種植密度對雪茄煙膜脂過氧化特性及煙葉質(zhì)量的影響

李金奧 張思唯 劉博遠 鐘 秋 秦艷青 鄒宇航 趙銘欽

（1河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，450002，河南鄭州；2四川省煙草公司德陽市公司，618400，四川德陽）

雪茄煙是一種特殊的煙草制品，由雪茄煙葉直接卷制而成，具有味苦透甘、香氣醇厚和滿足感強等特點。目前國產(chǎn)雪茄煙所用原料大部分依賴進口，國內(nèi)雪茄煙原料生產(chǎn)起步較晚，整體質(zhì)量偏低。四川省是我國傳統(tǒng)晾曬煙產(chǎn)區(qū)，其生態(tài)條件適宜雪茄煙生長，但栽培調(diào)制技術(shù)尚未形成規(guī)范，仍存在施氮量過高、種植密度過大和起壟方式不規(guī)范等問題，種植的雪茄煙煙葉質(zhì)量無法滿足國內(nèi)雪茄煙工業(yè)生產(chǎn)需求[1]。

不同種植密度對煙田光、溫、水和土等因素有重要影響，有研究表明，這些因素也會影響植物體內(nèi)抗氧化酶活性[2-3]。四川地區(qū)降雨量較大，土壤通透性較差，不利于雪茄煙伸根期根系的生長發(fā)育，容易造成煙葉后期抗逆性較差[4]。種植密度過低時無法保證煙葉產(chǎn)量，過高時則影響煙葉發(fā)育，降低煙葉質(zhì)量[5]。煙葉進入成熟期后，中上部煙葉在高溫高光等不良因素脅迫下易發(fā)生早衰和假熟等現(xiàn)象，煙葉膜脂過氧化程度加大，使煙葉出現(xiàn)粗筋和厚葉等現(xiàn)象，嚴重影響煙葉品質(zhì)[6-8]。研究表明，影響植物體內(nèi)抗氧化酶活性的因素主要為溫度、水分、光照強度、氮素分布以及煙葉自身成熟度等。谷萌萌等[9]研究表明，煙葉生長前期降雨量和成熟期高溫與煙葉“高溫逼熟”發(fā)生率有正相關(guān)關(guān)系；盧素萍等[10]研究表明，不同光質(zhì)對煙葉膜脂過氧化程度有重要的影響；王志恒等[11]研究表明，高溫對植物膜脂過氧化特性有顯著的影響。

目前關(guān)于煙草膜脂過氧化特性的研究主要圍繞在烤煙方面，雪茄煙作為一種新型煙草，與傳統(tǒng)烤煙有所不同，其葉片較薄，留葉數(shù)較少，成熟周期較短。國內(nèi)現(xiàn)有研究大多是對煙葉化學(xué)成分等調(diào)制后指標進行分析，極少關(guān)注不同種植密度對煙葉膜脂過氧化特性的影響，而從近些年四川雪茄煙生產(chǎn)實際中發(fā)現(xiàn)，四川省目前的種植密度可能過高，影響了四川省雪茄煙的煙葉質(zhì)量。本試驗通過探究不同種植密度下雪茄煙煙葉抗氧化能力的強弱及不同環(huán)境因素對煙葉膜脂過氧化程度的影響，結(jié)合其化學(xué)成分、感官質(zhì)量和經(jīng)濟性狀的差異，確定適宜四川省雪茄煙的種植密度，為提高四川省雪茄煙煙葉產(chǎn)量和質(zhì)量及工業(yè)可用性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2019年4-9月在四川省德陽市什邡市師古鎮(zhèn)洛陽村試驗田進行，供試土壤為砂壤土，前茬作物為水稻。試驗田地勢平坦，肥力均勻，土壤pH值5.38，有機質(zhì)28.66g/kg，速效鉀85.71mg/kg，速效磷34.22mg/kg，堿解氮120mg/kg，供試品種為當?shù)刂髟匝┣褵熎贩N德雪一號。當?shù)爻Ｒ?guī)種植密度為24 000株/hm2，行距110cm，株距38cm。

