軍團菌致病性檢測方法研究進展

王艷晴，任紅宇，趙 娜，陳海嬰，劉明斌1,，秦 天

(1.南昌大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，江西省預(yù)防醫(yī)學(xué)重點實驗室，南昌 330006； 2.中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所呼吸道傳染病室，傳染病預(yù)防控制所國家重點實驗室，北京 102206； 3.南昌市疾病預(yù)防控制中心，南昌 330038)

軍團菌病(Legionnaires’ disease，LD)于1976年在費城的一次軍事集會上首次大規(guī)模暴發(fā)，并導(dǎo)致34人死亡[1]。此后，在社區(qū)、醫(yī)院和旅行相關(guān)中出現(xiàn)了軍團菌病的暴發(fā)或零星傳播[2]。軍團菌是兼性胞內(nèi)革蘭陰性桿菌，廣泛存在于水、土壤、人工水系統(tǒng)等環(huán)境中，且以在人工水環(huán)境居多[3]。軍團菌主要存在于冷水中，但近年來熱水系統(tǒng)分離出軍團菌也常有報道[4]。嗜肺軍團菌(legionella pneumophila,LP)，是引起軍團菌病的主要軍團菌種，對環(huán)境中軍團菌監(jiān)測并有效檢測其致病能力強弱對保障公眾健康、減少損失具有重要意義。

1 軍團菌的致病機制

軍團菌能夠在多種吞噬宿主中復(fù)制，包括許多變形蟲物種到哺乳動物細胞，形成一個獨特的膜結(jié)合復(fù)制生態(tài)位，稱為含軍團菌液泡(Legionella-containing vacuole，LCV)[5]。這種復(fù)雜的細胞內(nèi)隔室使軍團菌能夠逃避吞噬體的降解、躲避細胞內(nèi)防御并截獲營養(yǎng)物質(zhì)以支持復(fù)制。為了做到這些，軍團菌采用不同的分泌系統(tǒng)，通過一個或兩個細胞膜將毒力相關(guān)蛋白傳遞到作用部位。而2型分泌系統(tǒng)(PilD-dependent Lsp型)和4B型分泌系統(tǒng)(Dot/Icm型)由所有軍團菌菌株編碼，1型分泌系統(tǒng)(Lss型)僅限于嗜肺軍團菌，4A型分泌系統(tǒng)(Lvh型)隨機分布在不同物種之間[6]。各型分泌系統(tǒng)代表軍團菌的關(guān)鍵毒力并在嗜肺軍團菌的生態(tài)和發(fā)病機制中起關(guān)鍵作用[7]。

2 軍團菌致病性檢測方法

2.1 分子生物學(xué)方法

2.1.1 聚合酶鏈式反應(yīng)

嗜肺軍團菌中存在多種毒力基因，包括mip(macrophage infectivity potentiator)、ira(iron acquisition and assimilation)、lvr(Legionella virregion)、ot(defective organelle trafficking gene)、icm(intracellular multiplication gene)、lvh(legionella vir homologues)、cpx(conjugative pilus expression)、rtxA(repeats in structural toxin)。Mip編碼蛋白可以抵抗針對哺乳動物和原生動物吞噬細胞的細胞內(nèi)殺傷[8]；cpxRA調(diào)控ⅣB型分泌系統(tǒng)分泌效應(yīng)蛋白必不可少的因素[9]；iraA基因座編碼的甲基轉(zhuǎn)移酶是細菌胞內(nèi)感染所必需的；iraB基因座編碼的假設(shè)鐵-肽轉(zhuǎn)運蛋白可利用鐵負載肽的方法參與菌體對高價鐵的攝取[10]；lvr基因負責(zé)調(diào)控lvh家族分泌蛋白[11]；rtxA編碼與黏附、細胞毒性和孔隙形成相關(guān)的蛋白質(zhì)。Lvh編碼ⅣA型分泌系統(tǒng)衍生蛋白質(zhì)，有助于結(jié)合毒力[12]；dot/icm編碼ⅣB型分泌系統(tǒng)衍生蛋白質(zhì),負責(zé)軍團菌在宿主細胞內(nèi)復(fù)制[13]。毒力基因是DNA的不同區(qū)域，存在于致病菌的基因組中，在相同或相關(guān)的非致病性菌株中不存在。軍團菌的致病性與毒力密切相關(guān)，根據(jù)病原體毒力基因擴增結(jié)果，判定其致病性大小[14]。聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)是一種用于放大擴增目標核苷酸序列的分子生物學(xué)技術(shù)，2～3 h就能將待擴增目的基因擴增幾百萬倍。反應(yīng)結(jié)束后，將擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，結(jié)果為陽性，即確定該基因的存在。模版核酸提取質(zhì)量不高，會出現(xiàn)假陰性結(jié)果[15]，但該方法特異性強、靈敏度高,是其他分子生物學(xué)實驗的基礎(chǔ)。軍團菌毒力PCR檢測只能在有限數(shù)量的實驗室使用，實驗室使用各種內(nèi)部分析方法[16]。HWANG等[17]成功研究出針對dot/icm、lvh和rtxA3個毒力位點的PCR方法；ZHAN等[18]使用47株參考菌株、235株環(huán)境株和4株臨床株并使用針對iraA、iraB、lvrA、lvrB、lvhD、cpxR、cpxA、dotA、icmC和icmD,研究結(jié)果說明了毒力基因與軍團菌致病性的關(guān)聯(lián)。

