速生型普通產(chǎn)酮基古龍酸菌的高通量篩選方法

盧曉明，李曉東

（石藥集團(tuán) 維生藥業(yè)（石家莊） 有限公司，河北 石家莊 050035）

0 引 言

國內(nèi)維生素C 的生產(chǎn)采用兩步發(fā)酵的生產(chǎn)工藝，第1 步是單菌發(fā)酵，將D- 山梨醇轉(zhuǎn)化成L-山梨糖；第2 步是混合菌發(fā)酵，通過普通產(chǎn)酮基古龍酸菌（Ketogulonicigenium vulgare） （俗稱小菌）及其伴生菌巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）（俗稱大菌） 的共同作用將L- 山梨糖轉(zhuǎn)化成2- 酮基- L- 古龍酸（2- KGA），其中小菌為產(chǎn)酸菌，其代謝產(chǎn)酸能力決定發(fā)酵強(qiáng)度。因此，選育生長快、產(chǎn)酸速率高的速生型小菌是提高生產(chǎn)效率的關(guān)鍵。

普通產(chǎn)酮基古龍酸菌的生長代謝受多種脫氫酶的影響，由于菌株誘變后菌體形態(tài)和菌落特征發(fā)生改變的幾率很小，挑選沒有目的性。為了避免漏篩，對(duì)誘變后存活單菌落基本上是全部檢測(cè)，由于菌落直徑不足1 mm，常規(guī)的篩選方法需將單菌落富集培養(yǎng)后，再通過試管或搖瓶培養(yǎng)，根據(jù)每個(gè)菌株的生長產(chǎn)酸情況判定取舍，篩選量大，且周期很長。

瓊脂平板篩選法和微孔板篩選方法是目前常用的2 種篩選方法。

劉志鈺等人通過抑菌圈和微孔板法篩選出高產(chǎn)菌。

劉堂浩等人利用熒光強(qiáng)度變化高通量篩選產(chǎn)酪氨酸釀酒酵母。

目前，尚無普通產(chǎn)酮基古龍酸菌基于酶學(xué)特性及產(chǎn)物特點(diǎn)等方面的高通量篩選方法的報(bào)道。由于普通產(chǎn)酮基古龍酸菌為好氧菌，生長較慢，對(duì)雜菌的抵御能力弱，篩選過程需振蕩培養(yǎng)，并保證無菌度，不適于用微孔板或深孔板培養(yǎng)等裝置進(jìn)行篩選。

基于上述原因，為了防止漏篩、提高篩選效率和準(zhǔn)確性，本研究對(duì)檢測(cè)手段和培養(yǎng)裝置進(jìn)行更新，通過在固體平板和液體培養(yǎng)基中添加適量混合指示劑，使反應(yīng)體系在pH=6.0～7.0 顏色變化靈敏；同時(shí)，采用可滅菌的2 mL 圓底離心管作為培養(yǎng)裝置，裝液量少，可直接培養(yǎng)小菌單菌落，無需先經(jīng)過擴(kuò)大培養(yǎng)再檢測(cè)。

建立了基于培養(yǎng)基顏色鑒別與離心管組合培養(yǎng)相結(jié)合的適用于普通產(chǎn)酮基古龍酸菌的高通量篩選方法，縮短了檢測(cè)周期，并大幅提高了單次檢測(cè)數(shù)量。通過此方法，選育得到了一株生長快產(chǎn)酸高的速生型菌株。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 株普通產(chǎn)酮基古龍酸菌，編號(hào)為843，由維生藥業(yè)（石家莊） 有限公司提供。

