成都平原豇豆根腐病菌的分離與鑒定

陳 玲，向 娟，張河慶， 席亞?wèn)|，羅小波，付紹紅

1. 成都市農(nóng)林科學(xué)院，成都 611130； 2. 四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所/蔬菜品種改良與種質(zhì)創(chuàng)新四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610066

豇豆是深受人們喜愛(ài)的一種豆類蔬菜，鮮食與加工需求量大．近年來(lái)，隨著豇豆種植集約化程度與復(fù)種指數(shù)增高，土傳豇豆根腐病發(fā)生嚴(yán)重，成為制約豇豆產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素[1]．據(jù)報(bào)道，引起豇豆根腐病的病原菌種類較多，如鐮孢菌(Fusariumspp.)、腐霉菌(Phythiumsp.)、菜豆殼球孢菌(Macrophominaphaseolina)、立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)等[2-4]，其中，鐮孢菌是主要致病菌，在各種植區(qū)均有發(fā)生，已發(fā)現(xiàn)的豇豆根腐病鐮孢菌包括茄腐鐮孢菌(F.solani)、尖鐮孢菌(F.oxysporum)、腐皮鐮孢菌(F.solani)等11種鐮孢菌[5-8]．受鐮孢菌侵染后，植株根莖部和主根變成紅褐色，病部稍凹陷，有的開裂深達(dá)皮層內(nèi)；剖視莖部，可見維管束變褐，病株側(cè)根脫落或腐爛死亡；當(dāng)主根全部腐爛時(shí)，病株即枯萎死亡[9]．由于鐮孢菌可在田間病殘?bào)w、土壤表面或耕作層中越冬，且其種類復(fù)雜，寄主范圍廣，使得豇豆鐮孢菌根腐病防治困難[10]．雖然使用抗性品種是防治豇豆根腐病最理想的方法，但目前生產(chǎn)上可用的抗鐮孢根腐病菌的豇豆品種仍十分缺乏．

豇豆作為四川成都平原的主要栽培蔬菜之一，主要用于鮮食和泡菜加工．近年來(lái)，成都平原豇豆規(guī)?；N植面積達(dá)到5萬(wàn)hm2，年總產(chǎn)量約70萬(wàn)t，均明顯高于菜豆[1]．但因當(dāng)?shù)貨鏊?、潮濕的氣候特點(diǎn)，加之集約化、規(guī)模化種植，使得豇豆根腐病發(fā)生普遍，特別是成都平原的雙流、彭州、金堂等地有些田塊發(fā)病率達(dá)到100%[11]．2018年，張河慶等[11]首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了成都地區(qū)豇豆根腐病一種新病原菌——共享鐮孢菌(Fusariumcommune)，但關(guān)于成都平原豇豆根腐病的病原種類還未見報(bào)道．本研究對(duì)成都平原豇豆主產(chǎn)區(qū)的根腐病株進(jìn)行收集，通過(guò)對(duì)病原菌的分離純化，采用形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)方面進(jìn)行鑒定，旨在明確引起該地區(qū)豇豆根腐病的主要致病菌類群，為生產(chǎn)上有針對(duì)性地防治該病以及抗病育種提供一定的科學(xué)依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 病害調(diào)查與病株采集

2016-2019年課題組對(duì)成都平原豇豆主產(chǎn)區(qū)開展了調(diào)查，在發(fā)病嚴(yán)重的彭州、崇州、雙流、眉山、樂(lè)山、金堂等6個(gè)采樣點(diǎn)采集了田間病害樣本．

1.2 病原菌的分離與鑒定

1.2.1 病原菌分離與致病性測(cè)定

參照方中達(dá)[12]《植病研究方法》中的方法進(jìn)行病原菌的分離與鑒定．選取新發(fā)病豇豆植株莖基部的根莖進(jìn)行常規(guī)組織分離，經(jīng)純化培養(yǎng)后進(jìn)行單孢分離，獲得單孢菌株，并置于4 ℃馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)斜面培養(yǎng)基上保存．采用柯赫氏法則(Koch’s Rules)對(duì)分離得到的菌株進(jìn)行致病性測(cè)定．將分離到的菌株培養(yǎng)5 d，制成孢子懸浮液(106～107個(gè)孢子/mL)，于豇豆幼苗兩葉一心期采用浸根法接種，使根部完全浸泡在孢子懸浮液中30 min，以清水為對(duì)照，每個(gè)菌株接種10株幼苗，試驗(yàn)重復(fù)3次．接種后將植株定植于裝有無(wú)菌泥炭土的營(yíng)養(yǎng)杯中，于25 ℃氣候箱中培養(yǎng)，12 h光照，8 h暗培養(yǎng)，每隔1～2 d觀察1次．待發(fā)病后，從病斑處再次分離病原菌，通過(guò)形態(tài)及分子鑒定，確認(rèn)再分離物和接種物的一致性．

