min;94℃ 30s、55～60℃（依引物而定）50s、72℃ 1min，33個(gè)循環(huán);72℃延伸10min。

1.2.5 產(chǎn)物檢測(cè) 參照Tixier等[18]的方法檢測(cè)產(chǎn)物，其中所用Marker為DL2000（Promega）。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物或酶切產(chǎn)物中加入聚丙烯酰胺凝膠電泳專用的Loading buffer 2mL，混勻，取3mL樣液用8%聚丙烯酰胺凝膠（39∶1）電泳檢測(cè)結(jié)果。電泳時(shí)總電壓為180V，電泳1.5h左右，銀染后將膠放在凝膠成像儀上觀察照相。

1.3 簇毛麥染色體結(jié)構(gòu)變異體的分類 在本研究中，以簇毛麥為對(duì)象將染色體結(jié)構(gòu)變異分為易位（translocation）和缺失（deletion）2種類型。易位又分為外源大片段易位（large alien segment translocation，LAST，即W-V·V）、外源小片段易位（small alien segment translocation，SAST，即W·W-V）、整臂易位（whole arm translocation，WAT）以及簇毛麥型插入易位（Ti-V，即W-V-W）。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組原位雜交檢測(cè) 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)細(xì)胞遺傳所將60Co-γ射線照射的硬粒小麥-簇毛麥雙二倍體花粉，授給已去雄的普通小麥品種中國(guó)春，在M1代即用基因組原位雜交檢測(cè)到了大量的涉及簇毛麥染色體不同區(qū)段的結(jié)構(gòu)變異（易位或缺失）。但由于選用硬粒小麥-簇毛麥雙二倍體作為輻射親本，涉及整套簇毛麥染色體組，因此在早期世代，多種類型的結(jié)構(gòu)變異往往一起出現(xiàn)或伴有完整的簇毛麥染色體出現(xiàn)（圖1a，b）。

這些含有多種類型的簇毛麥染色體結(jié)構(gòu)變異體或伴有多條完整簇毛麥染色體的單株，給分子標(biāo)記分析帶來(lái)不便。對(duì)這些單株連續(xù)用普通小麥中國(guó)春回交2～3次，加上GISH的定向選擇，可以篩選得到在小麥背景中只存在有1種形式的簇毛麥染色體結(jié)構(gòu)變異材料（圖2a，b）。

目前，經(jīng)GISH檢測(cè)共得到各類簇毛麥染色體結(jié)構(gòu)變異體材料140份，其中包括：小片段易位（SAST）41份、大片段易位（LAST）32份、整臂易位（WAT）44份、簇毛麥染色體缺失（Del）18份和簇毛麥型插入易位（Ti-V）5份（圖3，其中整臂易位只給出部分示例）。

2.2 分子標(biāo)記鑒定 僅通過(guò)基因組原位雜交無(wú)法確定這些結(jié)構(gòu)變異體中所涉及的簇毛麥染色體身份，為此我們利用6V上共12個(gè)特異分子標(biāo)記對(duì)這些結(jié)構(gòu)變異體進(jìn)行了分析鑒定，圖4a-b是6V長(zhǎng)、短臂標(biāo)記CINAU93-358、CINAU91-390的擴(kuò)增結(jié)果，從圖中可以看出共有13份結(jié)構(gòu)變異體材料可擴(kuò)增出相應(yīng)的特異條帶，對(duì)照它們的GISH圖發(fā)現(xiàn)這13份結(jié)構(gòu)變異體材料分別包括：2個(gè)整臂易位（6VS·W和W·6VL）、5個(gè)小片段易位（TV02-4、TV250-1-4、TV269-4、TV143-1-1和TV279-8）、4個(gè)大片段易位（TV207-2-1、TV195-3-1、TV19-5-1和TV66-1）、1個(gè)缺失（TV196-1-1）和1個(gè)中間插入易位（TV52-1-4）。總的擴(kuò)增結(jié)果見表2。

