耕作方式對燕麥田土壤微生物群落多樣性的影響

王麗芳 張德健 張婷婷

（內蒙古大學生命科學學院/牧草與特色作物生物技術教育部重點實驗室，010070，內蒙古呼和浩特）

土壤微生物的生長代謝活動都發(fā)生在土壤環(huán)境中，其群落的豐富度、均勻度以及優(yōu)勢度與土壤的理化性質息息相關。自然因素與人為因素通過影響土壤的理化性質進而影響微生物群落多樣性[1-3]，相比于自然因素，合理的耕作方式、施肥和噴灑農藥等田間管理措施改善土壤環(huán)境更易于操作。因為耕作方式對土壤的容重、孔隙度、含水量、溫度、養(yǎng)分含量和pH值等變化有著復雜的影響[4-7]，直接或間接地影響到土壤微生物的生活環(huán)境，是近些年國內外學者重點研究的方向。

研究表明，土壤環(huán)境、土壤微生物及農作物會形成一個相互制約、相互促進的系統(tǒng)，合適的耕作方式可以對這個系統(tǒng)進行優(yōu)化，實現更高的作物產量以及土地利用的可持續(xù)發(fā)展[8]。土壤微生物的存在可以通過自身的代謝活動反作用于土壤環(huán)境，除直接影響農作物對營養(yǎng)成分的吸收外，還會影響土壤酶的活性，提高土壤有機質含量，釋放一些對農作物生長起促進作用的植物激素[9-11]，且研究發(fā)現土壤微生物群落的改變會影響土壤環(huán)境中植物激素的種類和濃度，從而調節(jié)農作物的生長發(fā)育[12]。同時，人為干預土壤中微生物的群落種類與數量對于農作物的增產也有十分積極的作用[13]。研究表明，大部分土壤微生物對耕作措施很敏感，并表現出不同的反應[14-15]。李景等[16]研究發(fā)現，采用免耕和深松結合小麥秸稈覆蓋以及小麥-花生輪作等措施均可改善土壤團聚體狀況，提高土壤微生物多樣性指數。Carpenter-Boggs等[17]研究表明，在免耕系統(tǒng)中，土壤微生物的活性和數量都顯著高于翻耕土壤。鐘文輝等[18]研究表明，減少土壤耕作結合秸稈覆蓋可提高表層土壤細菌總量，增加土壤微生物的多樣性。Meriles等[19]發(fā)現在花生-玉米-大豆的輪作體系中，玉米殘茬中木霉菌群顯著增加。Drijber等[20]也發(fā)現在長期小麥輪作種植制度下，土壤細菌群落會發(fā)生變化。但是，在燕麥生產系統(tǒng)下，不同耕作措施對土壤微生物群落多樣性的影響研究還鮮見報道。本研究以燕麥田土壤微生物為研究對象，采用16S rRNA測序技術及ITS測序技術探究耕作方式對其群落多樣性的影響，旨在為燕麥農田保育和農田生態(tài)系統(tǒng)優(yōu)化提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗區(qū)概況

試驗區(qū)地處內蒙古呼和浩特市武川縣（40°47′～41°43′N、110°30′～115°53′E），位于內蒙古高原南端，海拔約1600m，屬溫帶大陸性季風氣候，全年降雨分布不均勻，多集中在夏季，其余時間比較干旱。全年無霜期95～110d，6級以上大風天有39d以上。

1.2 試驗設計

采用完全隨機區(qū)組設計，共設置機械免耕播種和傳統(tǒng)翻耕（CK）2種耕作方式，3次重復，共6個小區(qū)，小區(qū)面積為150m2（15m×10m），行距20cm，隨機排列。種肥施磷酸二銨120kg/hm2和尿素30kg/hm2，田間采用常規(guī)管理。于燕麥拔節(jié)期和灌漿期采集土壤樣品，4個處理分別為翻耕拔節(jié)期（FGB），免耕拔節(jié)期（MGB），翻耕灌漿期（YGF）和免耕灌漿期（YGM）。在各小區(qū)用“S”形取樣法確定5～7個取樣點，用土鉆鉆取0～20cm的土層，每次取樣500g，將土樣混合均勻，揀出草根和石塊等雜物，放入-80℃冰箱冷藏備用。

1.3 測定項目和方法

將各處理土樣注好標簽，制成模板工作液。用MiSeq宏基因組測序法測定細菌群落多樣性，對細菌的16S V4區(qū)進行擴增，稀釋定量至4～5pM后上機進行測序。用454宏基因組測序法檢測真菌群落多樣性，對真菌的ITS區(qū)進行PCR擴增，利用Roche 454 GS FLX+測序儀完成測序。