1.2 試驗設(shè)計

試驗共設(shè)置5個處理：18 000株/hm2，行距120cm，株距46cm（T1）；19 500株/hm2，行距120cm，株距43cm（T2）；21 000株/hm2，行距120cm，株距40cm（T3）；22 500株/hm2，行距110cm，株距40cm（T4）；24 000株/hm2，行距110cm，株距38cm（T5）。每個處理設(shè)3次重復(fù)，共15個小區(qū)，小區(qū)面積200m2。田塊周圍設(shè)保護行，小區(qū)間設(shè)0.5m寬過道。

煙株于2019年4月30日移栽，移栽后55d打頂，留葉數(shù)18～20片。氮肥水平為總施氮量150kg/hm2（N∶P2O5∶K2O 為 1∶0.5∶2），肥料為當?shù)責(zé)煵莨咎峁┑臒煵輰Ｓ脧?fù)合肥375kg/hm2（N∶P2O5∶K2O=10∶20∶20）、硝酸鉀農(nóng)業(yè)肥 675kg/hm2（N∶P2O5∶K2O=13∶0∶46）和河南農(nóng)業(yè)大學(xué)國家煙草栽培生理生化研究基地提供的煙草高炭基肥750kg/hm2（N∶P2O5∶K2O=1.7∶0∶0）。肥料分別于植株移栽前以及移栽后30d條施于試驗田中?；逝c追肥比例為7∶3。田間管理與后續(xù)調(diào)制按當?shù)匮┣褵熒a(chǎn)技術(shù)標準統(tǒng)一進行。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 田間微環(huán)境 自打頂后7d開始，每7d在各小區(qū)使用五點取樣法于上午10∶00-11∶00氣候穩(wěn)定時測定。使用WS-2020溫濕度表（江蘇龍禾電子有限公司）在距地面20cm處測定壟間溫濕度；使用TES1332A數(shù)字式照度計（泰仕電子工業(yè)股份有限公司）在煙株從下至上10～12片煙葉處測定煙葉接收的光強。

1.3.2 丙二醛（MDA）含量 自打頂后7d開始，每小區(qū)選取長勢均勻的煙株20株進行掛牌標記，每7d選取煙株從下至上10～12片煙葉，在葉片中部剪取0.1g葉片放入液氮保存，然后采用雙組分分光光度計法測定煙葉MDA含量[12]，每個處理重復(fù)3次。

1.3.3 抗氧化酶活性 取樣及保存方法同1.3.2，采用愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶（POD）活性[13]、分光光度法測定過氧化氫酶（CAT）活性[14]以及NBT光還原法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性[15]，每個處理重復(fù)3次。

1.3.4 煙葉常規(guī)化學(xué)成分 取各處理調(diào)制后中部三等煙葉各1kg，于60℃烘干，研磨粉碎后過60目篩，稱取0.25g煙樣于50mL小白瓶中，加入25mL 5%醋酸溶液，震蕩30min后用定性濾紙過濾，采用流動分析法測定濾液中煙草常規(guī)化學(xué)成分[16]。

1.3.5 煙葉感官質(zhì)量 取各處理調(diào)制后中部三等煙葉按照YC/T 138-1998的方法對雪茄煙樣品進行感官質(zhì)量的測定，并按表1雪茄煙感官質(zhì)量評分權(quán)重加權(quán)計算總分。

表1 雪茄煙感官質(zhì)量評分權(quán)重Table 1 Cigar sensory quality score weight

1.3.6 煙葉經(jīng)濟性狀 按四川省當?shù)匮┣褵熓召彿旨墭藴蕼y定發(fā)酵后的煙葉產(chǎn)量、均價和茄衣比例。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2010軟件作圖，利用SPSS 23.0軟件進行單因素方差分析與相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種植密度對田間微環(huán)境的影響

