組蛋白乙?；揎椩谙∈髿獾纼?nèi)黏蛋白5AC表達(dá)中的作用研究*

潘珍珍，徐詩堯，張健，王倩，項(xiàng)紅霞，李羚

（無錫市兒童醫(yī)院1.呼吸科，2.檢驗(yàn)科，江蘇 無錫214023）

支氣管哮喘（以下簡稱哮喘）是兒童常見的一種慢性氣道變應(yīng)性疾病。有研究表明表觀遺傳修飾在環(huán)境和遺傳因素之間起重要作用，其中與哮喘發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)的是組蛋白乙?；揎梉1]。這個(gè)可逆性過程分別由組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶（histone acetyltransferase, HAT）和組蛋白去乙?；福╤istone deacetylases,HDAC）介導(dǎo)[1]。

MUC5AC是一種主要的黏蛋白基因，在正常氣道中有表達(dá)，且在哮喘和慢性阻塞性肺疾病患者氣道中的表達(dá)升高。雖然氣道黏蛋白分泌是氣道防御的重要組成部分，但過多分泌也是氣道阻塞的重要原因之一。曲古抑菌素A（Trichostatin A, TSA）作為HDAC 的抑制劑，在本課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)對(duì)哮喘小鼠具有治療作用，與既往研究結(jié)果類似[2-4]。具體機(jī)制與其可使T 細(xì)胞高度乙?；?，Th1/Th2 比值降低有關(guān)。亦有實(shí)驗(yàn)證實(shí)不同濃度的TSA 可影響MUC5AC 的表達(dá)[5]，本課題組前期實(shí)驗(yàn)亦證實(shí)人MUC5AC基因的核心啟動(dòng)子區(qū)域位于-935 bp至+48 bp處，且P 300 可以下調(diào)MUC5AC基因的表達(dá)[6]，說明HAT 活性與MUC5AC基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控密切相關(guān)。本文通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步證實(shí)組蛋白乙?；揎椩谙∈驧UC5AC 表達(dá)中的重要作用。

1 材料與方法

1.1 復(fù)制哮喘小鼠模型

雄性、SPF 級(jí)、6～8周齡BALB/c 小鼠40只，平均體重為（20±2）g，無卵蛋白飲食。首日致敏予腹腔內(nèi)注射10%卵蛋白和10%氫氧化鋁混合液1 ml，第7 天重復(fù)1 次以加強(qiáng)致敏；2 周后將小鼠置于自制透明霧化吸入箱（20 cm×30 cm×40 cm），予1%OVA霧化吸入（霧化顆粒直徑3～5 μm），1次/d，30 min/次，連續(xù)2 周。

1.2 TSA干預(yù)

末次激發(fā)后將哮喘小鼠隨機(jī)分為3 組，哮喘組（13 只）、TSA治療組（13只）和對(duì)照組（14只），哮喘組及對(duì)照組小鼠尾靜脈注射生理鹽水0.2 ml（1.0 mg/kg），TSA治療組小鼠尾靜脈注射TSA 0.2 ml（1.0 mg/kg）。

1.3 眼眶后靜脈叢采血

TSA 干預(yù)小鼠48 h 后經(jīng)腹腔注射100 g/L 烏拉坦0.5 ml 麻醉，眼眶后靜脈叢采血后EDTA 抗凝管保存，全血上機(jī)檢測血常規(guī)[包括白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC）、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)（NE）、血小板計(jì)數(shù)（PLT）及嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)（EOS）]，血清用作酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測MUC5AC 水平（試劑盒購自英國Abcam 公司）。

1.4 肺組織標(biāo)本采集及肺泡灌洗液收集

固定小鼠，暴露胸腔，切除左肺迅速放入-80℃冰箱用作HAT 活性分析，再用一鈍頭注射器插入氣管，輕柔注入生理鹽水0.3 ml 后回抽，共3 次，回收液即肺泡灌洗液（BALF）。再注入40 g/L 多聚甲醛0.3 ml 使右肺充盈，結(jié)扎氣管后切除右肺浸入4%多聚甲醛中固定，用于脫水、石蠟包埋固定和切片，進(jìn)行肺組織蘇木精-伊紅（HE）染色及免疫組織化學(xué)染色檢測。