1.1.2 試 劑

（1） 溴甲酚紫。

（2） 溴百里酚藍(lán)。

（3） 甲基紅。

以上試劑均購自于天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 儀 器

（1） 生物顯微鏡：XSP- 9CP，上海光密儀器。

（2） 恒溫培養(yǎng)搖床：QYC- 2112，上海?，敗?/p>

（3） 恒溫培養(yǎng)箱：DPX- 9082B，上海福瑪。

（4） 潔凈工作臺(tái)：SW- CJ- 1CU，蘇凈安泰。

（5） 全自動(dòng)發(fā)酵罐：BLBIO- 50SQA，上海百侖。

1.1.4 培養(yǎng)基

（1） 鑒別固體培養(yǎng)基（g/L）：山梨糖15、酵母膏3、玉米漿3、蛋白胨8、尿素1、MgSO4·7H2O 0.1、KH2PO41、CaCO31、溴甲酚紫、溴百里酚藍(lán)、甲基紅混合指示劑0.05、瓊脂15，pH=7.0～7.5。

（2） 鑒別種液培養(yǎng)基（g/L）：山梨糖15、酵母膏3、玉米漿3、蛋白胨10、尿素1、MgSO4·7H2O 0.1、KH2PO41、溴甲酚紫、溴百里酚藍(lán)、甲基紅混合指示劑0.02，pH=6.8～7.2。

（3） 發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：山梨糖80、酵母膏1、玉米漿12、尿素10、KH2PO41、MgSO4·7H2O 0.1、CaCO35，pH=6.8～7.2。

1.2 方 法

1.2.1 誘變菌株的固體平板鑒別

（1） 稀釋分離：將經(jīng)過誘變處理的小菌菌體懸液用無菌蒸餾水逐級(jí)稀釋至1/1000，吸取0.05～0.1 mL 稀釋液，均勻涂布于鑒別固體養(yǎng)基平板中，在30±2 ℃靜置培養(yǎng)。

（2） 鑒別培養(yǎng)：恒溫培養(yǎng)48 h，開始觀察單菌落生長和菌落周圍培養(yǎng)基顏色改變情況。

1.2.2 誘變菌株的菌液鑒別

（1） 培養(yǎng)裝置的設(shè)計(jì)制作

將數(shù)十支2 mL 圓底離心管置于1 個(gè)離心管盒中，組成1 個(gè)培養(yǎng)單元，每支離心管分裝0.5 mL鑒別種液培養(yǎng)基，在121±1 ℃滅菌15 min，備用。每批次根據(jù)待檢菌株的多少設(shè)置培養(yǎng)單元的數(shù)量。

（2） 種液鑒別培養(yǎng)

在潔凈工作臺(tái)上，用無菌勺挖取平板上誘變存活的單菌落，接入裝有無菌鑒別種液培養(yǎng)基的離心管中，立即關(guān)閉管蓋，每個(gè)菌落對(duì)應(yīng)1 支離心管。從每個(gè)培養(yǎng)單元中取1 支管，同時(shí)接入1 個(gè)未經(jīng)誘變的對(duì)照單菌落，作為陽性對(duì)照，1 支空白培養(yǎng)基作為對(duì)照。

在30±2 ℃、200 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)24 ～48 h，觀察菌液的顏色變化。

1.2.3 培養(yǎng)基顏色變化程度與產(chǎn)酸關(guān)系的判斷

（1） 固體平板：挑取變色程度及變色圈大小不同的小菌單菌落，分別接入裝有鑒別種液培養(yǎng)基的離心管中，并留一管培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。

在30±2 ℃、200 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)40 ～48 h，觀察顏色變化。

（2） 種液培養(yǎng)基：挑取1 個(gè)大菌單菌落，溶于10 mL 無菌水中，振蕩形成菌懸液。分別吸取0.1 mL 大菌菌液，接入（1） 所述的離心管組中的變色程度不同的小菌菌液中，組成大小菌混合液。搖勻后，全部轉(zhuǎn)移至30 mL/250 mL 三角瓶種液培養(yǎng)基中。在30±2 ℃、200 r/min 條件下培養(yǎng)18 ～24 h，測(cè)定2- KGA 的生成量。

再吸取5 mL 種液，轉(zhuǎn)接入40 mL/500 mL 三角瓶的發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)24、48 h，取樣測(cè)定2- KGA 的生成量，考察離心管菌液的變色程度及變色時(shí)間與產(chǎn)酸的關(guān)系。

