根際耐鹽真菌分離篩選及溶磷促生性能分析

譚海霞 李麗艷 杜迎輝 孫杉杉 王連龍 董 雪 王玉璽 張 穎

（1河北環(huán)境工程學(xué)院，066000，河北秦皇島；2領(lǐng)先生物農(nóng)業(yè)股份有限公司，066000，河北秦皇島；3河北省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)技術(shù)創(chuàng)新中心，066000，河北秦皇島）

我國沿海地區(qū)土壤鹽堿化問題較為嚴(yán)重，改良修復(fù)鹽漬化土壤可為濱海地區(qū)環(huán)境保護(hù)及農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展提供保障。近年來，微生物對(duì)土壤的修復(fù)作用成為研究的熱點(diǎn)[1-2]，張燕等[3]在2019年提出并驗(yàn)證了“微生物+復(fù)合型鹽堿土壤修復(fù)技術(shù)”的作用機(jī)理?？扇芰自谥参锷L發(fā)育中起重要作用，為了提高土壤中磷的可利用性，一些學(xué)者對(duì)溶磷真菌的分離篩選及溶磷特性進(jìn)行了相關(guān)研究[4-12]，但篩選的菌株在鹽漬化土壤中應(yīng)用的潛力非常有限。目前，關(guān)于篩選耐較高鹽濃度解磷真菌的報(bào)道較少，范延輝等[13]篩選出1株草酸青霉，耐受的鹽濃度可達(dá)12.5%。鹽生植物根際有豐富的耐鹽微生物資源，本研究以北戴河濕地和曹妃甸濕地中優(yōu)勢鹽生植物的根際土壤為研究對(duì)象，篩選出耐高鹽濃度的解磷真菌，并綜合評(píng)價(jià)其溶磷促生能力，以期篩選出具有優(yōu)良生物效能的解磷菌株，為鹽堿土生物菌肥的研制提供優(yōu)質(zhì)菌種資源。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試土壤 土壤樣品采自于河北省秦皇島北戴河濕地（119°30′51′～119°31′2′E，39°50′28′～39°50′46′N）和唐山曹妃甸濕地（39°11′35′～39°22′37′N，118°23′27′～118°35′20′E），采樣區(qū)屬于典型的濱海濕地，屬溫帶大陸性季風(fēng)氣候。土壤類型為濱海鹽土。基本理化性狀見表1，堿解氮和有效磷含量適中，有機(jī)質(zhì)含量不足，pH和水溶性鹽含量偏高，為濱海中度鹽堿土，土壤采自鹽地堿蓬（Suaeda salsa）、鹽角草（Salicornia europaea）和堿蓬（Suaeda glauca）植物根際。

表1 采樣地土壤理化性狀Table 1 Physical and chemical properties of the soil in the sampling sites

1.1.2 供試培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基）：用于真菌分離，NaCl濃度為10%、馬鈴薯200.0g、葡萄糖20.0g、NaCl 100g、氯霉素0.03g和瓊脂粉20.0g，加水定容至1000mL，pH為9.0。

耐鹽培養(yǎng)基：按上述方法，分別配制NaCl含量為0%、5.0%、10.0%和15.0%的PDA固體培養(yǎng)基。

無機(jī)磷固體培養(yǎng)基：用于解磷菌初篩，葡萄糖10.0g、(NH4)2SO40.5g、酵母浸粉0.5g、NaCl 0.3g、MgSO40.3g、KCl 0.3g、FeSO40.03g、MnSO40.03g、Ca3(PO4)25.0g、瓊脂 15.0g、pH 7.0～7.5。

有機(jī)磷固體培養(yǎng)基：用于解磷菌初篩,葡萄糖10.0g、(NH4)2SO40.5g、酵母浸粉0.5g、NaCl 0.3g、KCl 0.3g、MgSO40.3g、FeSO40.03g、MnSO40.03g、卵磷脂 0.2g、CaCO31.0g和瓊脂15.0g、pH值7.0～7.5。

無機(jī)磷液體培養(yǎng)基和有機(jī)磷液體培養(yǎng)基：用于解磷菌復(fù)篩，配方同固體培養(yǎng)基，不加瓊脂即可，pH 值 7.0～7.5。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 耐鹽真菌分離 于北戴河濕地和曹妃甸濕地采集植物根際土壤樣品，采用5點(diǎn)取樣法分別采集鹽角草、鹽地堿蓬和堿蓬健康植株，切取植株根部裝入無菌袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室。植物根際土壤樣品制備參考白文娟等[14]的方法。將10g根際土壤樣品放入無菌三角瓶中，加入90mL生理鹽水震蕩20min，靜置5min，待土壤均勻分散開，按10倍遞減稀釋法稀釋后，于10%NaCl鹽濃度的PDA培養(yǎng)基上涂布，恒溫培養(yǎng)5d后，挑取典型的不同形態(tài)的單菌落，經(jīng)純化后于4℃斜面保存。

