牡丹授粉受精基因PoMYBs的VIGS體系的建立

王鵬搖，劉鵬，耿丹丹，王奎玲，郝青

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)園林與林學(xué)院,山東青島 266109)

牡丹(Paeoniasuffruticosa)是芍藥科(Paeoniaceae)芍藥屬(Paeonia)牡丹組(Paeoniasect.Moutan)多年生落葉灌木，是我國(guó)的傳統(tǒng)名花，具有很高的觀賞、藥用、油用及保健價(jià)值。牡丹籽油中含有極為豐富的不飽和脂肪酸尤其是α-亞麻酸，其具有降血糖、血脂、提高視力以及預(yù)防心肌梗死等醫(yī)療保健功能，國(guó)家衛(wèi)生部于2011年批準(zhǔn)牡丹籽油成為新資源食品[1]。作為具有中國(guó)特色的潛在木本油料作物，如何提高其種子產(chǎn)量成為研究的重點(diǎn)。

MYB轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)參與調(diào)控花粉發(fā)育、花藥開(kāi)裂、花粉管導(dǎo)向、精細(xì)胞釋放等有性生殖過(guò)程在植物受精中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，從而影響著植物結(jié)實(shí)性[2]。MYB33和MYB65對(duì)擬南芥的花粉囊和花粉都具有促進(jìn)發(fā)育的作用[3]；MYB4、MYB21、MYB24、MYB26、MYB32和MYB57參與花粉壁的形成和調(diào)控花藥的開(kāi)裂[4]；在助細(xì)胞中表達(dá)的MYB98基因參與調(diào)控花粉管的導(dǎo)向[5]；MYB97、MYB101和MYB120突變體的花粉管在進(jìn)入胚囊后不停止生長(zhǎng)和爆裂釋放精細(xì)胞，導(dǎo)致胚珠不能正常受精[6]；過(guò)表達(dá)油菜BcMF28出現(xiàn)花絲縮短、花藥不開(kāi)裂和花粉敗育等雄蕊異常發(fā)育的現(xiàn)象[7]；蘋果MdMYB39L在雄蕊發(fā)育、花粉萌發(fā)及花粉管生長(zhǎng)中發(fā)揮重要作用[8]。MYB轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與植物授粉受精過(guò)程的各個(gè)階段并影響植株結(jié)實(shí)。

目前尚未見(jiàn)牡丹再生和遺傳轉(zhuǎn)化體系的報(bào)道，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)在同源植物上進(jìn)行功能驗(yàn)證較為困難，限制了牡丹基因功能的研究，而且從牡丹實(shí)生苗到開(kāi)花需要3～5 a的時(shí)間，開(kāi)花結(jié)實(shí)相關(guān)基因的表型鑒定困難較大。病毒誘導(dǎo)的基因沉默(Virus induced gene silencing，VIGS)技術(shù)是現(xiàn)階段快速、高效研究基因功能的方式，具有周期短、操作簡(jiǎn)便、不依賴成熟的轉(zhuǎn)基因體系、高通量等優(yōu)點(diǎn)[9]。近年來(lái)VIGS體系已經(jīng)在百合[10]、觀賞海棠[11]、矮牽牛[12]等多種植物中建立，廣泛應(yīng)用于植物生長(zhǎng)發(fā)育，如雌雄蕊發(fā)育、花發(fā)育、果實(shí)開(kāi)裂和成熟等，以及花色、器官形成、植物抗病性和非生物脅迫、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及代謝產(chǎn)物合成和調(diào)控等相關(guān)基因功能鑒定[13-15]。舒慶艷等[16]采用真空滲透法建立了可用于沉默花瓣中內(nèi)源基因的VIGS體系，但這一方法并不適用于組織厚、木質(zhì)化程度高的雌蕊、果實(shí)等部位授粉受精、結(jié)實(shí)等基因功能驗(yàn)證。