1.4 數據處理

測序平臺為Illumina MiSeq平臺[21]。通過RDP-classifier方法，以RDP數據庫的序列為基礎，對OTU代表序列進行注釋，在此基礎上使用mothur軟件生成各OTU之間的維恩圖。然后利用樣本之間的物種演化信息和豐度信息進行單線性分析，得到樣本之間差異的距離矩陣。應用R（vegan）軟件繪制PCA圖和heatmap圖，再利用軟件MetaPhlAn繪制生物群落結構圖。

2 結果與分析

2.1 優(yōu)質序列統(tǒng)計

優(yōu)質序列是指有效測序序列中含有特異性擴增引物、不含模糊堿基和長度大于可供分析標準的序列。各處理土壤樣品真菌序列統(tǒng)計結果見表1，共得到優(yōu)質序列66 832條，其中燕麥MGB處理的優(yōu)質序列比例最高，占比86.87%，其余3個處理優(yōu)質序列比例普遍偏低，且處理間相差不大。

表1 土壤真菌序列數Table 1 Soil fungal sequences number

不同耕作方式所得土壤樣品細菌序列統(tǒng)計結果見表2，共得到優(yōu)質序列258 304條，YGM的優(yōu)質序列比例略高于YGF。

表2 燕麥灌漿期土壤樣品細菌序列數Table 2 Number of bacterial sequences in soil samples during oat grouting period

2.2 操作分類單元（OTU）聚類分析

OTU（operational taxonomic units）是通過一定的距離測量方法，計算出2個不同序列之間的距離或相似度，然后設置特定的分類閾值，得到相同閾值下的距離矩陣，并進行聚類運算以形成不同的分類單元。這種對序列進行聚類的方法不需要對每一條序列都進行物種注釋，提高了測序分析的準確性[22]。

圖1（左）為燕麥田土壤真菌OTU聚類所得到的韋恩圖，可以看出，不同處理共得到真菌種類6096種，其中3810種為4個處理共同具有，占總數的62.50%。YGF處理特有的真菌種類最多，為33種；而FGB處理特有的真菌種類最少，只有4種。4個處理的真菌種類豐富度由高到低分別為YGM處理（5547種）、MGB處理（5484種）、YGF處理（5413種）、FGB處理（4962種）。

圖1（右）為燕麥田土壤細菌OTU聚類所得到的韋恩圖，共檢測到細菌1578種，其中94種為4個處理共有，約占總數的6.00%。MGB處理擁有最多的特有性細菌，為454種，其他3個處理中檢測到的細菌種類相差不大。同樣，MGB處理所得細菌種類也最多，并遠高于其他3個處理，為705種。其他3個處理細菌豐富度由高到低為FGB處理（527種）、YGM處理（519種）和YGB處理（451種）。

圖1 不同耕作方式下燕麥田土壤真菌（左）和細菌（右）OTU聚類圖Fig.1 OTU clustering diagram of soil fungi(left)and bacterium(right)in oat field under different tillage methods

2.3 物種豐度分析

豐度分布曲線（rank abundance curve）是分析物種多樣性的一種方式，其構造方法是對單個樣本中每個OTU中包含的序列數進行計數，根據豐度（包含的序列數）從大到小對OTU進行排序，以OTU等級為橫坐標，以每個OTU中所含的序列數為縱坐標繪制成圖。豐度分布曲線可以用來反映微生物的物種豐度和物種均勻度[23]。曲線在橫坐標上的范圍反映物種的豐度，范圍越大，物種的豐度越高；曲線的平滑程度反映物種的均勻度，曲線越平緩，物種分布越均勻。圖2為不同耕作方式下燕麥田土壤真菌和細菌豐度分布曲線，很顯然，MGB處理真菌種類的組成最為豐富，物種組成的均勻程度也最高，其他3個處理差異不太明顯；4個處理的細菌種類豐富度與均勻度無較大差異。

圖2 不同耕作方式下燕麥田土壤真菌和細菌豐度分布曲線Fig.2 Distribution curve of soil fungi and bacteria abundance in oat fields under different tillage methods

2.4 Alpha多樣性分析

Alpha多樣性指數反映群落內物種數量及其相對豐度，是群落內各物種利用同一生境互相競爭或共生的結果。Alpha多樣性指數分為3類，物種豐富度指數、物種均勻度指數和物種多樣性指數。物種多樣性指數是物種豐富度指數和物種均勻度指數的綜合。表3中除simpson指數之外，均與物種豐富度和多樣性都呈正相關，simpson指數與物種多樣性呈負相關[24-25]。不同耕作方式和不同生育期燕麥土壤微生物多樣性指數計算結果見表3，FGB處理的真菌群落豐富度最高（ace=1343.8190，chao=1022.2000），而細菌群落豐富度沒有明顯差異。MGB處理的真菌群落多樣性（shannon=4.6401，simpson=0.0254）和細菌群落多樣性（shannon=6.9325，simpson=0.0030）最高。YGM處理真菌群落多樣性（shannon=3.4812，simpson=0.1053）最低，同時各處理之間細菌群落多樣性指數差別不大。