1.5 肺組織HE染色

中性甲醛固定組織脫水后予二甲苯透明，用石蠟包埋切片，脫蠟至水，行肺組織HE染色，中性樹膠封固，光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠肺組織病理學(xué)變化。

1.6 BALF計(jì)數(shù)

按常規(guī)瑞特染色進(jìn)行，通過顯微鏡觀察至少200 個(gè)細(xì)胞，確定不同細(xì)胞數(shù)目。

1.7 免疫組織化學(xué)法檢測肺組織內(nèi)MUC5AC蛋白表達(dá)

采用過氧化物酶標(biāo)記的鏈酶卵白素（SP）染色，即切片經(jīng)常規(guī)脫蠟、梯度水化后，用3%過氧化氫孵育10 min 滅活內(nèi)源性過氧化物酶，枸櫞酸鹽緩沖液微波修復(fù)抗原10 min，正常山羊血清封閉，滴加1∶100 的小鼠抗MUC5AC 單克隆抗體4℃過夜，滴加速用型生物素化二抗工作液，DAB 顯色，蘇木精對(duì)比染色、脫水、透明、中性樹膠封固。用常規(guī)抗體稀釋液0.01 MPBS 代替小鼠抗MUC5AC 單克隆抗體作為陰性對(duì)照；在高倍視野下，細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色著染為陽性細(xì)胞。蛋白表達(dá)強(qiáng)度用高清晰度彩色圖像分析系統(tǒng)測定5 個(gè)視野的光密度（OD）值，取其平均值表示。

1.8 HAT和HDAC活性測定

取出小鼠左肺，采用Ficoll-Hypaque 密度分離法分離單個(gè)核細(xì)胞，后提取核蛋白，酶聯(lián)免疫熒光法檢測HAT 及HDAC 活性，試劑盒購自美國Bio Vision 公司。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）或中位數(shù)和四分位數(shù)[M（P25，P75）]表示，比較用方差分析或H檢驗(yàn)；進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)或χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 驗(yàn)證模型是否復(fù)制成功

哮喘模型的復(fù)制參考既往已發(fā)表的研究[7]，通過癥狀和肺組織病理驗(yàn)證哮喘小鼠模型復(fù)制成功。

2.1.1 癥狀小鼠在致敏期間無任何陽性表現(xiàn)，首次激發(fā)期間小鼠即出現(xiàn)焦躁不安、呼吸急促等陽性反應(yīng)，但并不明顯，之后每次激發(fā)期間小鼠均表現(xiàn)出焦躁不安。

2.1.2 肺組織病理檢查結(jié)果哮喘組小鼠肺組織HE染色可見氣道周圍水腫，炎癥細(xì)胞浸潤（見圖1）。

圖1 肺組織病理改變 （HE染色×400）

2.2 3組外周血常規(guī)比較

3 組小鼠的外周血嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)（EOS）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），進(jìn)一步兩兩比較后可見哮喘組小鼠外周血EOS 較TSA 治療組、對(duì)照組升高（P＜0.05），TSA 治療組與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。而3 組小鼠外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC）、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)（NE）及血小板計(jì)數(shù)（PLT）比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 3組外周血常規(guī)比較 [×109，M(P25，P75)]

2.3 3 組BALF 及EOS 計(jì)數(shù)的比較

3 組小鼠BALF 及EOS 計(jì)數(shù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較，哮喘組BALF 和EOS 計(jì)數(shù)較TSA 治療組及對(duì)照組升高（P＜0.05），而TSA 治療組與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 3組BALF及EOS計(jì)數(shù)比較 （×105，±s）

表2 3組BALF及EOS計(jì)數(shù)比較 （×105，±s）

注：①與對(duì)照組比較，P ＜0.05；②與哮喘組比較，P ＜0.05。

組別哮喘組TSA治療組對(duì)照組F 值P 值n 13 13 14 BALF 3.03±0.29①1.58±1.03②1.02±0.39 9.602 0.008 EOS 1.23±0.78①0.85±0.16②0.64±0.82 8.192 0.012