1.2.2 病原鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定： 將供試的致病菌株接種到PDA培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)，7 d后觀察培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)及色素產(chǎn)生情況．參照Skovgaard等[13]的報(bào)道，進(jìn)行病原菌種的形態(tài)學(xué)鑒定．

分子鑒定： 采用改良的CTAB法提取基因組DNA[13]，以核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄區(qū)域間隔區(qū)(rDNA-ITS)的通用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)[14]進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其PCR產(chǎn)物，并委托上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序；將所得ITS序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)，獲得相似度較高且已報(bào)道的病原菌序列；運(yùn)用軟件MEGA 6.0，采用最大似然法(Maximum likeihood)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，以確定各病原菌的分類地位．

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離和培養(yǎng)

調(diào)查發(fā)現(xiàn)田間豇豆根腐病發(fā)病癥狀為： 受害根莖部和主根紅褐色，病部稍凹陷，側(cè)根脫落或腐爛死亡(圖1)．根據(jù)發(fā)病癥狀采集病樣進(jìn)行組織分離，分離物經(jīng)純化并單孢分離后共獲得122株單孢菌株．通過(guò)觀察菌株在PDA培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征，發(fā)現(xiàn)分離菌株的氣生菌絲均較茂盛，菌絲初為白色，隨菌齡增長(zhǎng)，不同菌株菌落產(chǎn)生顏色不同，根據(jù)色素產(chǎn)生情況，大致將病原菌分為12類(表1)．所有菌株在PDA培養(yǎng)基上均不易產(chǎn)生大孢子，小孢子卵圓形至短桿形，有些菌株容易產(chǎn)生厚垣孢子(圖2)，這些特征與鐮孢屬真菌的形態(tài)特征相符．因此，初步認(rèn)定這些病原菌均屬于鐮孢屬(Fusarium)．

圖1 豇豆根腐病田間癥狀

表1 成都平原鑒定出的122株豇豆根腐病病原菌信息

續(xù)表1

圖2 豇豆根腐病病原菌的形態(tài)學(xué)特征

2.2 致病性測(cè)定

孢子懸浮液接種在健康豇豆植株上15 d后，觀察植株發(fā)病情況．結(jié)果看出，部分植株萎蔫、落葉、倒伏，根部開始出現(xiàn)褐色病變，根系壞死腐爛，且維管束呈紅褐色并可延及根莖部，而對(duì)照植株不發(fā)?。罁?jù)柯赫氏法則，從病斑處再次分離菌株經(jīng)ITS序列分析和病原形態(tài)顯微鏡鏡檢發(fā)現(xiàn)，病原菌均與原菌株一致(圖3)．

圖3 病原菌回接豇豆后的典型癥狀

再次從回接發(fā)病植株上分離的4種鐮孢菌形態(tài)特征如下： 尖鐮孢菌小型分生孢子，量大，卵圓形或腎形，5.2～10.2 μm×2.4～3.6 μm；大型分生孢子鐮刀型，1～7隔膜，多數(shù)3隔膜，12.1～59 μm×2.5～5.1 μm(圖4a)．茄腐鐮孢菌小型分生孢子，卵形或腎形，8.6～15.5 μm×2.4～3.9 μm；大型分生孢子鐮刀型，孢子形態(tài)較短胖，2～8隔膜，多數(shù)3隔膜，18.2～45.3 μm×3.2～6.3 μm(圖4b)．輪枝鐮孢菌小型分生孢子串生，2.5～4.2 μm×2.0～2.8 μm；大型分生孢子鐮刀型，2～3隔膜，22.5～41.3 μm×2.6～5.5 μm(圖4c)．層生鐮孢菌小型分生孢子卵形或短棒形，5.2～10.3 μm×2.3～3.5 μm；大型分生孢子舟型，長(zhǎng)而直，兩端略彎，20.5～43.5 μm×3.6～4.9 μm(圖4d)．木賊鐮孢菌未在PDA培養(yǎng)基上觀察到小型分生孢子．