表3 不同耕作方式下燕麥不同生育期土壤微生物多樣性指數Table 3 Soil microbial diversity indexes of oat under different tillage methods and different growth stages

2.5 群落結構分析

利用Qiime對OTU表生成門水平上的物種豐度表和多樣性物種分布圖（圖3和表4）。在土壤真菌群落分布圖中，占優(yōu)勢的門主要有子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）。在門水平上土壤真菌的演替規(guī)律比較明顯，其中子囊菌門在各個處理各生育時期均占絕對優(yōu)勢（64.30%），其中以FGB處理的物種豐度和物種組成最為豐富。相較而言，土壤細菌在各處理以及各時期的物種豐度和物種組成較為均勻。在門水平上比較占優(yōu)勢的是放線菌門（37.30%）、變形菌門（23.50%）和酸桿菌門（12.30%）。

表4 不同耕作方式對燕麥土壤真菌和細菌豐度的影響Table 4 Effects of different tillage methods on the fungi and bacteria abundance of oat soil %

圖3 不同耕作方式對燕麥土壤真菌和細菌分布的影響Fig.3 Effects of different tillage methods on the distribution of oat soil fungi and bacterium

2.6 主成分分析

通過主成分分析（principal components analysis，PCA）可以觀察微生物群落間的差異，2點之間的距離越小，表明2個樣品的微生物群落差別越小[26-27]。圖4是使用R軟件繪制的PCA散點圖，表現出土壤微生物在屬水平上的分類和物種豐富度。由圖4可以觀察到，FGB與MGB處理的真菌群落結構比較接近，而其他處理之間的真菌群落結構差異性明顯。細菌的主成分分析圖則表明，MGB與YGF處理的細菌群落多樣性相似度較高，而其他處理之間的差異度較高。

圖4 真菌和細菌主成分分析Fig.4 PCA of fungi and bacterium

2.7 物種差異分析

將不同的樣品在一定分類水平上，按照物種豐度高低進行聚類，聚類結果用色塊表示。色塊間的顏色差異可以用來反映多個樣品在群落構成上的相似性和差異性[28]。圖5中的每個色塊代表一個樣品的一個屬的豐度，通過不同處理的聚類分析熱圖可以看出，不同的樣品在不同處理方式下均表現出一定程度的相似性，但不同處理對真菌種類的差異性影響表現不同，其中MGB處理的土壤樣品中真菌的種類相對于其他時期的土壤樣品表現出高度的差異性。而不同土壤樣品中細菌種類只有在YGF處理表現出了明顯的相似性，其他時期無明顯相似性或具有一定差異性。相比之下，YGM和MGB處理土壤樣品中細菌的差異性更加明顯。

圖5 不同處理真菌和細菌聚類分析圖Fig.5 Cluster analysis of fungi and bacterium under different treatments

2.8 進化關系分析

圖6為生物群落結構圖，可以反映樣品中的微生物種類和豐度分布情況，可以觀察到豐度較高的微生物種類。由內而外的節(jié)點顯示出群落結構的從屬關系，依次代表界、門、綱、目、科、屬、種。節(jié)點的大小反映了對應分類水平上的物種豐度，豐度≥1%的物種水平在圖中用不同的顏色標識出來。線條的長短距離表示進化距離，可以反映物種之間的差異程度[29-30]。燕麥田真菌共檢測到4個目（肉座菌目、柔膜菌目、刺盾炱目和爪甲團囊菌目）和4個科（叢赤殼科、粉褶菌科、黑線菌科和沙漠殼菌科），其中叢赤殼科從屬于肉座菌目，這一支也在整個群落中占據優(yōu)勢地位，即圖6中的紅色節(jié)點。另外，黑線菌科從屬于刺盾炱目，柔膜菌目、黑線菌科和刺盾炱目在進化上距離較近。燕麥田土壤細菌共檢測到10個屬豐度較大，其中有些屬無法培養(yǎng)或確認，可以分辨的有5個屬，分別為索溴桿菌屬、芽生球菌屬、節(jié)桿菌屬、諾卡氏菌屬和微枝形桿菌屬。

圖6 不同處理燕麥田土壤真菌（左）和細菌（右）群落結構圖Fig.6 Community structure of fungi(left)and bacterium(right)in oat fields under different treatments