由表2可知，在同一時間下田間溫度隨種植密度的增大而升高。T5處理成熟期內(nèi)溫度最高，達到38.90℃。T2、T3和T4處理在打頂后7～14d田間溫度未出現(xiàn)顯著性差異，可能是由于打頂后前期煙株中上部葉面積較小，對田間環(huán)境的影響較小。在打頂后21d，隨著煙葉葉面積增大，T3處理與T4、T2的田間溫度出現(xiàn)顯著性差異。打頂后35d，T4和T5處理與其他處理的田間溫度出現(xiàn)顯著性差異

表2 種植密度對田間微氣候的影響Table 2 Effects of planting density on field microclimate

同一時期內(nèi)相對濕度隨密度增大而逐漸增大，打頂后14d開始，各處理間出現(xiàn)顯著性差異。隨著煙葉種植密度增大，煙葉的蒸騰作用增強，同時田間通風(fēng)降低，田間濕度逐漸增加。打頂后35d，T5處理相對濕度較T1處理增加了16%。

同一時期內(nèi)光照強度隨密度升高而降低，打頂后7d，T1處理與T3、T4、T5處理之間存在顯著性差異。隨著煙葉生長，上部葉對陽光的遮擋程度逐漸加大，打頂后35d，T1與T2處理之間存在顯著性差異，T3與T4處理之間存在顯著性差異，T2與T3之間無顯著性差異。打頂后7dT5處理煙葉光照強度一直處于較低水平，與T1和T2處理存在顯著性差異。打頂后35d，T5處理光照強度較T3處理降低了26.5%，且與T1、T2和T3處理存在顯著性差異。

2.2 不同種植密度對雪茄煙MDA含量的影響

MDA作為膜脂過氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物，其含量的高低一定程度上可反映煙葉內(nèi)膜脂過氧化程度的高低。由圖1可知，成熟期內(nèi)T1、T2、T5處理煙葉MDA含量呈現(xiàn)先降后升的趨勢；T3和T4處理呈現(xiàn)逐漸上升趨勢。在打頂后7d，T3、T4處理與T1、T2和T5處理出現(xiàn)顯著性差異，在21d后，隨著下部煙葉開始采收，煙株營養(yǎng)向中上部葉轉(zhuǎn)移，各處理MDA含量增加速度明顯加快。同一時期內(nèi)T3和T4處理MDA含量仍處于較低水平。T1處理MDA含量在各處理中均最高。之后T4、T5處理MDA含量增長速度明顯升高，打頂后35d，T4和T5處理MDA含量顯著高于T3處理。說明T3處理成熟期煙葉膜脂過氧化程度較輕，有利于煙葉內(nèi)含物質(zhì)轉(zhuǎn)化及其生長發(fā)育。

圖1 種植密度對雪茄煙MDA含量的影響Fig.1 Effects of planting density on MDA content in cigars

2.3 煙葉膜脂過氧化水平與田間溫濕度和光照強度的相關(guān)性分析

由表3可知，各處理下煙葉膜脂過氧化水平與田間溫度均呈顯著正相關(guān)關(guān)系，其中除T5外，其他處理溫度與煙葉膜脂過氧化程度極顯著相關(guān)（P＜0.01），T5處理與其顯著相關(guān)（P＜0.05）。T1處理煙葉膜脂過氧化程度與濕度呈負相關(guān)，但未達顯著水平。T1處理MDA含量與光照強度呈顯著正相關(guān)，說明此時煙葉所受光強過大，從而影響相關(guān)抗氧化酶活性，造成煙葉膜脂過氧化程度加大。T2、T3、T4和T5處理濕度、光強與煙葉膜脂過氧化程度之間無顯著相關(guān)性。

表3 煙葉MDA含量與田間溫濕度和光照強度的相關(guān)系數(shù)Table 3 Correlation coefficient between MDA contents of cigars leaves and temperature,humidity and light intensity in the field