2.4 3組小鼠HAT及HDAC活性比較

3 組小鼠的HAT 和HDAC 活性比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較，TSA 治療組、對(duì)照組小鼠HAT、HDAC 活性較哮喘組降低（P＜0.05），而TSA 治療組與對(duì)照組HAT、HDAC 活性比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。新定義的變量HDAC/HAT 為兩者間的比值，3 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），進(jìn)一步兩兩比較，TSA治療組、對(duì)照組HDAC/HAT比值較哮喘組升高（P＜0.05）。見表3。

表3 3組小鼠HAT和HDAC活性比較 （±s）

表3 3組小鼠HAT和HDAC活性比較 （±s）

注：①與對(duì)照組比較，P ＜0.05；②與哮喘組比較，P ＜0.05。

組別哮喘組TSA治療組對(duì)照組F 值P 值n 13 13 14 HAT活性/[RFU/（h·μg）]0.49±0.25①0.28±0.18②0.30±0.24 7.037 0.036 HDAC活性/[RFU/（h·μg）]0.91±0.09①0.78±0.03②0.72±0.17 6.923 0.027 HDAC/HAT 1.86±0.87①2.79±0.45②2.40±1.08 6.909 0.024

2.5 3組小鼠血清MUC5AC表達(dá)水平比較

3 組小鼠血清MUC5AC 表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=10.037，P=0.008）。進(jìn)一步兩兩比較，TSA治療組MUC5AC表達(dá)水平（0.38±0.072）、對(duì)照組小鼠MUC5AC 表達(dá)水平（0.29±0.130）均較哮喘組（0.74±0.015）低，而TSA 治療組與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.6 肺組織病理改變及免疫組織化學(xué)

2.6.1 肺組織HE 染色及氣道AB-PAS 染色肺組織HE 染色可見哮喘組小鼠氣道周圍水腫，炎癥細(xì)胞增多，而TSA 治療后明顯改善，但哮喘組的纖毛損傷不明顯。氣道AB-PAS 染色亦可見哮喘小鼠氣道上皮炎癥細(xì)胞浸潤，TSA 治療后炎癥細(xì)胞浸潤減少（見圖2、3）。

圖2 3組小鼠肺組織病理改變 （HE染色×400）

圖3 3組小鼠氣道組織病理改變 （AB-PAS染色×400）

2.6.2 肺組織免疫組織化學(xué)免疫組織化學(xué)結(jié)果示，哮喘組MUC5AC 蛋白陽性表達(dá)升高，而TSA 治療組MUC5AC 蛋白陽性表達(dá)較哮喘組減 少（見 圖4）。 定量分析可見3 組小鼠MUC5AC 抗體免疫組織化學(xué)OD 值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=11.506，P=0.003）。進(jìn)一步兩兩比較，哮喘組小鼠MUC5AC 抗體免疫組化OD 值（0.675±0.128）較對(duì)照組（0.099±0.134）升高（P＜0.05），TSA 治療組MUC5AC 抗體免疫組織化學(xué)OD 值（0.184±0.093）較哮喘組降低（P＜0.05），TSA 治療組與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖4 3組小鼠肺組織MUC5AC蛋白陽性表達(dá) （免疫組織化學(xué)染色）

3 討論

哮喘是兒童常見的一種氣道變應(yīng)原性慢性炎癥性疾病，其影響到全球＞10%的兒童，其發(fā)病機(jī)制目前尚不完全明確，其機(jī)制的研究有助于發(fā)現(xiàn)更好、更優(yōu)的治療手段。表觀遺傳學(xué)一直是比較熱門話題，在環(huán)境和遺傳因素之間起到重要作用，其中與哮喘發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)的是組蛋白乙酰化修飾[1]。所謂組蛋白乙?；揎?，即修飾多發(fā)生在H3/H4N-末端賴氨酸殘基上致局部DNA 與組蛋白八聚體緊密纏繞被解開染色質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變，調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄組蛋白乙?；ǔ４龠M(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄，與炎癥基因誘導(dǎo)和細(xì)胞增殖有關(guān)。這個(gè)可逆性過程分別由HAT 和HDAC 介導(dǎo)[8]。

