血清miR-23a表達(dá)水平與急性腦梗死患者預(yù)后的相關(guān)性

王 鑫，薛 莉，崔長(zhǎng)富，燕 飛，張 妮，李轉(zhuǎn)會(huì)

(中國(guó)兵器工業(yè)五二一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,西安 710065)

老年人易患多種腦血管疾病，隨著我國(guó)老齡化人口的不斷增加，這些疾病的發(fā)病率逐漸上升，尤其是急性腦梗死[1]。急性腦梗死的發(fā)生主要是由于一系列血液循環(huán)障礙，導(dǎo)致腦缺血壞死或腦組織軟化[2-3]。急性腦梗死的發(fā)病率很高，發(fā)病后若不及時(shí)有效治療，病情發(fā)展迅速，病死率較高[4]。雖然CT和MRI對(duì)急性腦梗死有較高的診斷價(jià)值，但應(yīng)用血清學(xué)指標(biāo)仍是預(yù)測(cè)和診斷急性腦梗死的理想方法[5]。 MicroRNA(miR)是一類小的非編碼RNA，其主要功能是調(diào)節(jié)基因表達(dá)，幾乎參與了器官形成、造血、細(xì)胞增殖和凋亡、腫瘤等所有生物過程[5-6]。miR在心血管疾病的病理生理調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，其與腦缺血再灌注損傷有關(guān)，也與神經(jīng)元細(xì)胞凋亡有關(guān)[7]。因此，血清中miR可能作為急性腦梗死的生物標(biāo)志物。研究發(fā)現(xiàn)了一些腦特異性的miR，通過比較胚胎神經(jīng)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)中的表達(dá)，miR-23被證實(shí)具有星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性[8]。有研究[9]表明，miR-23a能減輕大腦中動(dòng)脈缺血再灌注損傷大鼠的氧化應(yīng)激反應(yīng)。本研究收集本院臨床患者的資料觀察急性腦梗死患者血清中miR-23a的表達(dá)及其與病情嚴(yán)重程度的關(guān)系，探討其對(duì)3個(gè)月預(yù)后的相關(guān)性，為急性腦梗死的診斷和治療提供新的靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年1月至2020年1月期間中國(guó)兵器工業(yè)五二一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院的急性腦梗死患者160例作為研究組，收集同期于本院進(jìn)行健康體檢的非腦梗死患者120例為對(duì)照組。研究組納入標(biāo)準(zhǔn)：1)急性腦梗死患者均符合《中國(guó)急性缺血性腦卒中診治指南2018》中關(guān)于急性腦梗死的診斷標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)頭顱MRI或頭部CT檢查確診；2)首次發(fā)病，發(fā)病時(shí)間不超過72 h；3)患者年齡不小于18歲；4)無嚴(yán)重心肺肝腎功能不全者；5)自愿參加本研究并簽署知情同意書。非腦梗死對(duì)照組患者經(jīng)頭顱MRI或頭部CT檢查排除急性腦梗死灶和陳舊性梗死灶。所有研究對(duì)象的排除標(biāo)準(zhǔn)：1)既往有急性腦梗死病史或外傷性急性腦梗死患者；2)有精神疾病患者；3)惡性腫瘤或自身免疫性疾病患者；4)有認(rèn)知障礙者(蒙特利爾認(rèn)知量表對(duì)患者的認(rèn)知功能進(jìn)行評(píng)估,若患者的受教育年限≤12年則加1分,評(píng)分≥26分為正常,若評(píng)分<26分為障礙)；5)臨床資料不完整患者。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有納入研究的患者均簽署知情同意書。

1.2 miR-23a的測(cè)定

住院患者入院后第2天清晨空腹抽取肘靜脈血約4 mL，立即用離心機(jī)3500 r·min-1離心15 min，吸取上清液置于-20 ℃冰箱保存。所有標(biāo)本收集完畢后，向200 μL上清液中加入1 mL Trizol裂解液室溫裂解5 min。然后加入200 μL氯仿，室溫放置15 min，用超速低溫離心機(jī)12 000 r·min-1，4 ℃離心15 min。吸取上層水相加入等體積異丙醇，過夜沉淀。離心機(jī)12 000 r·min-1，4 ℃離心10 min，倒掉上清，用1 mL 75%乙醇(DEPC水配制)洗滌沉淀，8000 r·min-1，4 ℃離心5 min，重復(fù)操作2次，晾干沉淀。用適量DEPC處理的水溶解RNA。用Nanodrop2000測(cè)定總RNA 濃度。然后使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒( 購(gòu)于TAKARA中國(guó)公司) 將總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到模板單鏈cDNA。然后使用 qPCR試劑盒(購(gòu)自東洋紡生物科技有限公司)對(duì)cDNA 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。miR-23a引物F:CCGCCGGGATCCACGGCGGGCTGGGGTTCC。R:CCGCCGAAGCTTCAGAGCTCAGGGTCGGTTGG；用U6作內(nèi)參，U6引物F:GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT。R：CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT。按照TOYOBO One-step RT-PCR 試劑盒說明書配制10 μL體系，反應(yīng)條件：90 ℃ 30 s →60 ℃ 30 min →94 ℃ 1 min→(94 ℃ 30 s → 60 ℃ 30 s → 72 ℃ 1 min)×40循環(huán)→72 ℃ 1 min，收集熒光信號(hào)。每個(gè)樣品做3個(gè)平行孔。mRNA的表達(dá)量采用2-△△CT表示，其中△CT=(miR-23a平均CT)-(U6平均CT)，△△CT為(研究組miR-23a的△CT)-(對(duì)照組miR-23a△CT)，CT值為熒光信號(hào)在每個(gè)PCR管內(nèi)到達(dá)設(shè)定閾值的循環(huán)數(shù)。