2.4 不同種植密度對雪茄煙抗氧化酶活性的影響

如圖2所示，同一處理的POD、CAT、SOD活性均呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢。各處理POD活性在打頂后28d達到最高值，之后開始下降。此時各處理差異開始增大。成熟期內(nèi)整體上各處理POD活性以T3處理較高，T1處理最低。打頂后14d，T3處理POD活性顯著高于T4處理。打頂后28d，T3、T4與其他處理出現(xiàn)顯著性差異。

圖2 種植密度對雪茄POD、CAT和SOD活性的影響Fig.2 Effects of planting density on activities of POD,CAT,and SOD in cigars

各處理CAT活性在打頂后14d達到最高值，此時T3處理酶活性最高，達到228.83U/(mg·min)，打頂后21d，T2、T3和T4處理CAT活性顯著高于T1和T5處理。打頂后28d，T3處理CAT活性顯著高于T4處理，T5處理CAT活性顯著低于其他處理。打頂后35d各處理間皆出現(xiàn)顯著性差異，T3處理CAT活性最高，為87.69U/(mg·min)，T1處理最低，為26.44U/(mg·min)，T1較T3處理降低了69.8%。

T3處理SOD活性在打頂后21d達到最大值，之后開始下降。同一時期均以T3處理SOD活性最高，T1處理活性最低，在打頂后7d，T3處理SOD活性顯著高于其他處理，在打頂后21d，T3與T1、T2、T5處理出現(xiàn)顯著性差異。打頂后28d和35d，T3處理與其他各處理皆出現(xiàn)顯著性差異。

2.5 不同種植密度對雪茄煙化學(xué)成分的影響

由表4可以看出，煙葉中總糖和還原糖含量隨種植密度的增大呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。T3處理煙葉總糖和還原糖含量最高，分別為1.86%和0.67%，且顯著高于T1和T5處理。當種植密度高于22 500株/hm2時，煙葉總糖含量顯著下降。T3處理總糖含量較T5處理增加了53.7%。煙堿含量隨種植密度的增大整體呈降低趨勢，T1處理煙堿含量顯著高于T5處理。各處理鉀含量在2.24%～3.65%之間，其中T1處理最高，為3.65%，T1和T3處理鉀含量顯著高于T2、T4和T5處理。氯含量各處理間差異較小，且均處于較低水平，與四川省土壤中氯含量較低有關(guān)。優(yōu)質(zhì)雪茄煙化學(xué)成分適宜范圍為總糖2%左右、總氮4%～6%、煙堿2.8%～3.8%、鉀≥2%、氯0.3%～0.6%、鉀氯比≥6[17-18]。結(jié)合優(yōu)質(zhì)雪茄煙化學(xué)成分可知，四川省雪茄煙相比于優(yōu)質(zhì)雪茄煙總糖含量較低，其余各指標皆處于優(yōu)質(zhì)雪茄煙適宜范圍內(nèi)。總氮含量較適宜，鉀氯比較高，煙葉燃燒性較好，適宜性指標中由于煙葉總糖含量較低，糖堿比較低，影響其吸食品質(zhì)。各處理中T3處理總糖含量較高，糖堿比較大，鉀氯比較高，煙葉刺激性小，燃燒性較好，有利于改善四川省雪茄煙糖含量較低的缺點。

表4 種植密度對雪茄煙晾制后化學(xué)成分的影響Table 4 Effects of planting density on the chemical composition of cigar after airing

2.6 不同種植密度對雪茄煙感官質(zhì)量的影響

由表5可知，感官質(zhì)量得分以T2和T3處理最高。T4和T5處理相比T3處理煙葉煙氣濃度有所下降，煙灰雜質(zhì)有所增加，總分明顯降低。

表5 種植密度對雪茄煙煙葉感官質(zhì)量的影響Table 5 Effects of planting density on sensory quality of cigar tobacco leaves