2.1.2 多位點可變數(shù)串聯(lián)重復(fù)分析檢測毒力基因型

多位點可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析(multiple Locus Variable-number tandem repeat analysis,MLVA)是一個基于PCR技術(shù)的分型方法，該方法通過區(qū)分基因組上多個具有多態(tài)性串聯(lián)重復(fù)序列位點的重復(fù)數(shù)來區(qū)分菌株。此方法分辨率高、重復(fù)性好、快速，結(jié)果可用于不同實驗比較。有報道[19]表明，由MLVA-8(使用8個基因座的多基因座可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)分析)分析表明特定基因型與毒力有關(guān)。SHARABY等[20]確定不同的MLVA-8基因型對61例環(huán)境和12例臨床嗜肺軍團菌分析，得出Gt4菌株對巨噬細胞顯示出更高的細胞毒性，并將Gt4菌株視為評估軍團菌在飲用水中公共健康風(fēng)險的主要因素。SHARABY等[21]對93株嗜肺軍團菌環(huán)境株和12株臨床株使用MLVA-8基因分型分析其對常用10種抗菌藥物的敏感性，發(fā)現(xiàn)Gt4菌株的耐藥性更強。

2.1.3 微型DNA微陣列檢測軍團菌毒力基因

DNA微陣列由成千上萬的DNA序列組成，每一個都代表一個特定的基因以網(wǎng)格方式貼在玻璃顯微鏡載玻片上，運用互補核酸雜交的原理，熒光素標記的核酸樣品與陣列互補DNA序列雜交，用激光共聚焦顯微鏡測量固定化靶DNA的熒光強度，用特定波長的激發(fā)和發(fā)射濾光片獲得熒光圖像，同時監(jiān)測成千上萬個基因的功能，與普通PCR相比成本更低，耗時更少，且樣品不易受到污染，缺點是僅局限于預(yù)設(shè)好的目標基因的檢測，覆蓋范圍較少。ZAK等[22]運用此技術(shù)開發(fā)出一種微型DNA芯片，用于鑒定軍團菌的66個毒力基因，確定菌株的毒力潛力有助于選擇最有效的干預(yù)措施。

2.1.4 利用遺傳標記物鑒別軍團菌臨床與環(huán)境株

DEN BOER等[23]利用軍團菌菌株的微陣列數(shù)據(jù)，使用隨機森林算法與邏輯回歸相結(jié)合分析，該模型得出4種DNA標記物區(qū)分臨床和環(huán)境菌株。它們可以正確預(yù)測荷蘭國家軍團菌爆發(fā)檢測計劃中收集到的96%的臨床菌株和66%的環(huán)境菌株。

2.1.5 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜檢測軍團菌的特異基因

基質(zhì)輔助激光解吸電離(matrix-assisted laser desorption ionization，MALDI)技術(shù)和飛行時間質(zhì)譜(time of flight mass spectrometry，TOF-MS)是通過激光照射使樣品分子電離，從固相標本中產(chǎn)生離子，并在飛行管中測其分子量。通過分析菌株的核糖體蛋白，在物種水平上鑒定微生物，構(gòu)成了一種易于使用、快速、準確和經(jīng)濟高效的菌種鑒定方法。最近，KYRITSI等[24]用此技術(shù)確定軍團菌lvh和rtxA基因座特異性峰值生物標志物，得出3個峰值作為lvh和rtxA基因座的潛在生物標志物：lvh的峰高為3 712 109 Da，檢測的靈敏度為82.5%，特異度為100.0%，準確率為84.1%；rtxA峰高為2 653.232 Da和3 598.706 Da，顯示100.0%的靈敏度、76.5%的特異度，準確率為97.4%，結(jié)果顯示MALDI-TOF-MS對2個毒力基因檢測的良好分辨力。