圖4 豇豆病根部再分離物形態(tài)特征

2.3 病原菌的分子生物學(xué)鑒定

對(duì)122株分離物進(jìn)行分子鑒定，分別將株菌PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，獲得約520 bp的擴(kuò)增條帶(圖5)．將測(cè)序所得序列與NCBI中相關(guān)序列進(jìn)行比對(duì)，并結(jié)合MEGA軟件進(jìn)行聚類分析．最后根據(jù)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)特征將122株病原菌分為5種，即茄腐鐮孢、尖鐮孢、輪枝鐮孢、層生鐮孢、木賊鐮孢菌(圖6)．

M： DL2000；4： CY28441；5： CY22813；6： CY2812；7： CY23522；8： CY1.12；9： CY2.51；10： CY22821；11： CY22912；12： CY28443；13： JG2-2.11；14： JG2-3.12；15： JG1-3.31；16： JG2-3.23；17： JG2-4.21；18： LJ2.13；19： LD13．圖5 菌株P(guān)CR產(chǎn)物的1%瓊脂糖凝膠電泳

其中尖鐮孢共有99個(gè)分離物，分離頻率最高，為81.1%，其他病原菌的分離頻率均小于11%(表2)；5類菌株在崇州地區(qū)均有出現(xiàn)，且分離的菌株數(shù)量最多，雙流分離病原菌只有1種，為尖鐮孢．來(lái)自豇豆成株期的17株病原菌均為尖鐮孢，而分離純化自豇豆苗期的105株菌株隸屬于5種不同的鐮孢菌，這表明引起成都平原豇豆根腐病的病原菌主要為鐮孢菌，且多為尖鐮孢，在6個(gè)主產(chǎn)區(qū)均有分布，并導(dǎo)致植株在苗期和成株期發(fā)?。?/p>

表2 成都平原豇豆根腐病原菌屬種分布

3 結(jié)論與討論

根腐病在四川省豇豆產(chǎn)區(qū)擴(kuò)展很快，嚴(yán)重制約了豇豆生產(chǎn)和綠色發(fā)展．本研究針對(duì)成都平原豇豆根腐病發(fā)生嚴(yán)重、病原不清的問(wèn)題，通過(guò)采集該地區(qū)主要種植地的根腐病病樣，基于形態(tài)學(xué)和分子鑒定，明確了引起該地區(qū)豇豆根腐病的病原菌為鐮孢菌，包括茄腐鐮孢、尖鐮孢、輪枝鐮孢、層生鐮孢、木賊鐮刀菌等5類鐮孢菌，其中以尖鐮孢為優(yōu)勢(shì)致病菌．

目前，國(guó)內(nèi)外已報(bào)道可引起豇豆根腐病的鐮孢菌有11 種(https： //nt.ars-grin.gov/fungaldatabases/)，如茄腐鐮孢、尖鐮孢、輪枝鐮孢等[8]．但豇豆根腐病的致病菌類群及病害發(fā)生與栽培方式、品種抗性、土壤菌源量等均有關(guān)系．楊玉潔等[15]通過(guò)鑒定得出江蘇省如皋市豇豆根腐病原菌主要有茄腐鐮孢、尖孢鐮孢和立枯絲核菌．吳仁峰等[16]鑒定出湖北武漢地區(qū)的豇豆根腐病原菌為茄腐鐮孢．李秋潔等[17]從海南省三亞市豇豆主要種植區(qū)的19份根腐病病樣中分離到的23株菌株，其中以茄腐鐮孢菌和尖孢鐮孢菌為主．本研究鑒定發(fā)現(xiàn)，成都平原豇豆根腐病病原菌主要為茄腐鐮孢、尖鐮孢、輪枝鐮孢、層生鐮孢、木賊鐮刀菌等5類鐮孢菌，其中尖孢鐮孢在豇豆各主產(chǎn)區(qū)出現(xiàn)的頻率最高(81.1%)、分布最廣，為豇豆根腐病的主要病原，其次為茄腐鐮孢菌和輪枝鐮孢菌，研究結(jié)果與上述報(bào)道地區(qū)有所不同．這可能與成都平原特殊的氣候條件和栽培品種有關(guān)．成都平原屬亞熱帶季風(fēng)性濕潤(rùn)氣候，夏季高溫多雨，土壤質(zhì)地以黑壤土、黃黏土為主，長(zhǎng)年連作、化肥過(guò)施等因素造成土壤板結(jié)、質(zhì)量下降，為多種植物根腐病的流行性發(fā)生提供了環(huán)境條件[11，18]；同時(shí)，規(guī)?；B續(xù)種植導(dǎo)致致病鐮孢菌的厚垣孢子能夠在土壤及病殘?bào)w中長(zhǎng)期積累存活，增加土壤菌源量，從而加重病情．此外，因成都平原種植的豇豆多為綠莢、肉厚、細(xì)長(zhǎng)品種，尤其以適宜泡漬加工特性的品種為主，這些品種缺乏對(duì)根腐病的抗性．