2.7 不同種植密度對雪茄煙經(jīng)濟性狀的影響

由表6可知，煙葉產(chǎn)量隨種植密度的增大呈先升后降的趨勢，其中T4處理煙葉產(chǎn)量最大，但煙葉均價、產(chǎn)值和茄衣比例均以T3處理最佳，且顯著高于T5處理（當?shù)噩F(xiàn)行常規(guī)種植密度24 000株/hm2）。綜合對比各處理煙葉經(jīng)濟性狀以T3處理最佳。

表6 種植密度對雪茄煙經(jīng)濟性狀的影響Table 6 The effects of planting density on the economic characteristics of cigar tobacco

3 討論

同一時期溫度隨種植密度的增大而升高。各處理溫度均與煙葉膜脂過氧化程度呈顯著正相關(guān)關(guān)系，說明成熟期內(nèi)溫度超過了雪茄煙正常生長發(fā)育所需的溫度范圍，加大了煙葉的膜脂過氧化程度。趙松超等[19]研究表明種植密度增大時田間溫度升高，與本試驗研究結(jié)果一致。但穰中文等[20]的研究結(jié)果表明當煙株種植密度過大時，由于葉面所受光照被上部葉遮擋，造成壟間溫度有所下降，本試驗中并未出現(xiàn)密度增大而溫度下降的現(xiàn)象，可能是試驗地點不同，環(huán)境氣候有所改變，以及雪茄煙葉面積較烤煙較小所致。

在T1處理下，光照強度與煙葉膜脂過氧化程度呈正相關(guān)關(guān)系，表明煙葉在此密度下受高光強影響從而加深了膜脂過氧化程度。濕度與煙葉膜脂過氧化程度未出現(xiàn)相關(guān)關(guān)系，說明此時各處理濕度處在煙葉生長的適宜范圍內(nèi)。綜上所述，除T1處理受高光強度影響外，其余處理主要受到高溫影響，從而加深煙葉膜脂過氧化程度，但T2處理溫度并未與T3和T4處理出現(xiàn)顯著性差異，故可得煙葉在19 500～22 500株/hm2密度下其田間微氣候較適宜煙葉生長。

植物細胞中活性氧的清除主要依靠SOD、CAT和POD互相協(xié)同。SOD能夠清除細胞內(nèi)的超氧陰離子，POD和CAT可以使H2O2歧化成無毒的水和氧分子，從而減輕植物膜脂過氧化程度[21]。本試驗結(jié)果表明，各處理抗氧化酶活性隨煙葉成熟度變化皆為先升高后降低，這可能是由于煙葉進入成熟期后細胞內(nèi)活性氧分子增多，刺激抗氧化酶相關(guān)基因的表達，使得相關(guān)酶活性開始上升[22]，后期出現(xiàn)下降則可能是因為細胞內(nèi)活性氧分子含量過高，超出細胞的承受范圍，破壞了細胞膜結(jié)構(gòu)，影響了相關(guān)蛋白質(zhì)以及其他物質(zhì)的合成[23]。18 000株/hm2種植密度下煙葉在高光強影響下光合作用加強，葉片衰老加快，從而破壞了抗氧化酶系統(tǒng)，使成熟后期POD、SOD和CAT活性降低，加劇了煙葉膜脂過氧化程度。隨著種植密度的增大，煙葉所受光照強度減小，煙葉CAT與POD活性逐漸提升，煙葉膜脂過氧化程度有所降低，此結(jié)果與朱大恒等[24]的研究結(jié)果一致。當種植密度大于19 500株/hm2時光照強度與煙葉膜脂過氧化程度不再具有顯著相關(guān)性。