本課題前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)在哮喘患兒體內(nèi)存在HAT 活性的升高及HDAC 活性降低，且在哮喘小鼠體內(nèi)有同樣的改變[9]，已知許多輔激活因子都具有HAT 活性，如環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合因子（cAMP response element binding protein-binding protein, CBP）、p300/CBP 相關(guān)因子（p300/CBPassociated factor, PCAF）、腺病毒E1A 相關(guān)蛋白等。其本身并不能結(jié)合DNA，但通過與序列特異的激活因子相互作用，被吸引到啟動(dòng)子部位，介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的激活[10-11]。當(dāng)組蛋白的N 末端賴氨酸殘基在上述刺激因子和前炎癥轉(zhuǎn)錄因子如核因子-κB（nuclear factor-κB, NF-κB）及活化蛋白-1（activated protein-1, AP-1）等的作用下發(fā)生乙酰化，與組蛋白緊密纏繞的DNA 局部被解開，利于與RNA 聚合酶Ⅱ結(jié)合，激活轉(zhuǎn)錄，從而編碼炎癥蛋白，促進(jìn)哮喘發(fā)生。

MUC5AC是一種主要的黏蛋白基因，在正常氣道也有表達(dá)，但在哮喘和COPD 患者的氣道是增加的[12]。雖然氣道黏蛋白分泌是氣道防御的重要組成部分，但過多分泌也是氣道阻塞的重要原因之一，在致死性哮喘患者中，幾乎總是與氣道黏液過多分泌引起的阻塞有關(guān)[13]。另外，黏液高分泌是哮喘患者的一個(gè)共同癥狀，特別是哮喘加重期。已證明黏液產(chǎn)生與患者的FEV1 下降有關(guān)[14]。這證明黏液高分泌是哮喘加重的標(biāo)志之一。目前人MUC5AC基因啟動(dòng)子的背景比較清晰，許多轉(zhuǎn)錄因子可與之結(jié)合并促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄，其中AP-1、SP-1、NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子均可與CBP/p300 發(fā)生相互作用[15]。研究發(fā)現(xiàn)地塞米松可以通過招募HDAC2，減少M(fèi)UC5AC 的表達(dá)[16]，另有實(shí)驗(yàn)證實(shí)不同濃度的TSA可影響MUC5AC 的表達(dá)[8]，說明MUC5AC基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控可能與乙?；饔孟嚓P(guān)，但其中的分子學(xué)調(diào)控機(jī)制及動(dòng)物試驗(yàn)的驗(yàn)證除本課題組的研究外尚未發(fā)現(xiàn)此類研究。