1.2.4 速生菌株的驗(yàn)證

將通過上述方法得到的速生型菌株與對(duì)照菌株進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)。制備出2 個(gè)菌株的大菌與小菌的混合斜面，用接種環(huán)分別刮取一環(huán)菌苔，接入100 mL/500 mL 三角瓶種液的培養(yǎng)基中。在30±2 ℃、200 r/min 條件下培養(yǎng)17～20 h，即完成了種液的制備。

再吸取5 mL 種液，轉(zhuǎn)接入40 mL/500 mL 三角瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵對(duì)比，測(cè)定不同時(shí)期的產(chǎn)酸量。

2 結(jié)果與分析

2.1 固體平板鑒別結(jié)果

經(jīng)過誘變的小菌懸液，在鑒別固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，開始觀察單菌落生長狀態(tài)和菌落周圍培養(yǎng)基顏色改變情況。此后每隔8 h 觀察一次，單菌落周圍的培養(yǎng)基顏色開始變黃時(shí)進(jìn)行標(biāo)記，編號(hào)原則為首次發(fā)生變色時(shí)間- 菌落序號(hào)。

單菌落產(chǎn)酸初篩鑒別代表性結(jié)果如圖1 所示。

圖1 單菌落變色圈Fig. 1 Discolored circle of single colony

2.2 種液篩選結(jié)果

挑取固體平板上的誘變存活的單菌落，分別接入離心管組的鑒別種液的培養(yǎng)中，振蕩培養(yǎng)24～ 48 h。

觀察部分離心管中的菌液顏色陸續(xù)發(fā)生改變，從藍(lán)綠色變?yōu)榈G色，繼續(xù)培養(yǎng)，顏色逐漸變?yōu)辄S色，目測(cè)能分辨各管間存在的顏色差異。至培養(yǎng)結(jié)束，空白培養(yǎng)基變?yōu)樗{(lán)綠色，陽性對(duì)照管為淡黃綠色，顏色越黃，pH 值相對(duì)越低。

菌液顏色變化情況結(jié)果如圖2 所示。

圖2 菌液顏色變化情況Fig. 2 Color change of bacterial liquid

2.3 菌液顏色變化與產(chǎn)酸的對(duì)應(yīng)關(guān)系

對(duì)經(jīng)過離心管組鑒別培養(yǎng)得到的混合液，先進(jìn)行種液培養(yǎng)，再轉(zhuǎn)接入發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)和產(chǎn)酸檢測(cè)，考察鑒別培養(yǎng)基中菌液顏色變化與2- 酮基- L- 古龍酸生成量是否存在對(duì)應(yīng)關(guān)系。

菌株編號(hào)原則為單菌落首次發(fā)生變色的時(shí)間-菌落序號(hào)。菌液顏色變化與產(chǎn)酸對(duì)應(yīng)關(guān)系的檢測(cè)結(jié)果見表1。

表1 菌液顏色變化與產(chǎn)酸對(duì)應(yīng)關(guān)系Table 1 Corresponding relationship between color change of bacterial liquid and acid production

菌液出現(xiàn)顏色變化的程度與其產(chǎn)酸能力的對(duì)應(yīng) 趨勢(shì)如圖3 所示。

圖3 顏色變化的程度與產(chǎn)酸能力的對(duì)應(yīng)趨勢(shì)Fig. 3 Corresponding trend between the degree of color change and acid prodution capacity

由表1、圖3 可以看出，在鑒別固體培養(yǎng)中，最早出現(xiàn)變色圈的菌株K56- 1、K56- 2 在種液鑒別培養(yǎng)過程中也率先產(chǎn)生顏色變化，且種液最早出現(xiàn)變色的K56- 1 黃色最深，種液和發(fā)酵瓶培養(yǎng)產(chǎn)酸量也相對(duì)最高。結(jié)果反映出種液變黃的時(shí)間和程度與菌株的產(chǎn)酸量呈現(xiàn)一定的對(duì)應(yīng)關(guān)系。