因此，本研究克隆了牡丹授粉受精基因PoMYB1和PoMYB2的非保守區(qū)段作為靶基因構(gòu)建重組載體，采用注射法侵染雌蕊和花柄部位，篩選適用于牡丹授粉受精基因的VIGS沉默體系的注射部位，在此基礎(chǔ)上，篩選適宜的注射菌液濃度，建立鑒定牡丹授粉受精基因的VIGS沉默體系，有助于牡丹授粉受精結(jié)實(shí)機(jī)理解析。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

所用試驗(yàn)材料為油用牡丹(Paeoniaostii)‘鳳丹白’,種植于中國(guó)科學(xué)院植物研究所北京植物園牡丹芍藥資源圃。VIGS載體來(lái)自煙草脆裂病毒載體(tobacco rattle virus，TRV)，TRV1/TRV2載體信息參考Tian等[17]的文獻(xiàn)。

1.2 基因克隆

‘鳳丹白’雌蕊總RNA的提取參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行(RNA prep Pure Plant Kit，天根生化科技(北京)有限公司)。根據(jù)公共數(shù)據(jù)庫(kù)中PoMYB1和PoMYB2序列設(shè)計(jì)上下游引物(表1)克隆靶片段，用于VIGS沉默的PoMYB1片段設(shè)計(jì)上下游引物并添加X(jué)baI和SacI酶切位點(diǎn)，PoMYB2添加EcoRI和KpnI酶切位點(diǎn)。

表1 本研究所用引物序列相關(guān)信息Table 1 Primer lists and related information used in this study

1.3 VIGS體系建立

采用注射器注射法在牡丹花蕾期(花骨朵狀態(tài))進(jìn)行菌液侵染，注射部位分別為雌蕊和花柄。選擇生長(zhǎng)狀況良好且長(zhǎng)勢(shì)一致的‘鳳丹白’枝條，分別用無(wú)菌注射器在緊實(shí)花蕾的雌蕊、花柄上部(花蕾基部)注入侵染液，少量多次注入，直至液體溢出時(shí)停止注射。為了確定最佳的農(nóng)桿菌接種濃度，將不同濃度的農(nóng)桿菌菌液(OD600分別為1.0、1.5和2.0)分別注射到牡丹花柄，將注射后的枝條浸于去離子水中，23 ℃～25 ℃，濕度50%～60%，暗培養(yǎng)1 d后轉(zhuǎn)移至16 h/8 h的光照/黑暗周期、溫度23 ℃～25 ℃，濕度50%～60%條件下培養(yǎng) 7 d，在授粉后24 h取材，比較沉默后的PoMYB2基因表達(dá)量。

為明確構(gòu)建的牡丹授粉受精基因PoMYBs的VIGS體系的有效性，分析授粉前后不同時(shí)期雌蕊中的沉默效果，對(duì)沉默后授粉前后不同時(shí)期的雌蕊中PoMYBs的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)分析。將侵染處理后的基因沉默材料分別在以下4個(gè)時(shí)期進(jìn)行取材：圓桃狀花蕾期(S1)、柱頭黏液分泌第1 d(S2)、授粉后24 h(S3)、授粉后48 h(S4)。

采集不同部位注射處理的雌蕊速凍于液氮中并存于-80 ℃，分析基因的表達(dá)水平相對(duì)于空白對(duì)照的變化，進(jìn)行PoMYB1和PoMYB2基因的表達(dá)量分析，設(shè)9次生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù)，引物序列見(jiàn)表1。

1.4 基因表達(dá)分析

使用FastKing cDNA第一鏈合成預(yù)混試劑盒(FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix)將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA模板，使用熒光定量PCR試劑盒(SYBR Green)進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，具體方法參照說(shuō)明進(jìn)行，試劑盒購(gòu)自北京天根生物科技公司。基因相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算采用2-△△CT[18]法，選取PoTubulin為內(nèi)參基因，3次生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用StepOne Software v2.3和Excel軟件進(jìn)行熒光定量PCR數(shù)據(jù)分析，采用軟件SPSS 19.0進(jìn)行顯著性差異分析(p<0.05)，Sigmaplot 12.5軟件繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 PoMYBs靶片段的克隆與目的基因VIGS重組載體的構(gòu)建