1.3 觀察指標(biāo)

收集所有入組患者的臨床資料，包括年齡、性別、吸煙史、飲酒史、疾病史(高血壓、高脂血癥、糖尿病、房顫史)等。入院治療48 h后根據(jù)美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院卒中量表(NIHSS評(píng)分)進(jìn)行入院評(píng)分[10]?；颊叱鲈汉?個(gè)月采取電話或者門診復(fù)診方式回訪，根據(jù)改良Rankin量表進(jìn)行評(píng)分，mRS≤2分為預(yù)后良好，mRS>2分為預(yù)后不良[11]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)均采用SPSS23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)。定性資料采用χ2檢驗(yàn)。采用多因素logistic回歸分析預(yù)后的影響因素；采用ROC曲線下面積(AUC)評(píng)估血清miR-23a對(duì)腦梗死預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值，計(jì)算約登指數(shù)確定最佳截?cái)嘀?。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料

對(duì)照組和研究組年齡、性別、吸煙史、飲酒史和糖尿病、房顫患病史均無明顯差異(P>0.05)。研究組高血壓、高脂血癥患病史和NIHSS評(píng)分均升高，血清miR-23a表達(dá)水平低于對(duì)照組(P<0.05)。見表1。

表1 對(duì)照組和研究組臨床資料比較 n,%

2.2 腦梗死嚴(yán)重程度與miR-23a表達(dá)的相關(guān)性

將NIHSS評(píng)分和腦梗死患者血清中miR-23a的表達(dá)水平進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，腦梗死患者血清中miR-23a表達(dá)水平與NIHSS評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(r=-0.52，P=0.037)。

2.3 腦梗死患者預(yù)后的影響因素

對(duì)出院3個(gè)月的患者進(jìn)行電話隨訪，其中有13例患者沒有隨訪成功。其余147例根據(jù)改良Rankin量表進(jìn)行評(píng)分，預(yù)后不良組(n=63)高血壓、高脂血癥、房顫史和NIHSS評(píng)分均高于預(yù)后良好組(n=84)，血清miR-23a表達(dá)水平低于預(yù)后良好組(P<0.05)，其余因素比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

2.4 影響急性腦梗死患者3個(gè)月預(yù)后因素的多因素Logistic回歸分析

對(duì)表2中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的影響因素進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，入院NIHSS評(píng)分是急性腦梗死預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(OR=6.526，P<0.05)，血清miR-23a是急性腦梗死預(yù)后的保護(hù)因素(OR=6.884，P<0.05)。見表3。

表2 預(yù)后良好組和預(yù)后不良組預(yù)后因素的比較 n,%

表3 急性腦梗死患者3個(gè)月預(yù)后相關(guān)因素Logistic回歸分析

2.5 NIHSS評(píng)分和血清中miR-23a對(duì)腦梗死預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值

NIHSS評(píng)分和血清中miR-23a的表達(dá)水平對(duì)腦梗死預(yù)后預(yù)測(cè)均具有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值，兩個(gè)指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)預(yù)測(cè)腦梗死預(yù)后具有較高價(jià)值，ROC曲線下面積AUC為0.963(95%CI：0.924～0.985)，靈敏度和特異性分別為90.48%和91.67%，準(zhǔn)確性為91.16%。見表4和圖1。