注：“+”表示對(duì)應(yīng)列中的標(biāo)記可以在相應(yīng)行中擴(kuò)增出特異帶;“空白”表示未能擴(kuò)增出特異帶;“Ι-Ⅵ”表示標(biāo)記在染色體上的定位區(qū)域;“R”表示抗白粉病，“S”表示感白粉病。1： TV02-4; 2： TV250-1-4; 3： TV269-4; 4： TV207-2-1; 5： TV196-1-1; 6： TV195-3-1; 7： TV52-1-4; 8： TV143-1-1; 9： TV279-8; 10： TV19-5-1; 11： TV66-1。

標(biāo)記結(jié)果（表2）表明：?jiǎn)沃闠V02-4和TV250-1-4的擴(kuò)增結(jié)果相同，都涉及6VS部分區(qū)段的小片段易位，但尚不能區(qū)分兩者之間易位片段的大小;單株TV269-4也是涉及6VS部分區(qū)段的小片段易位，但其易位的片段較TV02-4和TV250-1-4的大;單株TV207-2-1是涉及6VS整臂及6VL部分區(qū)段的大片段易位，所涉及的6VL區(qū)域不含任何6VL的標(biāo)記;單株TV196-1-1是涉及6VL末端的缺失染色體;單株TV195-3-1能擴(kuò)增出6V所有的標(biāo)記，易位的片段最大;TV52-1-4是一個(gè)中間插入易位，它僅能擴(kuò)增出CINAU91-390這個(gè)標(biāo)記，插入的是6VS片段;單株TV143-1-1和TV279-8的擴(kuò)增結(jié)果相同，都是涉及6VL的小片段易位，但無(wú)法區(qū)分兩者之間易位片段的大小;單株TV19-5-1能擴(kuò)增出長(zhǎng)臂的3個(gè)標(biāo)記，但只擴(kuò)增出短臂的近著絲粒區(qū)域的1個(gè)標(biāo)記，而TV66-1除擴(kuò)增出長(zhǎng)臂所有標(biāo)記外，還能擴(kuò)增出位于短臂不同區(qū)域的7個(gè)標(biāo)記，所涉及的6VS區(qū)域較TV19-5-1的大。

根據(jù)表2中標(biāo)記的擴(kuò)增結(jié)果和引物設(shè)計(jì)所用EST序列的定位信息，對(duì)6V染色體的標(biāo)記進(jìn)行了初步的物理定位（圖5），短臂9個(gè)標(biāo)記被分為4個(gè)區(qū)域：Ι區(qū)2個(gè)標(biāo)記定位于FL：0.65～1.00，Ⅱ區(qū)5個(gè)標(biāo)記定位于FL：0.45～0.58，Ш區(qū)1個(gè)標(biāo)記定位于FL：0.35～0.45，Ⅳ區(qū)1個(gè)標(biāo)記定位于FL：0.00～0.35;長(zhǎng)臂3個(gè)標(biāo)記被分為2個(gè)區(qū)域：Ⅴ區(qū)2個(gè)標(biāo)記定位于FL：0.55～0.90;Ⅵ區(qū)1個(gè)標(biāo)記定位于FL：0.90～1.00。

2.3 熒光原位雜交分析 來(lái)自黑麥的重復(fù)序列pSc119.2可以在簇毛麥6V染色體的末端產(chǎn)生雜交信號(hào)（張偉，私人通訊），利用這一特點(diǎn)對(duì)涉及6V的13份結(jié)構(gòu)變異體進(jìn)行了分析。對(duì)同一張染色體制片，首先進(jìn)行基因組原位雜交，將信號(hào)洗掉后再利用Digoxigenin-11-dUTP標(biāo)記的pSc119.2作為探針進(jìn)行熒光原位雜交（圖6）。從圖6可以看出，pSc119.2在6V染色體的2個(gè)末端都有紅色的雜交信號(hào)，TV52-1-4是一個(gè)中間插入易位，沒有pSc119.2的雜交信號(hào)，表明是插入了6VS染色體的中部區(qū)域;其他12份材料都有紅色的pSc119.2的雜交信號(hào)，表明這些結(jié)構(gòu)變異體都保留了6V的1個(gè)原始末端。材料TV250-1-4的pSc119.2的信號(hào)出現(xiàn)在了易位染色體的近末端，可能是由于輻射引起的斷裂-重接的原因，6VS的末端連接到了小麥染色體上。