2.2 基于免疫學(xué)的檢測方法

2.2.1 酶聯(lián)免疫吸附

酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)是一種用于檢測和定量附著于固體表面的抗體或抗原的簡單快速的技術(shù)。添加酶的底物產(chǎn)生與原始樣品中存在的抗原量相關(guān)的顏色變化或光信號，根據(jù)顏色深淺或化學(xué)信號強弱和樣本中的抗原量呈正比的關(guān)系，計算出樣本中的抗原總量或濃度。此種方法操作簡單、靈敏度高；但對技術(shù)人員操作要求高，因為使用的是重組抗原，特異度不高容易產(chǎn)生假陽性結(jié)果。嗜肺軍團菌的發(fā)病機制的關(guān)鍵特征是嗜中性粒細胞迅速流入肺，IL-1α是嗜中性粒細胞募集到嗜肺軍團菌感染小鼠肺部的關(guān)鍵引發(fā)劑。BARRY等[25]利用此技術(shù)檢測被嗜肺軍團菌感染的小鼠釋放的IL-1α的量，發(fā)現(xiàn)嗜中性粒細胞募集是對強毒嗜肺軍團菌的反應(yīng)，確定IL-1α的釋放量與菌株毒力呈正相關(guān)。

2.2.2 蛋白質(zhì)印記

免疫印跡(immunoblotting)即蛋白質(zhì)印跡(western blotting)，是根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合蛋白的方法。將混合抗原樣品在凝膠板上進行單向或雙向電泳分離,在印跡紙的自然吸附力或其他外力作用下,使凝膠中抗原組份轉(zhuǎn)移到印跡紙上,然后將固定化基質(zhì)膜與凝膠相貼。經(jīng)底物顯色和放射自顯影經(jīng)底物顯色以及放射自顯影對抗原固定化基質(zhì)膜進行檢測和分析。免疫印跡的分析操作簡單，省時、省力，可同時鑒定多種蛋白。鞭毛及其分泌的蛋白有助于嗜肺軍團菌的運動、尋找宿主、生物膜定植和毒力[26]。CHEN等[27]利用此技術(shù)鑒定PAL、PilE、FlaA蛋白和PAL/PilE/FlaA融合蛋白在293細胞中的表達，成功開發(fā)了一種重組肽聚糖相關(guān)脂蛋白(PAL)/IV型菌毛蛋白(PilE)/flagellin(FlaA)DNA疫苗。

2.2.3 雙熒光素酶報告基因檢測

雙熒光素酶報告基因檢測(dual-luciferase reporter assay，DR)是檢測轉(zhuǎn)錄因子和其靶啟動子中的特異性結(jié)合的重要手段。將要檢測的轉(zhuǎn)錄因子表達質(zhì)粒與報告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至相關(guān)的細胞系，加入熒光素酶底物產(chǎn)生熒光，如果轉(zhuǎn)錄因子激活靶啟動子則熒光素酶基因表達，通過檢測熒光強度判斷轉(zhuǎn)錄因子與靶啟動子片段的結(jié)合作用。NF-κB蛋白是轉(zhuǎn)錄因子家族，NF-κB通過控制大量基因的表達，在哺乳動物的天然免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、細胞生長和存活以及增殖中至關(guān)重要[28]。NF-κB蛋白由5個不同的相關(guān)家族成員組成，RelA、RelB和RelC用于調(diào)節(jié)基因表達；前體蛋白p100和p105抑制DNA結(jié)合。傳統(tǒng)的NF-κB途徑主要通過促炎性受體(如TNF受體超家族、Toll-Like受體家族)和白介素的細胞因子受體的激活而被激活。WANG等[29]研究不同嗜肺軍團菌在小鼠模型中的毒力與其在體外激活NF-κB信號通路的能力之間的關(guān)系,將NF-κB報告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK 293T細胞，再用嗜肺軍團菌感染HEK293T細胞，使用Promega公司的雙熒光素酶報告系統(tǒng)試劑盒分析不同菌株激活NF-κB 的能力，激活NF-κB能力強的嗜肺軍團菌誘導(dǎo)A/J小鼠血清和肺組織細胞因子與趨化因子檢出率更高，小鼠死亡率更高，由此得出軍團菌體外誘導(dǎo)NF-κB的能力與其毒力成正相關(guān)。