表4 NIHSS評(píng)分和血清中miR-23a對(duì)腦梗死的預(yù)測(cè)價(jià)值

圖1 NIHSS評(píng)分和血清中miR-23a預(yù)測(cè)腦梗死預(yù)后的ROC曲線

3 討論

大部分急性腦梗死始于腦血流中斷，導(dǎo)致氧和葡萄糖供應(yīng)嚴(yán)重受限，引發(fā)興奮性毒性、鈣失調(diào)、氧化應(yīng)激和炎癥等一系列病理反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和組織壞亡[12-13]。氧化應(yīng)激與活性氧的不斷增加有關(guān)，嚴(yán)重影響腦缺血/再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制[14]。非編碼RNA是一類遺傳、表觀遺傳學(xué)和翻譯調(diào)控因子，由microRNAs(miRNAs)、長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs,lncRNAs)和環(huán)狀RNA(circRNAs)組成，它們通過控制轉(zhuǎn)錄和翻譯發(fā)揮著重要的生理和病理作用[15-16]。miRNA是長(zhǎng)度為21～25個(gè)核苷酸的小分子，是一種豐富且進(jìn)化保守的內(nèi)源性lncRNA。它們通過不完全或接近完美的堿基配對(duì)抑制和降解各自的mRNA，主要是在目標(biāo)mRNA的3′未翻譯區(qū)(UTR)[17-18]。多種miRNA(miR-146a、miR-155、miR-9、miR-23a、miR-424等)在腦缺血性卒中的診斷、預(yù)后預(yù)測(cè)中的作用已經(jīng)被報(bào)道[19]，miRNAs作為疾病的生物標(biāo)記被廣泛研究。過表達(dá)miR-23a通過抑制凋亡蛋白酶激活因子1(Apaf-1)表達(dá)減輕神經(jīng)元凋亡，miR-23a可以抑制多種細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞活性并減少腦梗死面積[20]。本研究結(jié)果亦顯示，與對(duì)照組相比，急性腦梗死患者除了高血壓、高脂血癥患病史比例和NIHSS評(píng)分升高以外，血清miR-23a表達(dá)水平降低。

NIHSS可以在急性腦梗死早期對(duì)患者病情進(jìn)行評(píng)估，通常入院治療24 h后至5～7 d均可進(jìn)行評(píng)估[21]。根據(jù)NIHSS評(píng)分對(duì)患者病情嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)分。本研究中Spearman分析結(jié)果表明NIHSS評(píng)分與血清miR-23a表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.64，P=0.041)。提示血清miR-23a表達(dá)水平對(duì)急性腦梗死嚴(yán)重程度有重要的提示意義。miR-23a在不同類型的細(xì)胞(包括間充質(zhì)干細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成骨細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞)中起抗凋亡和促生長(zhǎng)因子的作用。凋亡相關(guān)基因caspase-7、caspase-3、Fas、IRF1、Apaf-1被證實(shí)為其靶基因[9]。本研究結(jié)果顯示，急性腦梗死預(yù)后不良組血清中miR-23a表達(dá)水平低于預(yù)后良好組，腦梗死會(huì)造成神經(jīng)元損傷，miR-23a作為抗凋亡因子對(duì)神經(jīng)元起了保護(hù)作用。預(yù)后不良組外周血miR-23a表達(dá)較預(yù)后良好組明顯降低，提示miR-23a可能參與了急性腦梗死的病理過程。

腦梗死預(yù)后不良組和預(yù)后良好組的高血壓、高脂血癥和房顫病史也有差異。進(jìn)一步用Logistic回歸分析驗(yàn)證與急性腦梗死患者預(yù)后密切相關(guān)的因素。結(jié)果表明，入院血清miR-23a表達(dá)水平和NIHSS評(píng)分與急性腦梗死患者預(yù)后存在密切相關(guān)關(guān)系。NIHSS評(píng)分反映腦梗死的嚴(yán)重程度，腦梗死程度越嚴(yán)重患者預(yù)后越差，血清中miR-23a表達(dá)水平越高，患者預(yù)后越好，表明miR-23a對(duì)腦梗死預(yù)后起神經(jīng)保護(hù)作用。本研究擬采用ROC曲線評(píng)估血清miR-23a和NIHSS評(píng)分對(duì)腦梗死預(yù)后情況的預(yù)測(cè)價(jià)值，發(fā)現(xiàn)上述兩指標(biāo)均能有效預(yù)測(cè)腦梗死發(fā)生，并且聯(lián)合檢測(cè)的預(yù)測(cè)價(jià)值最高，ROC曲線下面積AUC可達(dá)0.963，靈敏度、特異性分別為90.48%、91.67%，準(zhǔn)確性為91.16%，建議臨床定期監(jiān)測(cè)急性腦梗死患者血清miR-23a和NIHSS評(píng)分，從而為制定早期干預(yù)措施改善患者預(yù)后提供指導(dǎo)。

綜上所述，急性腦梗死預(yù)后不良的患者血清中miR-23a表達(dá)水平較預(yù)后良好者降低，miR-23a表達(dá)水平與急性腦梗死嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)，NIHSS評(píng)分和血清miR-23a對(duì)腦梗死預(yù)后均具有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值，兩者聯(lián)合檢測(cè)對(duì)腦梗死患者預(yù)后有一定指導(dǎo)意義。