3 討論

南京農(nóng)業(yè)大學(xué)細(xì)胞遺傳所一直致力于簇毛麥有益基因的利用和轉(zhuǎn)移研究，培育出的含有抗白粉病基因Pm21的6VS·6AL易位系已在小麥育種中得到了廣泛應(yīng)用，并育成了南農(nóng)9918[19]、石麥14、內(nèi)麥9號(hào)等高抗白粉病的小麥品種。但相對(duì)于簇毛麥龐大的優(yōu)良基因資源來(lái)說(shuō)，目前應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)中的并不多，一些基因甚至還未定位到具體的染色體或染色體片段上。這一方面是因?yàn)闆]有合適的群體對(duì)這些基因進(jìn)行標(biāo)記定位;另一方面是由于涉及相關(guān)染色體不同斷裂位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)變異體的數(shù)量偏少。因此，開發(fā)高效誘導(dǎo)和高效篩選結(jié)構(gòu)變異體的方法更具現(xiàn)實(shí)意義。Bie等[8]和Cao等[9]將60Co-γ射線照射的硬粒小麥-簇毛麥雙倍體花粉，授給已去雄的普通小麥品種中國(guó)春，在M1代即用基因組原位雜交檢測(cè)到了大量涉及簇毛麥染色體不同區(qū)段的結(jié)構(gòu)變異（易位或缺失），在對(duì)這些結(jié)構(gòu)變異體的傳遞率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)時(shí)發(fā)現(xiàn)，多數(shù)結(jié)構(gòu)變異體能在后代中穩(wěn)定地傳遞。對(duì)這些結(jié)構(gòu)變異體單株，用中國(guó)春連續(xù)回交，經(jīng)GISH檢測(cè)已得到了140份在小麥背景中只存在一種形式的簇毛麥染色體結(jié)構(gòu)變異體。用簇毛麥各條染色體的特異分子標(biāo)記對(duì)這些結(jié)構(gòu)變異體分析，可以快速地確定其涉及的簇毛麥染色體身份。本研究利用簇毛麥6V染色體的標(biāo)記，共篩選鑒定出13份涉及6V的結(jié)構(gòu)變異體。另外，利用pSc119.2在簇毛麥6V染色體末端產(chǎn)生的雜交信號(hào)來(lái)判斷輻射造成的斷裂-重接過(guò)程中，其末端是否發(fā)生了變化，本研究中材料TV250-1-4就是末端連接到小麥染色體上形成的易位染色體。

簇毛麥6V染色體除含抗白粉病基因Pm21外，還有抗稈銹病及癭螨等基因，Qi等[10]利用著絲粒斷裂-融合在中國(guó)春-簇毛麥6V二體附加系與中國(guó)春6D單體雜交后代中選育出補(bǔ)償性易位系T6AS·6VL，該易位系在溫度16℃條件下對(duì)由小種Ug99（TTKSK）引起的小麥稈銹病有很好抗性，并將抗性基因定位于6V長(zhǎng)臂上，命名為Sr52。本研究篩選鑒定的涉及6VL區(qū)域的結(jié)構(gòu)變異體共8份，目前這些變異體的抗性鑒定正在進(jìn)行之中，結(jié)合抗性結(jié)果可以進(jìn)一步定位該基因。

目前，所篩選的13份結(jié)構(gòu)變異體中多數(shù)仍處于雜合狀態(tài)，遺傳上仍不穩(wěn)定，除了在自交過(guò)程中發(fā)生丟失外，還會(huì)出現(xiàn)著絲粒錯(cuò)分裂。在自交過(guò)程中選育到純合的結(jié)構(gòu)變異體可能需要較多世代，而利用花藥培養(yǎng)并誘導(dǎo)加倍單倍體有可能加快選育的進(jìn)程，這項(xiàng)工作本實(shí)驗(yàn)室正在開展之中。

作者簡(jiǎn)介：張偉（1980—），男，安徽銅陵人，博士，高級(jí)農(nóng)藝師，從事農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣工作。? 收稿日期：2021-05-12

參考文獻(xiàn)

[1]Qi L L，Chen P D，Liu D J，et al.The gene Pm21-a new source for resistance to wheat powdery mildew[J]. Acta Agron Sin，1995，21（3）： 257-262 （in Chinese with English abstract）.