本研究主要針對(duì)成都平原發(fā)病較為嚴(yán)重的豇豆主產(chǎn)區(qū)的豇豆根腐病菌進(jìn)行分離和鑒定，在地理分布和區(qū)域方面具有一定的代表性，結(jié)果表明崇州地區(qū)發(fā)現(xiàn)的根腐病病原菌種類、數(shù)量最多．閆文雪等[8]對(duì)采自山東省和甘肅省的16份豇豆標(biāo)樣進(jìn)行分離獲得16個(gè)病原，經(jīng)鑒定均為茄腐鐮孢菌，吳仁鋒等[16]報(bào)道的豇豆根腐病種類也為茄腐鐮孢菌(F.solani)．上述兩篇文章并未明確標(biāo)樣來(lái)源為成株期還是苗期，本研究所采的豇豆成株期根腐病病原菌株的17株均為尖鐮孢菌，而苗期根腐病包含上述5種不同的鐮孢菌，表明成株期的根腐病原種類和苗期的根腐病原種群具有一定的差異性．以尖鐮孢菌為主造成其他作物發(fā)生根腐病的也有報(bào)道，如四川省的大豆根腐病[18]，甘肅省的百合根腐病[19]，黑龍江省的大豆根腐病[20-21]，以及山西省植物病原鐮孢菌以尖鐮孢為優(yōu)勢(shì)種[22]，而成都平原地區(qū)還未有此病原菌侵染豇豆的報(bào)道．

在本研究中，疑似病原菌的鑒定采用了形態(tài)特征結(jié)合rDNA-ITS序列分析的分子方法，彌補(bǔ)了形態(tài)特征無(wú)法有效鑒定鐮孢菌屬內(nèi)種的缺陷．但也有人發(fā)現(xiàn)，鐮孢菌各種的rDNA-ITS序列相對(duì)保守，差異變異區(qū)域較少，無(wú)法準(zhǔn)確區(qū)分鐮孢菌各種及復(fù)合種[23-25]，因此，未來(lái)對(duì)于鐮孢菌種，特別是復(fù)合種的鑒定工作需要補(bǔ)充其他的核酸序列，如翻譯延伸因子基因EF1-α和RNA聚合酶Ⅱ基因RPB2[26]．同時(shí)，前人研究發(fā)現(xiàn)鐮孢菌屬多種鐮孢菌都能產(chǎn)生色素，且色素顏色多變，甚至同種鐮孢菌能產(chǎn)生多種色素[27-30]，如Menezes等[27]報(bào)道茄腐鐮孢菌BRM054066菌株能夠產(chǎn)生紅色素，Zheng等[28]報(bào)道暗培養(yǎng)下茄腐鐮孢菌產(chǎn)生橄欖綠色素．鑒于此，本研究以鐮孢菌產(chǎn)生的色素顏色作為培養(yǎng)的主要指標(biāo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，茄腐鐮孢菌產(chǎn)生淡黃色色素，尖鐮孢菌觀察到的色素達(dá)12種，表明色素不能作為鐮孢菌分類的依據(jù)．

綜上，本文研究厘清了造成成都地區(qū)豇豆根腐病的病原，特別是崇州地區(qū)的豇豆根腐病原種類的多樣性，為豇豆的抗根腐病提供了依據(jù)．為了更好地防治豇豆根腐病，應(yīng)該針對(duì)不同地區(qū)不同病原菌種群制定科學(xué)的防治策略，合理選用抗病品種，提高田間管理水平，盡可能采用生物防治方法實(shí)現(xiàn)對(duì)豇豆根腐病的綜合防治．