種植密度19 500～22 500株/hm2時煙葉抗氧化酶活性高于18 000株/hm2，且隨著煙葉逐漸成熟，其抗氧化酶活性差異逐漸增大。當種植密度高于22 500株/hm2時抗氧化酶活性出現(xiàn)降低趨勢，表明煙葉在高種植密度下溫濕度等因素對煙葉抗氧化酶系統(tǒng)造成一定影響，且雪茄煙煙葉在成熟時其葉長在50～60cm之間，24 000株/hm2密度下株間距為38cm，此時中部煙葉會受上部煙葉遮擋而無法得到較充足的光照，且田間通風(fēng)受到影響，其抗氧化酶活性也會有所下降。李美茹等[25]的研究結(jié)果也表明，弱光環(huán)境下的植物其抗氧化能力較正常光照范圍有所下降。綜上所述，種植密度為21 000株/hm2時煙葉抗氧化酶活性水平較高，煙葉膜脂過氧化程度較低，有利于煙葉成熟期內(nèi)清除細胞內(nèi)生成的大量活性氧分子，維持煙葉正常的代謝活動及生長發(fā)育。

煙葉化學(xué)成分是衡量煙葉品質(zhì)最主要的依據(jù)之一，由于雪茄煙調(diào)制過程較長，糖類物質(zhì)損耗較多，而煙堿和總氮含量較高，煙葉接近堿性。國內(nèi)優(yōu)質(zhì)雪茄煙化學(xué)成分評價尚未形成規(guī)范完備的評價標準，對比國內(nèi)外優(yōu)質(zhì)雪茄煙產(chǎn)區(qū)與本試驗各處理煙葉的雪茄煙化學(xué)成分，總糖含量低是四川省雪茄煙存在的主要問題，這可能與四川省打頂時期較早有關(guān)，海南省打頂時期為移栽后60d，而四川省打頂時期在打頂后55d左右，也可能是由四川省雪茄煙種植密度過高，成熟期內(nèi)含物質(zhì)積累不足造成的。

曹陽等[26]研究表明，適當增大種植密度對煙葉總糖、總氮和鉀含量有一定提升。而本試驗發(fā)現(xiàn)，總糖、還原糖和鉀含量隨種植密度的增大呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在中等種植密度時，煙葉總糖和還原糖含量最高，這可能是由于種植密度過高時，溫度過高、光強過低和煙株根系發(fā)育不良等因素影響了煙葉相關(guān)物質(zhì)的合成與代謝。而煙堿含量隨種植密度的增大呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，這與朱命陽[27]的研究結(jié)果一致。

感官評吸質(zhì)量也以T3處理最好，其煙氣濃度適中，香氣質(zhì)好，香氣量較充足，勁頭適中，刺激性較小，余味舒適。5個處理中T3處理產(chǎn)量雖較T4處理稍低，但煙葉均價、產(chǎn)值和茄衣比例均為最佳，且顯著高于常規(guī)種植密度。綜合比較，T3處理煙葉化學(xué)成分最協(xié)調(diào)，感官質(zhì)量最佳，經(jīng)濟性狀最好。

4 結(jié)論

種植密度對成熟期雪茄煙生長環(huán)境有顯著影響，其中高溫是造成煙葉膜脂過氧化水平增大的主要因素，應(yīng)適當降低密度，保持田間通風(fēng)。當種植密度為21 000株/hm2時煙葉抗氧化酶活性較高，膜脂過氧化程度較低，總糖含量較高，煙堿含量較適宜，鉀氯比較高，化學(xué)成分較為協(xié)調(diào)，感官質(zhì)量得分最高。經(jīng)濟性狀方面煙葉產(chǎn)值及茄衣比例皆以21 000株/hm2密度下表現(xiàn)最好，與當?shù)爻Ｒ?guī)種植密度24 000株/hm2相比，21 000株/hm2下煙葉產(chǎn)值與茄衣比例分別提升了0.9萬元/hm2與7%。綜上所述，種植密度為21 000株/hm2時煙葉抗氧化能力較強，煙葉品質(zhì)較好，產(chǎn)值及茄衣比例均有所提升，為四川省雪茄煙適宜種植密度。