1.2.2 平板法初篩解磷菌 根據(jù)是否產(chǎn)生溶磷圈初篩解磷菌。挑選純化菌株分別點(diǎn)接于無機(jī)磷及有機(jī)磷固體平板，每個(gè)處理3次重復(fù)，培養(yǎng)5d，挑選具有溶磷圈的真菌，測量溶磷圈直徑（D）和菌落直徑（d），在PDA平板上純化培養(yǎng)，作為復(fù)篩菌株。

1.2.3 搖瓶法復(fù)篩解磷菌 通過搖瓶法研究初篩解磷菌對(duì)難溶磷源的溶解能力。耐鹽真菌孢子懸液的制備參考李豆豆等[4]的方法。將上述耐鹽解磷真菌孢子懸液按照1%的接種量分別接入無機(jī)磷液體培養(yǎng)基和有機(jī)磷液體培養(yǎng)基中，于28℃、180轉(zhuǎn)/min搖床培養(yǎng)7d。將培養(yǎng)液于6000轉(zhuǎn)/min、4℃離心10min，取上清液2.5mL，采用鉬銻抗比色法測定發(fā)酵液中有效磷的含量，同時(shí)設(shè)不接菌為空白對(duì)照CK1和CK2，每個(gè)處理3次重復(fù)，對(duì)比各菌株培養(yǎng)液中可溶性磷濃度的大小，篩選出高效解磷菌。

1.2.4 分泌IAA菌株篩選 定性初篩：參考陳越等[15]和崔月貞等[16]的方法并做適當(dāng)調(diào)整。向滅菌后的PDA液體培養(yǎng)基加入過濾除菌的L-色氨酸溶液，終濃度為100mg/L。挑取菌株接入上述培養(yǎng)液中，于30℃、180轉(zhuǎn)/min搖床培養(yǎng)3d，8000轉(zhuǎn)/min離心10min，吸取2mL上清液加入等體積的Salkowski比色液，避光靜置30min，觀察其顏色變化，以50mg/L的標(biāo)準(zhǔn)IAA作對(duì)照，變粉紅色為具有分泌IAA能力的菌株。

定量復(fù)篩：采用Salkowski比色法[17]，將初篩具有分泌IAA能力的菌株接種于PDA液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)5d后，調(diào)節(jié)發(fā)酵液OD600值為0.8，備用。發(fā)酵液于8000轉(zhuǎn)/min離心10min，吸取3mL上清液加入等體積Salkowski比色液，靜置30min，測定530nm處的吸光值，以未接菌的PDA液體培養(yǎng)基為空白對(duì)照，以IAA濃度為橫坐標(biāo)、OD530為縱坐標(biāo)制作IAA標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算IAAf分泌量[18-19]。

1.2.5 解磷菌的鑒定 觀察菌落、菌體形態(tài)和產(chǎn)孢特征，參照《真菌鑒定手冊》[20]初步鑒定。對(duì)有較強(qiáng)降解能力的真菌進(jìn)行rDNA-ITS序列分析：由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司測序，利用真菌通用引物ITS1和ITS4對(duì)提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將獲得的DNA序列輸入GenBank，與數(shù)據(jù)庫中的所有序列進(jìn)行Blast比對(duì)，選取同源性95%以上的菌株序列，并利用MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010、DPS V12.01、Origin 8.0和MEGA5.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐鹽真菌的分離篩選及其耐鹽性

以10%NaCl為篩選條件，采用傳統(tǒng)平板法分離篩選鹽地堿蓬、堿蓬和鹽角草3種植物根際土壤耐鹽真菌。如表2所示，不同植物根際土壤耐鹽真菌的菌落形成單位為4.00～61.25×103cfu/g，不同植物根際土壤真菌數(shù)量差異顯著，其中以曹妃甸濕地鹽地堿蓬根際土壤中耐鹽真菌的數(shù)量最高。依據(jù)菌落形態(tài)、大小和顏色等特點(diǎn)分別挑取優(yōu)勢菌株，從3種鹽生植物根際土壤中共分離到16株耐鹽真菌，將其分別接種于0%、5%、10%和15%NaCl濃度的PDA培養(yǎng)基，培養(yǎng)5d，結(jié)果表明，16株菌在鹽濃度0～10%均能生長，在鹽濃度15%均未生長。