本課題組前期分子學(xué)實(shí)驗(yàn)已證實(shí)人MUC5AC基因的核心啟動(dòng)子區(qū)域位于-935 bp 至+48 bp 處，且P300 可以下調(diào)MUC5AC基因的表達(dá)[6]，說明HAT 活性與MUC5AC基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控密切相關(guān)。接下來，本研究通過動(dòng)物試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)組蛋白乙?；揎椩谙∈驧UC5AC 表達(dá)中的重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)哮喘組小鼠外周血嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)較TSA 治療組、對(duì)照組均升高，TSA 治療組與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，哮喘組小鼠BALF 及EOS 計(jì)數(shù)均較TSA 治療組及對(duì)照升高，進(jìn)一步提示TSA 對(duì)于哮喘的治療作用，而TSA 主要通過下調(diào)嗜酸性粒粒細(xì)胞性炎癥來起到治療哮喘的作用，其可能與HAT 具有招募嗜酸性粒細(xì)胞作用有關(guān)。另肺組織HE 染色可見哮喘組小鼠氣道周圍水腫，炎癥細(xì)胞增多，而TSA 治療后明顯改善，以上結(jié)果均證實(shí)TSA 對(duì)于哮喘的治療作用。TSA 作為HDAC 的抑制劑，在抑制HDAC 活性的同時(shí)卻可刺激抗炎因子的合成和表達(dá)，包括細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1b、IL-6、IL-10、IL-12 和IFN-γ 等[17-18]，且HDAC 抑制劑的效果可能根據(jù)細(xì)胞類型而不同。在小鼠哮喘模型中，致敏期間T 細(xì)胞擴(kuò)增和活化發(fā)生在胸部淋巴結(jié)中，在過敏原激發(fā)后，肺中的T 細(xì)胞群顯著增加，其中大部分?jǐn)U增是由于CD4+細(xì)胞產(chǎn)生Th2 細(xì)胞因子，如IL-4、IL-5 和IL-13，導(dǎo)致肺嗜酸性粒細(xì)胞增多、黏液分泌過多以及氣高反應(yīng)[19]。因此，控制Th2 細(xì)胞因子的產(chǎn)生將改善氣道炎癥、降低高反應(yīng)性[20]。據(jù)報(bào)道，TSA 可減少CD4+T 細(xì)胞增殖，對(duì)IL-2 分泌和CD154 表達(dá)具有抑制作用[21]，因此可以有效地抑制體內(nèi)T 細(xì)胞的活性。另有實(shí)驗(yàn)證實(shí)TSA 減少BALF 中CD4+T 細(xì)胞數(shù)量，以及BALF 中代表性Th2細(xì)胞因子（包括IL-4 和IL-5）的表達(dá)。這些發(fā)現(xiàn)均表明TSA 對(duì)哮喘炎癥反應(yīng)具有治療作用[2]。TSA 是公認(rèn)的HDAC 抑制劑之一，但在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，TSA 治療組小鼠HAT 活性明顯降低，說明TSA 不僅抑制HDAC 活性，亦可下調(diào)HAT 活性，與既往研究相符[22]，但TSA 治療組和對(duì)照組的HDAC/HAT 比值較哮喘組明顯降低，這樣的改變使TSA 治療后雖HAT、HDAC 活性均被抑制，但是HDAC 活性仍能發(fā)揮主要作用，從而對(duì)哮喘起到治療作用，但具體機(jī)制需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。ELISA 結(jié)果顯示TSA治療可降低哮喘小鼠血清MUC5AC 濃度；免疫組織化學(xué)結(jié)果示，TSA 治療組較哮喘組能明顯減少M(fèi)UC5AC 蛋白含量，TSA 治療組與對(duì)照組無差異，說明組蛋白乙?；揎梾⑴cMUC5AC 蛋白的表達(dá)，結(jié)合前期分子學(xué)實(shí)驗(yàn)，考慮與HAT 活性有關(guān)，TSA在抑制HDAC 活性的同時(shí)，也抑制HAT 活性，從而使得MUC5AC 表達(dá)下降，證實(shí)組蛋白乙?；揎棧绕涫荋AT 活性在哮喘小鼠MUC5AC 表達(dá)中起重要的作用，而TSA 對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥及黏液分泌方面起著治療作用。

綜上所述，組蛋白乙酰化修飾在哮喘發(fā)病中的作用日趨重要，但相關(guān)機(jī)制尚不完全清楚，黏蛋白作為哮喘患者體內(nèi)分泌明顯增高的一種蛋白，與哮喘的發(fā)病及病情演變密切相關(guān)，本課題組在前期實(shí)驗(yàn)中均證實(shí)組蛋白乙?；揎椏赡軈⑴c黏蛋白的分泌過程，但是本文仍具有一些局限性，主要包括以下幾點(diǎn)：①因MUC5AC 分子量過大，本研究未成功完成Western blotting；②在本實(shí)驗(yàn)過程中出現(xiàn)肺泡灌洗液回收困難的情況，其中4 只小鼠在肺泡灌洗過程中出現(xiàn)肺泡破裂，3 只小鼠回抽肺泡灌洗液不成功，回收不成功小鼠大多數(shù)為哮喘組，考慮一方面與操作不當(dāng)有關(guān)，另一方面可能與哮喘小鼠氣道炎癥腫脹有關(guān)；③未對(duì)小鼠的肺功能及氣道高反應(yīng)性進(jìn)行檢測；④本課題僅限于表型的研究，缺乏機(jī)制的研究，經(jīng)過前期研究，初步考慮其機(jī)制可能與MUC5AC基因啟動(dòng)子出的組蛋白乙酰化或者相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生乙?；揎椨嘘P(guān)。本課題組將在后期實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步探索HAT 活性對(duì)MUC5AC 表達(dá)調(diào)控的作用，期望為將來從分子學(xué)角度研究哮喘的發(fā)病機(jī)制，從而指導(dǎo)分子學(xué)層面的診療奠定基礎(chǔ)。