2.3 LDH細胞毒性檢測試驗

乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)是一種穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，存在于正常細胞的細胞質(zhì)中。當細胞膜被破壞，LDH就會被釋放到細胞外。LDH細胞毒性與其引起的動物死亡率及人體死亡的血藥濃度之間都存在良好的相關(guān)性，病原體對人體的損傷和死亡，最終可表現(xiàn)為細胞水平上的改變。LDH細胞毒性檢測有商品化試劑盒，根據(jù)500 nm酶標儀檢測細胞上清中LDH的活性，判斷細胞受損的程度。KORIYAMA等[30]也利用此方法對軍團菌的毒性進行了檢測，并確定MOI(multiplicity of infection)<10時，宿主細胞的損傷程度較低；LDH含量也是區(qū)別軍團菌肺炎與其他社區(qū)獲得性肺炎(community-acquired pneumonia，CAP)的指標之一[31]。此分析方法靈敏、操作簡單、結(jié)果準確；但細胞毒性的評估是基于細胞損傷來定量的，所以要確定最佳細胞用量。

2.4 表面增強拉曼光譜法快速鑒定軍團菌毒力

拉曼光譜(Raman spectroscopy，RS)屬于分子振動光譜,不同的波段對應(yīng)于不同官能團的振動頻率，根據(jù)分子的化學(xué)鍵及其特定的振動頻率，每個分子都有一個獨特的光譜，稱之為“指紋”，因此，拉曼光譜能提供分析物分子的豐富信息。拉曼光譜技術(shù)提供了無標記和非破壞性評估人體中細胞和組織功能的能力。然而，傳統(tǒng)拉曼光譜技術(shù)存在信號強度低、熒光干擾強等缺點，應(yīng)用比較受限。據(jù)ZHAO等[32]報道吸附在粗糙化處理的銀表面上的吡啶分子產(chǎn)生的拉曼光譜信號將比溶液中同數(shù)量吡啶的拉曼信號增強，最高可達到1014數(shù)量級。這種增強效應(yīng)與特殊介質(zhì)的粗糙表面相關(guān)，其對應(yīng)的光譜技術(shù)稱為表面增強拉曼光譜(surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS)技術(shù)。常用的介質(zhì)包括銀、金、銅等。在不使用樣本標簽的情況下，研究人員能夠在30 min內(nèi)獲得準確的檢測結(jié)果[33]。SERS的應(yīng)用在很大程度上提高了病原體檢測的靈敏度和特異度，大大縮短了檢測所需的時間[34]。與傳統(tǒng)的拉曼光譜技術(shù)相比，SERS光譜帶窄，光譜峰分辨率高，因此有效減少了熒光背景干擾[35]。LI等[36]采用532 nm激光對軍團菌產(chǎn)生的拉曼光譜進行分析：最大峰高差異>4000，代表被測軍團菌的毒力因子水平高，具有較強致病性；相對應(yīng)的，最大峰差異<2000，則代表被測樣品致病性弱。