表2 不同植物根際土壤耐鹽真菌的數(shù)量Table 2 Quantitative characteristics of halotolerant fungi in different plant root soils

2.2 耐鹽解磷真菌的篩選及溶磷能力

初篩共分離得到具有解磷功能的耐鹽菌株8株，其中1株來自北戴河濕地，菌株編號(hào)為G1，7株來自曹妃甸濕地，菌株編號(hào)依次為C1-C7，其中解無機(jī)磷5株（C1、C2、C3、C4、G1)，解有機(jī)磷3株（C5、C6、C7）。溶磷能力的大小可根據(jù)溶磷圈與菌落直徑的比例大小進(jìn)行初步確定。由表3和表4可知，D/d值在1.05～1.92之間，根據(jù)D/d的比值初步認(rèn)為降解無機(jī)磷，菌株中C1和G1溶磷效果較好，D/d均值分別為1.60、1.58；對(duì)有機(jī)磷的降解能力為菌株C7＞C6＞C5。初篩的無機(jī)磷降解菌和有機(jī)磷降解菌，其溶磷量與D/d有一定的相關(guān)性（圖1），表明D/d在一定程度上代表了溶磷能力的高低，但相關(guān)研究表明溶磷圈的大小并不能準(zhǔn)確反映菌株的溶磷能力，只能作為確定菌株是否具有解磷能力的基本依據(jù)，還需進(jìn)一步定量評(píng)價(jià)解磷能力。

表3 不同菌株降解無機(jī)磷能力Table 3 Phosphate-solubilizing capacity of inorganic phosphate solubilizing fungi

表4 不同菌株降解有機(jī)磷能力Table 4 Phosphate-solubilizing capacity of organic phosphate solubilizing fungi

圖1 無機(jī)磷(a)和有機(jī)磷(b)降解菌D/d與溶磷量的相關(guān)性Fig.1 The correlation between D/d of inorganic phosphorus fungi(a)and organic phosphate fungi(b)and soluble phosphorus content

利用鉬銻抗比色法測定溶磷菌株的溶磷能力，結(jié)果（表3和表4）表明，所有菌株在液體培養(yǎng)條件下均具有解磷能力，但解磷能力與平板透明圈法測定的結(jié)果不完全相同，不同菌株間解磷能力差異顯著。無機(jī)磷降解菌中，溶磷量分布在26.61～4415.30mg/L，與CK1相比，有效磷增量位0.80～4371.10mg/L，5種菌株的溶磷能力大小為C1＞C4＞C3＞G1＞C2，其中C1菌株的溶磷量最高，達(dá)4397.70mg/L，有效磷含量是CK1（26.60mg/L）的165倍，可以考慮作為微生物肥料開發(fā)的重點(diǎn)菌種。有機(jī)磷降解菌解磷量分布在1.96～5.79mg/L，有效磷增量在-3.4～0.2mg/L，解磷能力均較弱，菌株C5解磷量（5.7mg/L）僅為CK2（5.5mg/L）的1.04倍，菌株C6和C7有效磷含量均低于CK2，有效磷增量為負(fù)值，產(chǎn)生這種現(xiàn)象可能是菌株解有機(jī)磷能力很弱，溶解出來的磷在其生長過程中被菌體吸收利用。

2.3 產(chǎn)IAA菌株篩選

結(jié)果（表5）表明，有6株具有顯色反應(yīng)，說明其具有產(chǎn)IAA的能力，IAA分泌量為6.64～33.07mg/L，其中菌株C1的IAA分泌量最高，為33.07mg/L，與其他菌株差異顯著（P＜0.05）。

表5 耐鹽真菌IAA分泌量Table 5 IAA secretion of halotolerant fungi

2.4 耐鹽解磷真菌C1菌株鑒定

2.4.1 菌株培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征 菌株C1在PDA培養(yǎng)基上菌絲生長迅速，初期（1～2d）為白色菌絲，3d后產(chǎn)生大量分生孢子，呈灰綠色至暗綠色。分生孢子梗有隔膜，呈掃帚狀，分生孢子灰綠色，圓形或橢圓形，根據(jù)《真菌鑒定手冊》[20]初步確定為青霉屬的一種（Penicilliumsp.）。