[2]Murray T D，De La Pena R C，Yildrim A，et al. A new source of resistance to Pseudocercosporella herpotrichoides，cause of eyespot disease of aheat，located on chromosome 4V of Dasypyrum villosum[J]. Plant Breed，1994，113： 281-286.

[3]Chen Q，Conner R L，Laroche A. Molecular characterization of Haynaldia villosa chromatin in wheat lines carrying resistance to wheat curl mite colonization[J]. Theor Appl Genet，1996，93： 679-684.

[4]Blanco A，Resta P，Simeone R，et al. Chromosomal location of seed storage protein genes in the genome of Dasypyrum villosum （L.） Candargy[J]. Theor Appl Genet，1991，82： 358-362.

[5]De Pace C，Snidaro D，Ciaffi M，et al. Introgression of Dasypyrum villosum chromatin into common wheat improves grain protein quality[J]. Euphytica，2001，117： 67-75.

[6]Liu D J，Chen P D，Pei G Z，et al. Transfer of Haynaldia villosa chromosomes into Triticum aestivum. In： Miller T E，Koebner R M D. （eds）. Proc 7th Int Wheat Genet Symp，Cambridge，U.K. 1988：355-361.

[7]Yildirim A，Jones S S，Murray T D. Mapping a gene conferring resistance to Pseudocercosporella herpotrichoides on chromosome 4V of Dasypyrum villosum in a wheat background[J]. Genome，1998，41： 1-6.

[8]Bie T D，Cao Y P，Chen P D. Mass production of intergeneric chromosomal translocatons through pollen irradiation of Triticum durum-Haynaldia villosa amphiploid[J]. J Integr Plant Biol，2007，49： 1619-1626.

[9]Cao Y P，Bie T D，Wang X E，et al.Induction and transmission of wheat-Haynaldia villosa chromosomal translocations[J]. J Genet Genomics，2009，36： 313-320.

[10]Qi L L，Pumphrey M O，F(xiàn)riebe B，et al. A novel Robertsonian translocation event leads to transfer of a stem rust resistance gene （Sr52） effective against race Ug99 from Dasypyrum villosum into bread wheat[J]. Theor Appl Genet，2011，123： 159-167.

[11]Zhang W，Gao A L，Zhou B，et al. Screening and applying wheat microsatellite markers to trace individual Haynaldia villosa chromosomes[J]. Acta Genetica Sinica，2006，33（3）： 236-243.

[12]Bedbrook JR，Jones J，?Neill M，et al. A molecular description of telomeric heterochromatin in Secale species[J]. Cell，1980，19： 545-560.

[13]McIntyre CL，Pereira S，Moran LB，et al. New Secale cereale （rye） DNA derivatives for the detection of rye chromosome segments in wheat[J]. Genome，1990，33： 635-640.

[14]Cao A Z，Wang X E，Chen Y P，et al. A sequence-specific PCR marker linked with Pm21 distinguishes chromosome 6AS，6BS，6DS of Triticum aestivum and 6VS of Haynaldia villosa[J]. Plant Breed，2006，125：201-205.

[15]Chen Y P，Wang H Z，Cao A Z，et al. Cloning of a resistance gene analog from wheat and development of a co-domninant PCR marker for Pm21[J]. J Integr plant Biol，2006，48（6）：715-721.

[16]王春梅，別同德，陳全戰(zhàn)，等.簇毛麥6V染色體短臂特異分子標(biāo)記的開發(fā)和應(yīng)用[J].作物學(xué)報(bào)，2007a，33（10）：1595-1600.

[17]陳升位，陳佩度.簇毛麥6V染色體短臂特異性EST標(biāo)記的開發(fā)及缺失定位[J].麥類作物學(xué)報(bào)，2010，30（5）： 789-795.

[18]Tixier M H，Sourdille P M S. Detection of wheat microsatellite using no-radioactive silvermitrate staining method[J].Genet Breed，1997，51： 175-177.

[19]Chen PD，Zhang SZ，Wang XE，et al. New wheat variety Nannong 9918 with high yield and powdery mildew resistance[J].J Nanjing Agric Univ，2002，25（4）：105-106（in Chinese with English abstract）.

（責(zé)編：張宏民）