2.5 細胞模型檢測軍團菌致病性

軍團菌廣泛存在于天然和人造水系統(tǒng)中。被軍團菌污染的水在空氣中以氣溶膠的形式存在，通過呼吸道被吸入人體，它主要感染巨噬細胞和肺上皮細胞，并在其中繁殖，導(dǎo)致可能致命的社區(qū)或醫(yī)院獲得性肺炎。有許多關(guān)于嗜肺軍團菌的細胞侵襲和胞內(nèi)增殖的報道[37-39]，包括原生動物、人支氣管上皮樣細胞系(16HBE、BEAS-2B)、吞噬細胞(包括人巨噬細胞樣細胞系(U937、THP-1、HL60、MM6)、鼠類巨噬細胞樣細胞系(J774.1，Raw264.7))、人肺癌細胞系(A549)、中國倉鼠卵巢細胞(CHO-K1)、乳腺癌細胞系(MCF-7和MDA-MB-231)等被用于研究軍團菌進入細胞并在細胞內(nèi)生存、繁殖的過程；軍團菌有毒株能夠在細胞內(nèi)繁殖并將它們殺死，而無毒株既不能在其中繁殖也不能殺死細胞。嗜肺軍團菌與特定宿主細胞之間的相互作用具有一些獨征，細胞侵襲機制和細胞內(nèi)生活方式在一些細胞系中已被描述[40]。軍團菌對巨噬細胞樣細胞系的黏附和侵襲能力高于非吞噬細胞系,在不同細胞系的增殖能力相似；THP-1人巨噬細胞樣單核細胞系和A.阿米巴被廣泛用作研究軍團菌的毒力的細胞模型[41]。有研究[42]表明，使用非吞噬宿主模型(例如HeLa和L929)可以使細菌內(nèi)化。QIN等[1]使用J774細胞模型研究基于最小核心基因組(MCG)分組各組的致病性，成功得出在9個MCG組中，8個顯示出高的細胞內(nèi)生長能力，而1個顯示出低的細胞內(nèi)生長能力，從而表明MCG分組在軍團菌致病性研究也有重要意義。細胞毒性的傳統(tǒng)測量方法依賴于終點分析，CHIARAVIGLIO等[43]開發(fā)了一種高通量實時測定法，以同時鑒定靶向細胞內(nèi)細菌病原體的真核細胞滲透性抗菌劑和評估真核細胞的細胞毒性。

2.6 動物模型檢測軍團菌致病性

有效的免疫反應(yīng)對人類感染的結(jié)果至關(guān)重要。動物模型在細菌發(fā)病機制和宿主反應(yīng)的體內(nèi)研究為發(fā)病機制提供了有用的手段，依據(jù)模型的體重變化、LD50、組織病理變化以及血清細胞因子的水平來初步評估病原體的致病性。豚鼠模型對嗜肺軍團菌極為敏感，因此為實驗性嗜肺軍團菌感染提供了一個有用的模型。然而，使用豚鼠進行的免疫學(xué)研究受到豚鼠特異性試劑可用性的限制。相比之下，小鼠特異性免疫試劑種類繁多，加上繁殖時間短、平均體積小，使得小鼠成為體內(nèi)實驗性嗜肺軍團菌感染的非常有吸引力的候選者。A/J小鼠由于lgn1位點突變而對軍團菌易感，因此它提供了軍團菌肺部感染的早期小鼠模型[44]。而C57BL/6的巨噬細胞幾乎不允許復(fù)制。A/J背景的小鼠不是最合適的模型，因為絕大多數(shù)可用于生物學(xué)研究的敲除小鼠是在C57BL/6或129背景中發(fā)現(xiàn)的[45]。但出于倫理和經(jīng)濟方面的考慮，阻礙了它們在軍團菌分離物或小分子抑制劑的高通量篩選研究中的應(yīng)用；大蠟螟幼蟲可從商業(yè)供應(yīng)商處大量獲得，無需專門設(shè)備即可進行維護，并可通過注射感染，可用于快速評估軍團分離株的毒力，但缺乏哺乳動物免疫系統(tǒng)的復(fù)雜性。

3 總結(jié)與展望

目前PCR方法已經(jīng)成為實驗室以及臨床軍團菌毒力分析的主要方法，其特異性強、靈敏度高的特點也使其成為其他分子生物實驗的重要基礎(chǔ)；MLVA就是基于PCR方法發(fā)展而來的高分辨率、可重復(fù)、快速的檢測方法；DNA微陣列成本低耗時短，但其覆蓋范圍少，可用于特定性毒力基因的快速檢測；遺傳標記物與MALDI-TOF-MS是實驗室的創(chuàng)新檢測方法；免疫學(xué)法影響因素少，可重復(fù)性高，但靈敏度相對不高，難免會出現(xiàn)假陽性結(jié)果；SERS是根據(jù)分子化學(xué)鍵的頻率分析物質(zhì)的毒力特性，靈敏度、特異性高，檢測時間短。然而，毒力基因的存在不一定能真實反映毒力功能的高低，需要進一步的分子生物學(xué)功能實驗來確認。細胞實驗與動物實驗分別是在細胞與生物層面對軍團菌的毒力進行檢測，雖然耗時長，但其是最準確的致病性評價方式。隨著社會與醫(yī)療科技的發(fā)展，在面對公共衛(wèi)生事件、實驗室檢測診斷等方面對細菌毒力檢測的需求也有新的需求。對環(huán)境中軍團菌的致病性強弱評估可為軍團菌風(fēng)險定量評估提供有價值的參數(shù)。