根據(jù)上、下游引物擴(kuò)增的牡丹PoMYB1和PoMYB2靶片段長(zhǎng)度分別為386 bp和388 bp，可用于構(gòu)建VIGS重組載體(圖1A)。將靶片段與線性載體進(jìn)行酶切連接反應(yīng)后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，進(jìn)行菌液PCR鑒定，可以看到8條清晰單一的特異條帶(圖1 B)，1—4泳道為TRV1，5—6泳道為TRV2，pTRV1載體的引物對(duì)設(shè)計(jì)在RNA依賴RNA聚合酶元件上(理論上PCR產(chǎn)物大小為647 bp)，pTRV2載體的引物設(shè)計(jì)在多克隆位點(diǎn)之間(理論上PCR產(chǎn)物大小為289 bp)，與泳道1—6一致，因此菌液確定為pTRV1和pTRV2。7泳道為pTRV2-PoMYB2，8泳道為pTRV2-PoMYB1，確定重組載體已成功構(gòu)建，可用于侵染牡丹器官。

2.2 不同注射部位基因沉默效率比較

分別注射‘鳳丹白’雌蕊和花柄部位以研究侵染不同部位對(duì)牡丹VIGS沉默效率的影響。注射雌蕊時(shí)，8個(gè)樣品中基因相對(duì)表達(dá)量降低50%以上的有5個(gè)樣品。其中，樣品8降低最多，為83%，樣品1、3、6、7中PoMYB2基因相對(duì)表達(dá)量降低了60%左右。說(shuō)明侵染雌蕊部位能夠使PoMYB2基因沉默，沉默效率為62.5%(圖2A)；注射花柄時(shí)，12個(gè)樣品中，基因相對(duì)表達(dá)量顯著降低的有8個(gè)樣品。其中，樣品11降低最多，為99.3%，其次樣品2降低了約99%，樣品3、6、8、9、10、12的表達(dá)量下降了約75%～80%。說(shuō)明TRV2-PoMYB2菌液侵染花柄部位能夠使PoMYB2基因沉默，效率為66.7%(圖2B)。結(jié)果表明注射法適用于牡丹植株VIGS體系的構(gòu)建，不同注射部位均能對(duì)牡丹植株造成有效沉默，但沉默效率有所不同，當(dāng)注射部位為花柄時(shí)，沉默效率最高，而且操作時(shí)注射花柄也較雌蕊容易。因此，注射法侵染植株花柄部位更適用于構(gòu)建牡丹VIGS體系。

A：PoMYB1和PoMYB2沉默片段；B：DH5α菌液PCR鑒定，1—4為TRV1，5—6為TRV2，7為pTRV2-PoMYB2，8為pTRV2-PoMYB1。A:Target framents of PoMYB1 and PoMYB2;B:PCR identification of DH5α bacteria，1—4 is TRV1,5—6 is TRV2,7 is pTRV2-PoMYB2and 8 is pTRV2-PoMYB1.圖1 牡丹PoMYBs基因沉默載體構(gòu)建Fig.1 Construction of PoMYBs genes silencing vector in tree peony

圖2 注射‘鳳丹白’不同部位PoMYB2基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.2 The relative expression of PoMYB2 gene in P. ostii ‘Feng Dan Bai’different parts injected注：柱狀圖上標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示達(dá)到5%的顯著水平(P<0.05)，下同。