2.4 速生菌株的發(fā)酵數(shù)據(jù)驗(yàn)證

2.4.1 搖瓶發(fā)酵對(duì)比確定速生型菌株

將初篩得到的鑒別培養(yǎng)變色較早、產(chǎn)酸相對(duì)較高的K56- 1、K56- 2、K64- 1、K64- 2 4 個(gè)菌株與對(duì)照菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵對(duì)比實(shí)驗(yàn)，確定速生型菌株。

首先制備上述菌株的大菌和小菌混合斜面，用接種環(huán)分別刮取一環(huán)菌苔，接入100 mL/500 mL 三角瓶種液培養(yǎng)基中，在30±2 ℃、200 r/min 條件下培養(yǎng)19 h，完成種液制備。

再吸取5 mL 種液，轉(zhuǎn)接入40 mL/500 mL 三角瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵對(duì)比，測(cè)定不同時(shí)期的產(chǎn)酸量。

搖瓶發(fā)酵對(duì)比數(shù)據(jù)結(jié)果見表2。

表2 搖瓶發(fā)酵對(duì)比數(shù)據(jù)Table 2 Comparison data of shake flask fermentation

由表2 可以看出，經(jīng)過3 批次的對(duì)比實(shí)驗(yàn)，菌株K56- 1 生長產(chǎn)酸具有明顯優(yōu)勢(shì)，選定將該菌株作為速生型新菌種進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證。

2.4.2 發(fā)酵數(shù)據(jù)驗(yàn)證

利用2 個(gè)50 L 發(fā)酵罐，將速生型菌種K56- 1與生產(chǎn)對(duì)照菌種進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵驗(yàn)證數(shù)據(jù)結(jié)果見表3。

表3 發(fā)酵驗(yàn)證數(shù)據(jù)Table 3 Fermentation verification data

由表3 可以看出，K56- 1 平均發(fā)酵的周期縮短2.38 h， 產(chǎn)酸速率提高0.18 mg/ (mL·h)， 約占7.23%，驗(yàn)證了新菌種K56- 1 具有速生、產(chǎn)酸快的性能優(yōu)勢(shì)。

3 結(jié)果討論

近年來，基于熒光信號(hào)的高通量篩選，以及迅速發(fā)展的超高通量FACS 和DMFS ，已成為酶和細(xì)胞工廠改造中最新應(yīng)用。

Liu Yongfei 等人通過建立色氨酸特異性適配體生物傳感器和熒光激活液滴分選技術(shù)，篩選到色氨酸高產(chǎn)菌株。

本研究根據(jù)普通產(chǎn)酮基古龍酸菌在生長代謝過程中可將底物山梨糖氧化生成2- 酮基- L- 古龍酸，使反應(yīng)體系pH 值下降的特點(diǎn)，開發(fā)了指示劑鑒別檢測(cè)方法，并利用離心管所具備的密閉性好、高溫滅菌、避免孔板培養(yǎng)無法確保無菌度的弱點(diǎn)、可振蕩培養(yǎng)滿足菌株的好氧需求等優(yōu)勢(shì)，實(shí)現(xiàn)了普通產(chǎn)酮基古龍酸菌速生菌株的高通量篩選。

4 結(jié) 語

實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)本研究建立的指示劑鑒別檢測(cè)的方法可行，菌株生長產(chǎn)酸情況與培養(yǎng)基顏色變化存在一定的對(duì)應(yīng)關(guān)系，可用于普通產(chǎn)酮基古龍酸菌的篩選。

離心管組合培養(yǎng)技術(shù)既可滿足單管獨(dú)立進(jìn)行無菌操作和振蕩培養(yǎng)需求，又可組合進(jìn)行批量培養(yǎng)和檢測(cè)，達(dá)到了快速便捷的高通量篩選目的。

通過此方法選育得到了生長快、產(chǎn)酸高的速生型普通產(chǎn)酮基古龍酸菌株K56- 1，經(jīng)過發(fā)酵驗(yàn)證，與對(duì)照菌種相比，其發(fā)酵平均周期縮短2.38 h，2- KGA 生成速率提升7.23%。