2.4.2 分子鑒定 以菌株C1的DNA為模板進(jìn)行ITS序列的PCR擴(kuò)增，測序獲得長度為595bp的ITS rDNA片段。測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對(duì)，得出該菌株與相關(guān)青霉屬菌株序列相似性達(dá)到99%。為進(jìn)一步確定菌株C1的分類學(xué)地位，利用MEGA 5.1的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3），結(jié)果表明菌株C1與一株青霉屬菌株（KF680775.1）的親緣關(guān)系更近，提交序列后獲得的登錄號(hào)為MT557034。綜合形態(tài)學(xué)特征與分子系統(tǒng)學(xué)分析確定菌株C1為草酸青霉（Penicillium oxalicum）。

圖3 基于ITS基因序列相似性構(gòu)建的菌株C1的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain C1 based on ITS gene sequences similarity

3 討論

目前已從多種植物根際分離到真菌，但種類有限，主要分布于青霉屬（Penicilliumsp.）、曲霉屬（Aspergillussp.）和鐮刀菌屬（Fusariumsp.）等。研究表明，解磷微生物通過產(chǎn)生有機(jī)酸為植物提供有效磷，但已篩選的解磷真菌鹽濃度多為0.03%[10,15]，解磷真菌耐鹽的能力有限，不能在高鹽環(huán)境中生存，溶磷能力受到抑制，李學(xué)平等[9]篩選的解磷菌在鹽濃度為10%時(shí)菌體生長受到明顯抑制。本研究從3種鹽生植物根際土壤中共篩選到16株優(yōu)勢真菌，均能耐受10%鹽濃度，且生長良好，這表明16株真菌能適應(yīng)鹽漬化土壤環(huán)境，具有提高鹽堿土壤有效磷含量的潛力。但3種植物根際耐鹽真菌數(shù)量差異顯著，這可能是由于采樣區(qū)土壤理化環(huán)境及植被類型的不同，導(dǎo)致土壤中微生物數(shù)量及種類有較大差異。采用溶磷圈法和液體培養(yǎng)法綜合評(píng)價(jià)耐鹽真菌的溶磷能力，不同菌株的溶磷能力有很大差異，現(xiàn)有研究報(bào)道，溶磷菌在以磷酸鈣為磷源的培養(yǎng)基中D/d為1.10～2.07[10,12,21]，本研究中菌株C1的D/d值為1.6±0.21，其解磷量可達(dá)4397.70mg/L，比目前已篩選到草酸青霉菌的有效磷含量[13,21]高4～25倍，IAA分泌量為33.07mg/L，與已有報(bào)道菌株產(chǎn)IAA含量5～20mg/L[22]略高一些，與已有研究相比菌株C1溶磷效果較好；研究發(fā)現(xiàn)溶磷圈法并不能直接反映溶磷能力大小，在液體培養(yǎng)條件下，D/d值較大的菌株卻具有較低的溶磷量，這與姜煥煥等[10]研究結(jié)果一致。有機(jī)磷降解菌株在液體培養(yǎng)條件下的溶磷量分布在1.90～5.75mg/L之間，有效磷增量為-3.4～0.2mg/L，解磷能力較弱，原因可能是因?yàn)樵摼陮⑷芙獬鰜淼挠行Я子糜谧陨砭w生長，導(dǎo)致有效磷增量為負(fù)值。無機(jī)磷降解菌在液體培養(yǎng)條件下的溶磷量分布在 26.61～4415.30mg/L之間，有效磷增量為0.80～4371.10mg/L，這主要受菌株類型或自身遺傳特性的影響[3]。不同菌株的解磷能力差異顯著，相關(guān)研究表明溶磷微生物通過產(chǎn)生有機(jī)酸或者分泌磷酸酶增加土壤中有效磷含量[12,23]，其解磷機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

從堿蓬根際土壤中篩選出一株高效耐鹽解磷菌株C1，依據(jù)形態(tài)特征和ITS基因序列同源性分析鑒定其為草酸青霉（Penicillium oxalicum），其解磷量可達(dá)4397.70mg/L，比目前已篩選到草酸青霉菌的有效磷含量[13,21]高4～25倍，可耐受10%鹽濃度，IAA分泌量33.07mg/L，高于已有報(bào)道菌株產(chǎn)IAA含量（5～20mg/L）[22]，說明菌株C1的耐鹽解磷能力較好，且兼具一定的促生作用，可以考慮作為鹽堿地改良微生物菌肥開發(fā)的重點(diǎn)菌種，為研制微生物菌肥提供優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源，與植物協(xié)同修復(fù)改良重度鹽堿土，可有效提高鹽堿地土壤肥力，有更好的應(yīng)用潛力。