2.3 菌液濃度對(duì)牡丹植株花柄部位基因沉默效率的影響

為了確定最佳的農(nóng)桿菌接種濃度，將不同濃度的農(nóng)桿菌菌液(OD600分別為1.0、1.5和2.0)分別注射到牡丹花柄，比較沉默后的PoMYB2基因表達(dá)量。當(dāng)菌液濃度OD600=1.0時(shí)，所有樣品的基因相對(duì)表達(dá)量均顯著降低，表達(dá)量下降幅度大部分在90%以上?；虮磉_(dá)量降低幅度最多為99.5%，最少約為60%，所有樣品均被沉默，基因沉默效率高達(dá)100%(圖3A)；當(dāng)OD600=1.5時(shí)，9個(gè)樣品中，8個(gè)樣品基因相對(duì)表達(dá)量顯著下降，7個(gè)在50%以上，樣品4雖然差異顯著，但降低幅度僅19%，表明該樣品未被沉默，沉默效率為77.8%(圖3B)；當(dāng)菌液濃度為OD600=2.0時(shí)，所有樣品中僅有3、7、8樣品的基因表達(dá)量降低，但降低幅度均未超過(guò)50%，PoMYB2基因未被沉默(圖3C)。因此，沉默PoMYBs基因研究牡丹雌蕊發(fā)育、授粉受精過(guò)程及結(jié)實(shí)的最適VIGS體系為：注射花柄部位，菌液OD600為1.0。

A、B、C：當(dāng)菌液濃度OD600分別為1.0、1.5、2.0時(shí)注射‘鳳丹白’花柄部位PoMYB2基因的相對(duì)表達(dá)量。 A,B,C:The relative expression level of PoMYB2 in the flower stalk of P. ostii ‘Feng Dan Bai’injected with OD600 of 1.0,1.5 and 2.0,respectively.圖3 沉默植株花柄部位PoMYB2基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.3 The relative expression of PoMYB2 gene in the silenced flower stalk

2.4 沉默PoMYBs基因在不同授粉時(shí)期的表達(dá)分析

為明確構(gòu)建的牡丹授粉受精基因PoMYBs的VIGS體系的有效性，分析授粉前后不同時(shí)期雌蕊中的沉默效果，對(duì)沉默后授粉前后不同時(shí)期的雌蕊中PoMYBs的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行了檢測(cè)分析。結(jié)果表明與VIGS空載對(duì)照植株相比，相對(duì)表達(dá)量降低幅度范圍在50.14%～99.97%之間，基因沉默效率均為100%，PoMYBs在授粉前后不同時(shí)期的表達(dá)均得到有效沉默。隨著授粉時(shí)間的延長(zhǎng)，PoMYB1在授粉后48 h沉默效率最高(圖4A)，PoMYB2在授粉后24 h的沉默效率最高(圖4B)。整體趨勢(shì)為授粉時(shí)間越長(zhǎng)，相對(duì)表達(dá)量越低，沉默效率越高。

S1：圓桃期；S2：柱頭黏液分泌第1 d；S3：授粉后24 h；S4：授粉后48 h。 S1:Carpel at walnut stage;S2:Stigma secretes mucus for the first day before pollination;S3:24 h after pollination;S4:48 h after pollination.圖4 沉默后PoMYBs在‘鳳丹白’不同時(shí)期雌蕊中的相對(duì)表達(dá)量Fig.4 Relative expression levels of PoMYBs before or after pollination after silencing