3 討論

3.1 不同耕作方式下土壤微生物群落多樣性比較

通過本試驗可以發(fā)現與燕麥田土壤微生物多樣性密切相關的因素為耕作方式的轉變。在同一生育時期，免耕處理下的樣品經過OUT聚類檢測到更多的微生物種類，物種豐度曲線范圍廣且平滑，simpson和shannon指數也最高。且通過heatmap熱圖可以看出免耕有利于土壤微生物差異化的形成。以上都表明，免耕處理更有利于形成豐富度和均勻度高的土壤微生物群落。肖琴等[31]和盧闖等[32]的研究表明，免耕方式可以保護土壤中的團粒結構，從而保存土壤水分與溫度，增加土壤有機質含量，為微生物生長提供充足養(yǎng)分，有利于微生物量的增加，這與本試驗的研究結果一致，免耕作為一項保護性耕作技術，可能成為指導燕麥田田間管理措施的切入點，通過調節(jié)微生物群落的多樣性來提升土壤肥力和改善燕麥田土壤環(huán)境，有望成為將來的研究趨勢。

3.2 燕麥不同生育期土壤微生物群落多樣性比較

燕麥不同生育期對土壤微生物的種類及數量也有影響，但本試驗中并不能總結出統(tǒng)一的規(guī)律。在前人的研究中，作物不同生長期對土壤微生物的影響有不同結論。研究表明[33-34]，在玉米生長期中微生物的群落多樣性會先增加后減少。這可能是由于各處理土壤微生物群落結構存在明顯的季節(jié)性變化及生境上的變化。與玉米土壤微生物群落結構組成關聯(lián)最大的因素是溫度，其次是耕作方式和土壤含水量，土壤養(yǎng)分及pH值影響最小。潘孝晨等[35]則認為，土壤微生物量隨作物生長呈上升趨勢，原因可能是作物的根系脫落物可為土壤微生物提供養(yǎng)分。樊曉剛[34]的研究則認為不同耕作方式下微生物量及其多樣性存在差異，免耕和少耕等保護性耕作為土壤微生物的生長繁殖創(chuàng)造了良好的生境條件，一定程度上增加了土壤表層微生物量及大量的根系分泌物，增加了微生物種群數量，有利于維持微生物多樣性，這與本研究結論一致。不同結論可能與作物及其生長過程中根際營養(yǎng)環(huán)境發(fā)生變化以及作物與微生物進行營養(yǎng)競爭有關。

3.3 燕麥田土壤優(yōu)勢真菌種類分析

不同作物種類、不同的耕作方式以及其他各方面可能造成土壤環(huán)境變化的因素決定了土壤微生物的種類與數量。趙麗琨[36]研究了不同耕作方式對玉米地真菌種類及數量的影響，得出，玉米土壤真菌的優(yōu)勢屬有鐮孢菌屬、腐霉屬、根霉屬、鏈格孢屬、木霉屬、肉座菌屬、綠僵菌屬、青霉屬和曲霉屬等，這些都分屬于子囊菌門、接合菌門和肉座菌目。徐佳等[37]發(fā)現不同作物田中優(yōu)勢真菌屬有青霉（子囊菌門）、曲霉（子囊菌門）、鐮刀菌（子囊菌門）和木霉（肉座菌目）。本研究發(fā)現燕麥田土壤真菌的優(yōu)勢菌門為子囊菌門和擔子菌門，優(yōu)勢菌目為肉座菌目、柔膜菌目、刺盾炱目和爪甲團囊菌目，與前人研究基本一致。

3.4 燕麥田土壤優(yōu)勢細菌種類分析

在土壤細菌方面，汪婭婷等[38]的研究表明云南地區(qū)玉米根際微生物群落的優(yōu)勢菌門為擬桿菌門、變形菌門和放線菌門。Jin等[39]在陜西楊凌和河北張家口地區(qū)的試驗發(fā)現，谷子根際微生物的優(yōu)勢菌門為放線菌門和變形菌門。Kwak等[40]通過對番茄土壤微生物的研究得出，變形菌門、擬桿菌門、酸桿菌門、厚壁菌門為優(yōu)勢菌門。本試驗所得結論為燕麥在不同生長發(fā)育期細菌優(yōu)勢菌門主要為放線菌門、酸桿菌門和變形菌門，與前人研究結果基本一致。

4 結論

在傳統(tǒng)翻耕和機械免耕2種處理下，對燕麥拔節(jié)期和灌漿期的土壤微生物群落多樣性進行了分析。結論如下：從OUT聚類分析、物種豐度曲線、Alpha多樣性分析以及heatmap圖中均可以看出與傳統(tǒng)翻耕相比，免耕處理下土壤微生物多樣性更高，群落之間差異性更大。免耕可以減少土體擾動，有助于土壤大團聚體的形成，保存土壤養(yǎng)分，因此，免耕能為微生物的生命活動創(chuàng)造更好的微環(huán)境，進而增加土壤微生物多樣性。燕麥田土壤真菌群落的優(yōu)勢門有子囊菌門和擔子菌門；土壤細菌群落的優(yōu)勢門有放線菌門、變形菌門和酸桿菌門。