3 討論

牡丹尚未有穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系，VIGS技術(shù)在植物中的廣泛應(yīng)用為研究牡丹基因功能帶來(lái)了希望。VIGS沉默效果受到很多因素的影響，病毒載體的類型、插入片段的長(zhǎng)度、接種方法和部位、菌液濃度、植物生長(zhǎng)時(shí)期、溫度等都是影響病毒誘導(dǎo)基因沉默效率的關(guān)鍵因素[19-21]。注射法在煙草、番茄及馬鈴薯中已經(jīng)被證明是一種高效且強(qiáng)大的農(nóng)桿菌接種法[22]，相較真空滲透法操作簡(jiǎn)單，對(duì)花蕾受損害程度小，離體生長(zhǎng)周期長(zhǎng)。Xu等[23]在構(gòu)建珊瑚VIGS體系時(shí)發(fā)現(xiàn)葉片注射器滲透法比發(fā)芽種子真空滲透法效率顯著。舒慶艷等[16]采用真空滲透法對(duì)牡丹花瓣中的內(nèi)源基因進(jìn)行基因沉默，成功構(gòu)建了基于牡丹類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶VIGS體系，但這一方法并不適用于牡丹授粉受精相關(guān)基因的驗(yàn)證。牡丹花蕾組織厚，雌蕊木質(zhì)化程度較高。研究前期使用真空滲透法侵染，離體牡丹花蕾脫離牡丹植株后，花蕾缺乏生長(zhǎng)發(fā)育所必須的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，降低了抵抗環(huán)境脅迫的能力。真空滲透法會(huì)對(duì)整個(gè)牡丹花蕾造成損傷，極易造成花蕾腐爛，降低基因沉默效率，因此真空滲透法不適合研究牡丹結(jié)實(shí)相關(guān)基因沉默體系。本研究結(jié)果表明注射法適用于牡丹授粉受精基因功能驗(yàn)證的VIGS體系建立。

接種部位的選擇是影響沉默效率的一個(gè)重要因素。齊希梁等[24]對(duì)番茄果實(shí)和歐洲甜櫻桃果實(shí)的研究均表明注射果柄能夠有效沉默內(nèi)源基因的表達(dá)。本研究通過(guò)對(duì)花柄和雌蕊兩個(gè)接種部位的研究得到了相似的結(jié)果，注射花柄時(shí)沉默效果最好，選用花柄更有利于構(gòu)建高效的牡丹VIGS體系。注射花柄部位的VIGS技術(shù)不僅可以用于雌雄蕊發(fā)育、結(jié)實(shí)、授粉受精、花色、果色等相關(guān)基因的功能驗(yàn)證，且花柄發(fā)育成為果柄，因此在果實(shí)發(fā)育和種子發(fā)育等方面的研究均可借鑒。

合適的農(nóng)桿菌菌液濃度是構(gòu)建高效沉默體系的另一重要因素。菌液濃度過(guò)低，侵染率較低，沉默效果差；菌液濃度過(guò)高，對(duì)植物細(xì)胞有毒害作用，植株萎蔫，壞死率高[25]。以TRV為載體，真空滲透法侵染葡萄果實(shí)，設(shè)置菌液濃度OD600為1.0、1.5、2.0，結(jié)果表明在OD600=1.0時(shí)基因表達(dá)量最低，沉默效果最好[22]。張召軍等[26]以TYLCV衛(wèi)星DNA作為病毒載體，利用根吸收法侵染番茄幼苗，發(fā)現(xiàn)菌液濃度在OD600=1.5左右時(shí)基因沉默效率最高，可達(dá)84%。用TRV病毒誘導(dǎo)辣椒基因沉默時(shí)發(fā)現(xiàn)，接種侵染液濃度OD600=1.0時(shí)較OD600=2.0時(shí)沉默效率更高，而OD600=3.0時(shí)接種植株死亡率高[27]。而同樣的載體對(duì)于非洲菊幼苗則在OD600=2.0時(shí)侵染效果最好[28]。本研究設(shè)置了不同的菌液濃度OD600值，結(jié)果表明OD600=1.0時(shí)侵染效果最好，這與董燕梅[21]侵染葡萄果實(shí)篩選的菌液濃度相一致。菌液濃度OD600為2.0時(shí)，無(wú)法使基因沉默，可能是由于高濃度的菌液損害牡丹植株細(xì)胞，使其無(wú)法得到有效沉默。本研究構(gòu)建的鑒定牡丹授粉受精基因的VIGS沉默，為實(shí)現(xiàn)牡丹MYB轉(zhuǎn)錄因子基因功能研究，為解析牡丹雌雄蕊發(fā)育、授粉受精和結(jié)實(shí)方面的基因功能驗(yàn)證提供了技術(shù)支持。